Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikation af Gradient Nanopattern af termisk Nanoimprinting teknik og Screening af svar i Endothelial kolonidannende celler

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57661
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 1
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for fabrikation af gradient nanopattern plader via termisk nanoimprinting og metoden til screening svar af menneskelige endotelceller stamceller til nanostrukturer. Ved hjælp af den beskrevne teknologi, er det muligt at producere et stillads, der kan manipuleres celle adfærd ved fysiske stimuli.

Abstract

Nanotopography kan findes i forskellige ekstracellulære matricer (ECMs) rundt i kroppen og er kendt for at have vigtige lovgivningsmæssige aktioner på cellulære reaktioner. Det er imidlertid vanskeligt at bestemme forholdet mellem størrelsen af en nanostrukturer og svar af celler på grund af manglen på ordentlig screening-værktøjer. Her viser vi udviklingen af reproducerbar og omkostningseffektiv gradient nanopattern plader til manipulation af cellulære svar. Ved hjælp af anodisk aluminiumoxid (AAO) som en master mold, gradient nanopattern plader med nanopillars af stigende diameter intervaller [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) og 280-360 nm (GP 280/360)] blev fremstillet af en termisk prægning teknik. Disse gradient nanopattern plader var designet til at efterligne de forskellige størrelser af nanotopography i ECM og blev anvendt til at screene svar af menneskelige endotel kolonidannende celler (hECFCs). I denne protokol beskrive vi den trinvise procedure af opdigte gradient nanopattern plader til celle teknikker, dyrke hECFCs fra humant perifert blod, og dyrkning af hECFCs på nanopattern plader.

Introduction

For nylig har været spotlighted reaktion af celler ved fysisk stimulering af overflade topografi inden for celle engineering1,2,3,4. Derfor, mere opmærksomhed været rettet på tre-dimensionelle nanostrukturer på celle vedhæftet fil overflade5. Det er blevet rapporteret, at Integra, som er enhedens overflade anerkendelse af cellen, sender den fysiske stimulus drevet af mikro-nano strukturer af ECM gennem mekanisk-transduktion6. Denne mekaniske stimulation regulerer celle adfærd gennem kontakt vejledning7 og inducerer cytoskeletal reorganisering til at ændre form, fokale sammenvoksninger og stivhed af celler8.

Menneskelige endotelceller stamceller (hEPCs) i kroppen interagere tæt med mikromiljø af omkringliggende ECM-9. Dette indikerer, at den fysiske tilstand af ECM fungerer som en vigtig parameter for specifikke celle-matrix vedhæftning kompleks dannelse som shear stress afledt af blod flow10. Det forlyder at overflade nanotopography forbedrer in vitro- dannelsen af omfattende kapillarrør netværk af hEPCs11 , og at en ECM/bio opløselige faktor kombineret system gør det muligt for hEPCs at genkende dysfunktionelle substrater og fremmer sår healing12,13. Ikke desto mindre, forholdet mellem ECM og hEPCs er ikke klart forstået.

Selv om mange forskere forsøgt at afklare forholdet mellem celle svar og fysiske signaler fra forskellige substrater14,15,16, disse undersøgelser bruges kun den faste størrelse med en nanostrukturer eller nanopatterns med irregulære ordninger, der har en begrænsning til at belyse forholdet mellem størrelsen af nanostrukturer og celle adfærd. Problemet her er mangel på egnede værktøjer til screening cellulære svar, der kan erstatte eksisterende kedelig og iterative fremgangsmåder for at finde den optimale størrelse af nanostrukturer. En enkel teknik er derfor påkrævet for screening celle reaktioner på fysisk stimulering uden gentagelse.

Her, beskriver vi en metode, der anvendes i vores tidligere rapporter17,18,19 til at producere en gradient nanopattern som diameteren af de arrangerede nanopillars gradvist øges. Derudover beskrevet vi også, hvordan man dyrker og analysere funktionen af hECFCs på gradient nanopattern plader til at bestemme virkningen af fysiske stimuli på cellerne. En mild anodization, gradvis ætsning og anti-stikning lag belægning metode blev brugt til at fabrikere gradient AAO skimmel. Ved at vedtage en termisk prægning litografi teknik, var identiske polystyren gradient nanopatterns produceres på en omkostningseffektiv og letkøbt måde. Ved hjælp af gradient nanopatterns, er det muligt at afgøre, hvilken størrelse af nanostrukturer har en stor effekt på celle opførsel i ét sæt af eksperiment. Vi forventer, at denne gradient nanopattern vil være nyttige i forståelse samspil mekanismer mellem blod-afledte hECFC eller andre celler og forskellige størrelser af nanostrukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af det institutionelle Review Board på Korea Anam Universitetshospital (IRB nr. ED170495). Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen med senere ændringer.

1. fremstilling af aluminium (Al) substrat af Electropolishing

Forsigtighed: Electropolishing løsning er ætsende og giftige. Bære personlige værnemidler, herunder nitrilhandsker, briller og lab coat. Udføre dette trin i et stinkskab.

  1. Forberede electropolishing løsning ved at blande ethyl alkohol (C2H5OH, 99,9%) og perchlorsyre (HClO4, 60%) i en 1 L dobbelt jakke bægerglas (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Tilsluttes en cirkulationspumpe dobbelt jakke bægerglas og Indstil temperaturen på 7 ° C. Sætte dobbelt jakke bægerglasset på en magnetomrører. Forlade løsning under omrøring i mindst 30 min., indtil temperaturen falder til 7 ° C.
  3. Fordyb ultrarent Al pladen (99,999%, 20 × 50 × 1 mm3) og kulstof counter elektrode til electropolishing løsning ved hjælp af krokodille klip og kobbertråd. Justere placeringen af Al plade og carbon counter elektroden står over for hinanden.
    Bemærk: Det er nødvendigt at installere klip forsigtigt for ikke at røre løsningen. Ved kontakt med løsningen, kan urenheder flyder ud fra klippene, der forurene Al plade.
  4. Tilsluttes den positive terminal, og kulstof counter elektrode til den negative terminal Al plade, af en jævnstrøm (DC) strømforsyning.
  5. Slukke Magnetpinden og anvende en spænding på 20 V. vedligeholde denne stat i 4 min.
  6. Drej på magnetomrørerpladen, og gøre det muligt løbende at flyde til en anden 6 min.
    Bemærk: Den statiske tilstand fjerner de fleste urenheder og ruhed fra Al plade, og den dynamiske tilstand forbedrer den endelige kvalitet af electropolishing.
  7. Slukke for strømforsyningen og manuelt adskille Al plade fra klippet. Grundigt vaske Al plade med deioniseret vand for at fjerne alle resterende løsning.
  8. Tørre Al plade med kvælstof og opbevares under anvendelse af inaktiv gas. Gennemføre denne tørringen i slutningen af alle eksperimenter i trin 1 og 2.
    Bemærk: Når indsprøjte trykluft, skal luftstrømmen fra den polerede del til den modsatte side. I modsat fald kan urenheder flygte fra den ikke-poleret del og forurene Al plade.

2. fabrikation af Gradient AAO mug med fosforsyre elektrolyt

Forsigtighed: Methyl alkohol og dens fume er okulær giftige. Vedvarende udsættelse for chrom kan føre til alvorlige chrom forgiftning. Udføre dette trin i et stinkskab.

  1. Primære anodization
    1. For at forberede 1 L af fosforsyre elektrolyt, indlæse 590 mL deioniseret vand i en glasflaske.
    2. Der tilsaettes 400 mL methylalkohol (CH3OH, 99%) og 10 mL phosphorsyre (H3PO4, 85%) ind i glasflaske. Bland opløsningen godt ved omrystning manuelt eller med magnetisk omrøring.
    3. Hæld 500 mL af elektrolytten i et 1 L dobbelt jakke bægerglas. Fordybe poleret Al plade og carbon counter elektroden i løsningen med krokodille klip og kobbertråd.
    4. Hæld ekstra elektrolyt for at finde grænsen for electropolishing 2-3 mm over overfladen af løsningen.
      Bemærk: Hvis anodization er udført med grænsen til electropolishing rørende løsningen, Al pladen har tendens til at brænde under anodization.
    5. Installere en lodret aksel på en U-form piedestal. Vedhæfte en overhead omrører, og løbehjulet ved hjælp af metal klemmer. Placer propeller af løbehjulet nær den nederste ende af begge elektroder. Indstil rotationshastighed overhead omrøreren mellem 200 og 300 rpm.
    6. Tilsluttes en cirkulationspumpe dobbelt jakke bægerglas og Indstil temperaturen på-10 ° C. Forlade system for mindst 1 h under omrøring indtil temperaturen falder til-10 ° C.
      Bemærk: Ikke brug vand som en kølervæsken. Fordi vandet fryser ved lave temperaturer, vil omsætning ikke arbejde normalt. Det anbefales at bruge en blanding af vand og ethanol i forholdet 1:1 som kølevæske.
    7. Anvende en spænding på 195 V under omrøring til 16 h.
      Bemærk: Hvis aktuelt stiger mere end 50 mA inden for 2 eller 3 timer efter påføring af spændingen, sandsynligheden for at brænde vil ske er meget høj. Straks stoppe processen og erstatte Al plade med en ny. Hvis problemet opstår igen, kontrollere, at der er ingen abnormitet i temperaturstyring af en cirkulationspumpe. Hvis der er ingen abnormitet, ændre elektrolytten.
    8. Stop strømforsyningen og manuelt adskille Al plade fra klippet. Vask anodiseret Al pladen med deioniseret vand for at fjerne alle resterende løsning.
  2. Alumina ætsning
    1. Forberede kromsyre ætsning løsning ved at opløse 9,0 g af chrom oxid (CrO3) og 20,3 mL phosphorsyre (H3PO4, 85%) i 500 mL deioniseret vand.
    2. Hæld ætsning løsning i 1 L dobbelt jakke bægerglas. Indstil temperaturen til 65 ° C.
    3. Fordyb anodiseret Al pladen i radering løsning for mindst 10 h under omrøring. Forsegle toppen af bægerglasset med aluminiumsfolie.
    4. Skyl ætset Al pladen flere gange med deioniseret vand.
  3. Sekundær anodization
    1. Angiv de samme forsøgsbetingelser som trin 2.1.1 til 2.1.7.
    2. Indlæse den ætsede Al plade til anoden af systemet og anvende en spænding på 195 V for 6 h. Derefter slukke for strømforsyningen og manuelt adskille Al plade fra klippet. Straks vaske anodiseret Al pladen med deioniseret vand.
      Bemærk: Når tidspunktet for vask er forsinket, øger porestørrelse af AAO utilsigtet på grund af de resterende fosforsyre.
  4. Gradient pore udvidelse
    1. Forberede en pore voksende løsning ved at opløse 5.765 g fosforsyre i 500 mL deioniseret vand. Hæld opløsningen i et 1 L dobbelt jakke bægerglas.
    2. Tilsluttes til cirkulationspumpe dobbelt jakke bægerglas og Indstil temperaturen på 30 ° C. Placer en lineær bevægelse fase lodret ved siden af bægerglasset. Tillægge den bevægelige del af lineær fase et beslag.
    3. Angiv den bevægelige del af lineær fase til udgangspositionen. Fastgøre klippet til beslaget og indlæse anodiseret Al pladen.
    4. Manipulere Al nummerpladens stilling manuelt, så Al plade vil komme lige over overfladen af løsningen.
      Bemærk: I dette trin, skal Al pladen ikke røre løsningen. Pore udvidelse processen begynder så snart Al plade når løsningen.
    5. Gradvist fordybe Al plade oploesningen med en hastighed på 4.86 µm/s for 120 min at lave en 35 mm AAO mug med en størrelse gradient fra 120 nm til 200 nm (GP 120/200). Start et stopur i øjeblikket Al plade rører overfladen af løsningen.
    6. For at gøre GP 200/280 og GP 280/360 forme, fordybe hele området af GP 120/200 mug i pore udvidelse løsning for 2 eller 4 h, henholdsvis.
    7. Skyl gradient Al pladen flere gange med deioniseret vand.

3. aflejring af anti-stikning lag på Gradient AAO mug med selvsamlede éncellelag

Bemærk: Udfør trin 3.2.1 til 3.3.3 i et handskerum. Tilslut en vakuumpumpe og tør nitrogen gas injektor til handskerummet. Placere alle prøver, reagenser og apparater i handskerummet før affugtning proces. Gentag evakuering og nitrogen gas injektion cyklussen mere end tre gange tilstrækkeligt fjerne fugt fra handskerummet. Lad det tørre kvælstof flow gennem forsøget.

  1. Hydroxyl ændring af AAO mug med Piranha behandling
    1. Hæld 140 mL svovlsyre (H2SO4, 95%) i et polytetrafluorethylen (PTFE) bægerglas. Tilføje 60 mL hydrogenperoxid dråbevis (H2O2, 30%). Lad det i 30 min, indtil løsningen er afkølet.
      Forsigtighed: Være yderst forsigtige, når de foretager Piranha løsning. Fra øjeblikket for at tilføje hydrogenperoxid, løsningen energisk koger og genererer høje temperaturer. Udføre eksperimentet i et stinkskab.
    2. Fordyb AAO mug i løsning til 30 s ved hjælp af en nonmetallic pincet.
    3. Skyl AAO skimmel flere gange med deioniseret vand. Soak mug i ionbyttet vand i 30 min og sætte det i methyl alkohol i en anden 30 min.
      Forsigtighed: Når de skiller den anvendte Piranha løsning, fortyndes løsning med en rigelige mængder af vand fra hanen.
    4. Helt tørre AAO skimmel under vakuum til 3 h.
  2. Forberedelse af 20 × HDFS stamopløsning
    Bemærk: HDFS er en forkortelse af (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-silan
    1. Fyld en tredjedel af en 1 L n-hexan flaske med molekylær sigter. Forsegle flaske med paraffin film og gemme det under tør nitrogen i 24 timer.
    2. Filtrere 200 mL n-hexan ved hjælp af et glas sprøjte og 0,2 µm PTFE sprøjte filter.
    3. Hæld 80 mL filtreret n-hexan i en 100 mL glasflaske. Der tilsættes 2 mL HDFS.
  3. Selvsamlede éncellelag aflejring
    1. Indlæse 57 mL filtreret n-hexan i et 100 mL bægerglas. Fordybe AAO mug i opløsningsmidlet.
    2. Tilføj 3 mL af HDFS stamopløsning til n-hexan at gøre 2,9 mM HDFS løsning. Vente 10 min for reaktion til at fortsætte.
    3. Overføre AAO skimmel til friske n-hexan. Lukke og forsegle alle reagensflaskerne. Lukke kvælstof ventilen, så trække ud prøver fra handskerummet.
      Bemærk: HDFS er yderst følsom over for fugt. Gemme alle reagenser, der indeholder HDFS i en ekssikkator.
    4. Sættetid AAO mug i 60 mL af methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Ultralyd Rens AAO mug i et bægerglas til 10 s pr én gang for at fjerne fysisk adsorberet HDFS molekyler. Gentag proceduren for rengøring 10 gange.
      Bemærk: Udsætter AAO skimmel til ultralyd i lang tid uden mellemrum vil skade oxidlaget.
    5. Helt tørre AAO skimmel under vakuum i 24 timer.
      Bemærk: Et succesfuldt deponerede anti-stikning lag er super vandafvisende og stabil i måneder, når den opbevares i en ekssikkator. Protokollen kan være midlertidigt her.

4. fabrikation af Gradient Nanopattern plader af termisk prægning

Bemærk: Udfør trin 4.2 til 4.7 i et rent værelse.

  1. Skære en 1,1 mm tyk polystyren plader til en størrelse på 2,9 mm bred ved 3,7 mm lang, ved hjælp af et trykt kredsløb bestyrelsen (PCB) cutter.
  2. Klip formen AAO 35 mm fra bunden ved hjælp af en nipper. Mark prøve navn og fremstillingsdatoen på bagsiden.
  3. Rense en 8,0" wafer med en lille dosis af landbrugsethanol. Sætte polystyren plader på wafer, derefter montere AAO skimmel.
  4. Sætte filmens nederst i skuffen for en termisk imprinter. Vedhæfte den øverste film til pakning.
  5. Sætte wafer på bunden film. Sted pakning på wafer. Sørg for, at der er ingen støv på wafer.
  6. Luk skuffen af den termiske imprinter. Anvende 165 ° C varme og 620.52 kPa pres for 100 s.
  7. Cool prøven til stuetemperatur. Forsigtigt vride den polystyren ark for at frigive AAO skimmel.

5. sterilisation og hydrofile ændring af Gradient Nanopattern plader

  1. Placer nanopattern plader på en firkantet fad. Hæld 100 mL af 70% ethanol og udsættes for ultraviolet lys, i 30 min.
  2. Tørre nanopattern plader med kvælstof. Overfør nanopattern plader til en ilt plasma generator.
  3. Evakuere salen indtil den når 1,33 Pa. Derefter indsprøjtes ilt med en sats på 30 cm3/min. anvendes en radio frekvens magt 60 W. Bevar ilt plasma for 90 s.
    Bemærk: Det anbefales at bruge plasma-behandlede nanopattern plader inden 14 dage.
  4. Nanopattern metalpladen i bunden af en celle kultur parabol ved hjælp af en dråbe af toluen.
  5. Forsegle prøver i en pose og sterilisere med lav temperatur plasma sterilizer.

6. dyrkning af hECFCs

Bemærk: Udføre alle centrifuging procedurer ved 4 ° C, medmindre andet er angivet.

  1. Før isolere den perifert blod inkuberes mononukleære celler (PBMC), en kollagen-belagt 12-godt kultur parabol ved 37 ° C i 1 time.
  2. Vask 12-godt kultur fadet ved hjælp af 1 × sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
  3. Indsamle 50 mL af humant blod ved hjælp af en heparin hæmmer tube.
  4. Sætte 6 mL af hydrofile polysaccharid løsning i en 15 mL rør og tilsæt 8 mL blod til hydrofile polysaccharid løsning.
    Bemærk: Langsomt afpipetteres blod i den hydrofile polysaccharid løsning.
  5. Der centrifugeres rør ved 1020 x g i 20 min. at sammenpresse cellerne.
  6. Høste de uigennemsigtige cellelag, og overføre til en ny 15 mL tube.
  7. Tilføje 10% føtal bovint serum (FBS)-indeholdt PBS og centrifugeres rør ved 1020 x g i 10 min at sammenpresse cellerne.
  8. Fjern supernatanten og tilføje røde blodlegemer lysisbuffer. Holde i isbad i 5 min.
  9. Tilføje 10% FBS-indeholdt PBS og centrifugeres rør ved 1020 x g i 5 min at sammenpresse cellerne.
  10. Fjern supernatanten og tilsæt 10% FBS-indeholdt PBS. Der centrifugeres rør ved 1020 x g i 5 min at sammenpresse cellerne.
  11. Fjern supernatanten og tilsæt 1 mL i endothelial celle ekspansion medium suppleret med 10% FBS. Frø 8.0 × 106 celler pr. brønd for hver kollagen-belagte fad.
  12. Ændre næringssubstratet hver dag i 1 uge. Derefter ændre næringssubstratet hver 2 dage.
    Bemærk: hECFCs kan findes efter kultur dag 10-14. hECFCs viser typiske brostensbelagte-lignende morfologi og danne en koloni, som kan observeres i fase kontrast mikroskopi. Immunfluorescens farvning af vaskulære endotel cadherin (CD144) og von Willebrands faktor (vWF) kan også udføres til karakterisering af hECFCs efter yderligere celle ekspansion.
  13. For at dyrke hECFCs, bruge endotel celle ekspansion medium suppleret med 5% FBS og penicillin/streptavidin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2. Erstatte mediet en gang om dagen.
  14. Efter hECFC induktion, vokse cellerne til passage 7 til yderligere forsøg.

7. celle, såning og kultur på Gradient Nanopattern plader

Bemærk: Trin 7 beskriver kultur af hECFCs på gradient nanopattern pladen, men andre celle kilder kan også bruges.

  1. Coat gradient nanopattern plader med 1 mL 0,1% protein belægning løsning i PBS i 10 min ved stuetemperatur.
    Bemærk: 0,1% protein belægning dækker ikke nanopillar funktionerne.
  2. Gøre en hECFCs suspension fra kultur parabol af en celle-deling standardmetode ved hjælp af trypsin.
  3. Fortyndet cellesuspension for at opnå den ønskede sammenløb. Seed hECFCs gradient nanopattern plader og flad kontrol (fx 1,0 × 104 celler/cm2).
    Bemærk: Når hECFCs er seedet på 1,0 × 104 celler/cm2 på gradient nanopattern plader, når cellen confluency normalt 70-80% efter 2 dage.
  4. Kultur celler på flad eller gradient nanopattern plader i 2 dage i væksthuset.

8. observation og analyse

  1. Scanning elektron mikroskop (SEM) imaging
    1. Fix hECFCs kulturperler på flad eller gradient nanopattern plader med 2,5% glutaraldehyd ved 4 ° C for natten.
    2. Behandle 1% osmium dinitrogentetraoxid i 1 time ved stuetemperatur. Vask prøver med PBS.
    3. Dehydrere prøver med ethanol fra lav til høj koncentration (50%, 70%, 80%, 90% og 100%) i 10 min pr. hvert trin.
    4. Behandle hexamethyldisilazane (HMDS) i 15 min. ved stuetemperatur. Efter at vaske prøver med friske HMDS og forlade prøver under stinkskab mindst 1 dag indtil den resterende HMDS fordamper helt.
    5. Pels prøver med platin sputter coater i 5 min og undersøge prøver med en SEM.
  2. Transmissions-elektronmikroskop (TEM) imaging
    1. Fix hECFCs kulturperler på flad eller gradient nanopattern plader med 2% PARAFORMALDEHYD og 2,5% glutaraldehyd blanding i PBS ved 4 ° C for natten.
    2. Udføre efter fiksering ved hjælp af 1% osmium dinitrogentetraoxid og dehydrere prøver ved hjælp af metoden i 8.1.3.
    3. Integrere prøver i epoxyharpiks. Laver 60 nm tykke sektioner fra blokke og placere et afsnit på et TEM gitter.
    4. Pletten afsnittet med blandingen af 10 mg uranyl acetat i 100 mL methyl alkohol og 0,1 mg bly citrat i 100 mL destilleret vand. Få billeder med en TEM.
  3. Fluorescens farvning
    1. Fix hECFCs kulturperler på flad eller gradient nanopattern plader med 4% PARAFORMALDEHYD ved stuetemperatur i 15 min.
    2. Permeabilize og blokere prøver med 5% ged serum og 0,1% octylphenol nonylphenolethoxylat i PBS (PBST) ved stuetemperatur i 30 min.
    3. Inkuber prøver med anti-menneskelige vinculin primære antistof (1: 500 i PBST) ved stuetemperatur til 2 h. Skyl prøver tre gange med PBST.
    4. Inkuber prøver med fluorescens-konjugeret phalloidin (1:1, 000 i PBST), fluorescens-konjugeret sekundær antistof (1:1, 000 i PBST) ved stuetemperatur til 2 h. Skyl prøver tre gange med PBST.
    5. Inkuber prøver med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000 i PBST) ved stuetemperatur i 5 min.
    6. Drop 10 µL af montering medium på overfladen af gradient nanopattern. Placere en coverslip på montering medium.
    7. Prøven anbringes hovedet på prøve scenen og erhverve billeder ved hjælp af Konfokal fluorescens mikroskop.
  4. Billedanalyse
    1. Overføre optagne billeder af hECFCs til et billede analysesystem.
    2. Vælg tilfældig på phalloidin farvning billede. Justere tærsklen og oprette et binært billede hvor celler er adskilt fra baggrunden.
    3. Tegn konturer rundt om celler til at måle celle areal og omkreds og manuelt tælle filopodia antallet pr. celle.
    4. Vælg tilfældig på vinculin farvning billede. Justere tærsklen og oprette et binært billede af fokale vedhæftning områder.
      Bemærk: Justere billedet tærskel korrekt for at undgå kunstige over - eller under - filling af fokale vedhæftning områder.
    5. Tæl antallet af focal vedhæftning af hver celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results


Figur 1 viser SEM billeder af de fabrikerede gradient AAO forme efter deres type og beliggenhed. Figur 2 viser SEM billeder af gradient nanopattern plader med regelmæssig afrundede nanopillars, og figur 3 er kvantificering data af nanopillar diameter. Tabel 1 viser de særlige kendetegn ved den fabrikerede nanopillars.

Figur 4A viser ordningen af dyrkning af blod-afledte hECFCs. Figur 4B viser fase kontrast billede af thecultivated hECFCs. Figur 4 c viser hECFC markører farves med CD144 (grøn), vWF (rød), og kernen (blå). Fig. 5A viser repræsentative SEM billeder af hECFCs efter 2 dages kultur på flat, GP 120/200, GP 200/280 og GP 280/360 plader. Figur 5B og C skildrer kvantitative data på celle areal og omkreds i forhold til flat. Kvantificering data viste, at celler dyrkes på nanopillar overflader af mindre størrelse viste reduceret celle areal og omkreds. Figur 5 d er de repræsentative SEM billeder af hECFCs, som viser morfologi af eksisterende filopodia. Figur 5E skildrer den kvantitative data om filopodia antal i forhold til flat. Betydelig filopodial udvækst blev observeret i celler dyrkes på GP 120/200, mens ingen væsentlig ændring blev observeret i GP200/280 eller GP280/360 i sammenligning med flat. Figur 5F viser repræsentative TEM billeder af hECFCs efter 2 dages kultur på flad og gradient nanopattern plader.

Figure 1
Figur 1. Gradient AAO mug. SEM billeder af gradient AAO forme for GP 120/200, GP 200/280 og GP 280/360 plader efter placeringen af forme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Gradient nanopattern plader. SEM billeder af søjle-type gradient nanopattern plader for GP 120/200, GP 200/280 og GP 280/360 plader efter placeringen af plader. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Størrelse forløb af nanopillar diameter. Kvantificering data viser gradienten af nanopillar diametre for GP 120/200, GP 200/280 og GP 280/360 plader, henholdsvis. Søjler repræsenterer standardfejl. Dette tal blev ændret fra [Acta Biomaterialia] 20. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Young's modulus (GPa) Nanopillar Diameter (nm) Nanopillar Pitch (nm) Center til Center afstand (nm) Nanopillar højde (nm) Nanopillar stivhed (N/m)
Flad 2.43±0.19 – – – – –
GP 120/200 1.74±0.11 120-200 320-240 440 276.9±21.9 9.35
GP 200/280 2.01±0.05 200-280 240-160 440 268.1±25.9 55.78
GP 280/360 2.1±0.13 280-360 160-80 440 293.6±23.6 134.15

Tabel 1. Karakteristik af opdigtede nanopillars. Kvantificerede data viser Youngs modulus, diameter, pitch, center til center afstand, højde og stivhed af opdigtede nanopillars. Denne tabel er ændret fra [Acta Biomaterialia] 20.

Figure 4
Figur 4 . Karakterisering af hECFCs. (A) skematisk diagram viser tidsplan af hECFCs stammer fra voksne perifert blod. (B) fase kontrast billede af hECFC koloni, afledt af voksen perifert blod på dag 14. (C) immunfluorescent billeder viser CD144 (grøn), vWF (rød) og cellekerner farves med DAPI (blå). Dette tal blev ændret fra [Acta Biomaterialia] 20. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . hECFCs kulturperler på flad og gradient nanopattern plader i 2 dage. (A) repræsentative SEM billede af hECFCs kulturperler på flad, GP 120/200, GP 200/280 og GP 280/360 plader. (B og C) Kvantificering data af areal og omkreds af hECFCs (n = 50). * p <.05 i forhold til Flat. (D) repræsentative SEM billeder af forkanten af hECFCs på fladt og gradient nanopattern plader. (E) kvantificering data om antallet af filopodia pr. én hECFC (n = 20). * p <.05 i forhold til Flat. (F) repræsentant TEM billede af hECFC kulturperler på flad og gradient nanopattern plader. Hvide pile angiver punkterne interaktion mellem hECFCs og substrat overflade. Dette tal blev ændret fra [Acta Biomaterialia] 20. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Figur 1. Vand kontakt vinkel af uberørte AAO og HDFS behandlet AAO. Kontakt vinkel målinger viser hydrofobe egenskaber af HDFS samles selv éncellelag (A) før, og (B) efter behandling. Venligst klik her for at downloade denne figur.

Tillægs figur 2. SEM billeder af opdigtede gradient nanopattern plader med samme AAO mug. Sammenlignende SEM billede sæt til kontrol af holdbarheden af AAO skimmel. (A) Gradient nanopattern plade produceret med frisklavet mug. (B) Gradient nanopattern plade produceret med AAO skimmel efter prægning 15 gange. Venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 3. Indflydelse af protein belægning. SEM billeder af hECFCs, der var kulturperler på GP 120/200, GP 200/280 eller GP 280/360 gradient nanopattern plader (A) uden eller (B) med protein belægning. Dette tal blev ændret fra [Acta Biomaterialia] 20 Venligst klik her for at downloade denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fabrikation af en AAO ofte lider af mangler såsom revner, uregelmæssige former af porer, og afbrænding. Den væsentligste årsag til disse fejl kaldes en elektrolytisk opdeling, der er stærkt påvirket af arten af de metal substrater er anodiseret, resistivitet elektrolyt21. Da resistivitet af elektrolytten varierer afhængigt af dens temperatur, er fjerne varmen kontinuerligt fra elektroder det kritiske punkt til at opretholde de placeringsmæssige temperatur af elektrolytten stabil i sådan en høj spænding Anodisering tilstand. I denne protokol opdigtet vi AAO forme ved at ændre Masudas to-trins anodization22,23. Udskiftning næsten halvdelen elektrolyt med methyl alkohol ikke kun forhindrer elektrolytten i frysning ved lave temperaturer men også berøver elektrode af varme ved fordampning i bunden af pore24. Grund til at bruge en overhead omrører og løbehjul i stedet for en magnetomrører er også at sikre en temperaturkontrol. Den typiske magnetomrører har en høj sandsynlighed for tomgang på grund af den utilsigtet forskydning af den magnetiske bar under langsigtet drift. Dette problem inducerer den ubehørig videregivelse af en elektrolyt, at hæve sin temperatur, og fører til brænding.

For at give en størrelse gradient til formen AAO, nedsænket vi gradvist AAO i en fosforsyre, ætsning løsning. Porerne er udvidet i forhold til den tid AAO forbliver i radering løsning, som vist i figur 1. På denne betingelse er den gennemsnitlige pore-udvidelse 0,67 nm/min. manipulere nedsænke hastighed og tid vil ændre hældningen af størrelse gradient og maksimale pore diameter af AAO. Den maksimale mulige pore diameter er 400 nm. Når pore diameteren overstiger 400 nm, afstand mellem væggen mellem porer bliver så tynd, at det ikke kan tåle presset under den termiske prægning processen.

En HDFS selvsamlede éncellelag er kendt for at være i stand til at tilføje en hydrofobe ejendom til den materielle overflade25. HDFS molekyle gør et stærkt kovalente bånd med hydroxylgrupper på AAO overfladen indført af Piranha behandling26. Derfor, som vist i tillægs figur 1, en solid selvsamlede éncellelag kan dannes, når et stort antal hydroxylgrupper er til stede på substrat overflade. For optimal kvalitet med en HDFS selvsamlede éncellelag foreslår vi gennemfører reaktion i en dehumidified atmosfære. Når HDFS er udsat for fugt, en side reaktion med vand danner dimere og trimere selv oligomerer silan molekyler, og formindsker den overordnede kvalitet af selvsamlede éncellelag.

På ved hjælp af formen AAO med en størrelse gradient i termiske nanoimprinting, blev celle kultur plader med en gradient af nanopillars fremstillet figur 2 og figur 3. Metoden, der termisk nanoimprinting har en fordel i, at det kan producere et stort antal identiske nanopattern plader ved hjælp af en AAO master mold. Supplerende figur 2 viser, at der er ingen forskel i kvaliteten af nanopattern produceret, selv efter femten prægning processer, i forhold til den nanopattern, produceret af den nye AAO mug. Grunden til at vælge polystyren som et materiale til at overføre en nanopattern er at polystyren har en passende glas overgang temperatur (100 ° C) til varme prægning, og det er almindeligt anvendt i kommercielle celle kultur retter på grund dens gennemsigtig og ugiftige egenskaber.

Opdigte nanostrukturer med høj formatforhold ved hjælp af termisk nanoimprinting metode er vanskeligt. Fordi når processen tilstande, som tryk og tid stigning, bliver formen dybt indlejret i polymer substrat, hvilket gør det svært at skille formen fra underlaget. Derfor er det meget udfordrende at producere nanopatterns med et størrelsesforhold på 1:3 eller mere ved hjælp af vores nanoimprinting teknik. Men ifølge TEM billeder vi observeret figur 5 c, vi har fundet en interessant kendsgerning, at membranen af celler på nanopatterns ikke var i kontakt med bunden af nanopattern. Med andre ord, blev alle fysiske stimuli, der kan manipulere et svar af celler stammede fra de øverste dele af nanopattern. Derfor, i denne undersøgelse, vi ikke nødt til at overveje formatforhold i studere svar af cellen til nanopattern. Som vist i supplerende figur 3, havde 0,1% protein belægning løsning ingen indflydelse på den vedhæftede fil af hECFCs på nanopillar overflader. Desuden, disse nanoscaled stimuli fra gradient nanopattern plader faldt celle areal og omkreds af hECFCs og øget filopodial udvækst figur 5.

I sammendrag etableret vi gradient nanopattern plader ved at manipulere et svar af hECFCs i vitro. For at vide præcis hvad størrelse af nanostrukturer cellerne påvirkes stærkt, er en kommende arbejde påkrævet til at designe en celle-specifikke-størrelse nanopillar ved at justere hældningen af størrelse gradient og minimum-maksimum diameter af nanopillars. Vi forventer denne gradient nanopattern at være et fascinerende værktøj til skærmen samspillet mellem celler og nanostrukturer samt yde avanceret celle nicher hvor nanostrukturer kan frit indstilles i størrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for uddannelse, videnskab og teknologi (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] og Bio & medicinsk teknologiudvikling Program af NRF finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT & fremtid planlægning [NRF-2017M3A9C6029563].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perchloric acid 60% Daejung Chemicals & Metals 6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9% Daejung Chemicals & Metals 4118-4100
Phosphoric acid 85% Daejung Chemicals & Metals 6532-4400
Methyl alcohol 99.5% Daejung Chemicals & Metals 5558-4400
Chromium(VI) oxide Daejung Chemicals & Metals 2558-4400
Sulfuric acid 95% Daejung Chemicals & Metals 7781-4100
Hydrogen peroxide 30% Daejung Chemicals & Metals 4104-4400
n-hexane 95% Daejung Chemicals & Metals 4081-4400
Toluene 99.5% Daejung Chemicals & Metals 8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane Gelest SIH5840.4 Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99% Sigma aldrich 464309
Collagen solution Stemcell #4902
Gelatin Sigma aldrich G1890 Protein coating solution
Ficoll-Paque GE Heathcare 17-1440-03 Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MV Lonza CC-3202 Endothelial cell expansion medium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline Gibco 10010031
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Paraformaldehyde Sigma aldrich P6148
Glutaraldehyde Sigma aldrich G5882-100ML
Osmium tetroxide Sigma aldrich 201030-1G
Hexamethyldisilazane Sigma aldrich 440191
Triton X-100 Sigma aldrich X100-100ML Octylphenol ethoxylate 
Goat serum Gibco 26050-088
anti-human vinculin primary antibody  Sigma aldrich V9131
F-actin probe Molecular Probes A12379 Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody Molecular Probes A11001 Fluorescence-conjugated secondary antibody 
4',6-diamidino-2-phenylindole  Sigma aldrich D9542
Mounting medium DAKO S3023
Anti-human vWF primary antibody  DAKO A0082
Anti-human CD144 primary antibody  BD Biosciences #555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA Ted Pella 18012 Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25g Ted Pella 19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10g Ted Pella 19312
Ultra pure aluminum plate Goodfellow 26050-088
Polystyrene sheet Goodfellow ST313120
8.0" silicon wafer Siltron 29-01024-03 Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 L Kartell KA.230
Vacuum pump Vacuumer V3.VOP100
Power supply Unicorntech UDP-3003
Magnetic stirrer Daihan scientific SL.SMS03022
Overhead stirrer Daihan scientific HT120DX
Circulator Daihan scientific WCR-P12
Linear moving stage Zaber A-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degrees Zaber AB90M Accessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mm Vitlab 67995 Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mL Cowie CW007.25
Ultrasonic cleaner Branson B2510MTH
PCB cutter Hozan Tool Industrial K-110
Nanoimprint device Nanonex NX-2000
Oxygen plasma generator Femto Science CUTE
Low temperature sterilizer Lowtem Crystal 50
CO2 Incubator Panasonic MCO-18AC
Confoal laser scanning microscope Carl Zeiss LSM700
Scanning electron microscope JEOL JSM6701
Transmission electron microscope Hitachi H-7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
  3. Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
  4. Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
  5. Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
  6. Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
  7. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  8. Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
  9. Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
  10. Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
  11. Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
  12. Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
  13. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  14. Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
  15. Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
  16. Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
  17. Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
  18. Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
  19. Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
  20. Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
  21. Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
  22. Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
  23. Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
  24. Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
  25. Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
  26. Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).

Tags

Bioteknologi sag 137 anodisk aluminiumoxid nanoimprint litografi gradient nanopattern plader ekstracellulære matrix fysisk stimulation menneskelige endotel kolonidannende celler
Fabrikation af Gradient Nanopattern af termisk Nanoimprinting teknik og Screening af svar i Endothelial kolonidannende celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, D. H., Cui, L. H., Seo, H. R.,… More

Kim, D. H., Cui, L. H., Seo, H. R., Joo, H. J., Choi, S. C., Lim, D. S., Lee, K. B. Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells. J. Vis. Exp. (137), e57661, doi:10.3791/57661 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter