Name: Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Gradient-Nanostrukturen durch thermisches Nanoimprinting zur Untersuchung menschlicher endothelialer Progenitorzellen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Muster für die Zellbiologie.

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Diese Arbeit wurde durch das grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] und Bio & medizinische Technologieentwicklung unterstützt. Programm der NRF finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT & Zukunft planen [NRF-2017M3A9C6029563].

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Herstellung von einem AAO oft weist Mängel wie Risse, unregelmäßige Formen von Poren und brennen. Der Hauptgrund für diese Mängel ist eine elektrolytische Zusammenbruch, die stark von der Art der Metall Substrate werden eloxiert und der Widerstandsfähigkeit der Elektrolyt21betroffen ist. Da der Widerstand des Elektrolyten abhängig von seiner Temperatur schwankt, ist die Beseitigung der Hitze kontinuierlich von Elektroden der kritische Punkt, die standortbezogene Temperatur des Elektrolyten als sta...

Vor kurzem hat die Reaktion der Zellen durch die physische Stimulation der Oberflächentopographie im Bereich der Zelle engineering1,2,3,4angestrahlt wurden. Daher konzentriert sich stärker auf dreidimensionale Nanostrukturen auf der Zelle Oberfläche Anlage5. Es wurde berichtet, dass der Integrin, das die Oberfläche Anerkennung Gerät der Zelle ist, die körperliche Anregung angetrieben durch die Mikro-Nano-Strukturen der ECM durch Mechano-Transduktion6überträgt. Diese mechanische Stimulation reguliert Zelle Verhalten durch Kontakt Leitung7 und induziert Zellskelett Reorganisation, Form, neben der fokalen Adhäsionen und Steifigkeit der Zellen8zu ändern.
Menschlichen endotheliale Vorläuferzellen (hEPCs) im Körper arbeiten eng mit der Mikroumgebung von den umliegenden ECM-9. Dies bedeutet, dass der physikalische Zustand des ECM als ein wichtiger Parameter für die spezifische Zellmatrix Adhäsion Komplexbildung wirkt soviel Blut fließen10Schubspannung abgeleitet. Es wird berichtet, dass die Oberfläche Nanotopography verbessert die in-vitro- Netzwerkbildung umfangreiche Kapillarrohr hEPCs11 und, dass ein ECM/Bio löslicher Faktor System kombiniert ermöglicht hEPCs, dysfunktionalen Substrate zu erkennen und fördert die Wunde heilen12,13. Dennoch ist das Verhältnis von ECM und hEPCs nicht klar.
Obwohl viele Forscher versucht zu klären, die Beziehung zwischen Zell-Reaktionen und körperliche Signale von verschiedenen Substraten14,15,16, verwendet diese Studien nur die feste Größe von einer Nanostruktur oder Nanopatterns mit unregelmäßigen Arrangements, die eine Beschränkung auf die Beziehung zwischen der Größe der Zelle und Nanostrukturen Verhalten aufzuklären haben. Das Problem hier ist ein Mangel an geeigneten Werkzeugen für das screening von zellulärer Reaktionen, die bestehende mühsam und iterative Ansätze zu finden, die optimale Größe der Nanostruktur ersetzen können. Daher ist eine einfache Technik für das screening von Zelle Reaktionen auf körperliche Reize ohne Wiederholung erforderlich.
Hier beschreiben wir eine Methode in unsere früheren Berichte17,18,19 , um ein gradient Nanopattern zu produzieren, in denen der Durchmesser der angeordneten Nanopillars schrittweise erhöht. Darüber hinaus beschrieben wir auch, wie man pflegen und analysieren das Verhalten von hECFCs auf gradient Nanopattern Platten zu ermitteln, die Wirkung von physikalischen Reize auf die Zellen. Eine milde Anodisierung, stufenweisen Ätzen und Anti-sticking Layer Beschichtungsverfahren dienten gradient AAO Schimmel zu fabrizieren. Durch die Annahme einer thermisches Prägung Lithographie-Technik, wurden identische Polystyrol gradient Nanopatterns auf eine kostengünstige und einfache Weise hergestellt. Mit Farbverlauf Nanopatterns ist es möglich, festzustellen, welche Größe der Nanostruktur hat einen großen Einfluss auf Zelle Verhalten in einem Experiment. Wir erwarten, dass dieser gradient Nanopattern hilfreich sind für das Verständnis der Mechanismen der Interaktion zwischen Blut abgeleitet hECFC oder andere Zellen und Nanostrukturen in verschiedenen Größen.

<table><tbody><tr><td>Perchlorsäure 60%</td><td>Daejung Chemie & Chemie Metalle</td><td>6512-4100</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol, absolut 99,9</td>%<td>Daejung Chemicals & Metalle</td><td>4118-4100</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure 85%</td><td>Daejung Chemie & Schweiz Metalle</td><td>6532-4400</td><td></td></tr><tr><td>Methylalkohol 99,5%</td><td>Daejung Chemikalien & Metalle</td><td>5558-4400</td><td></td></tr><tr><td>Chrom(VI)-oxid</td><td>Daejung Chemicals & Metalle</td><td>2558-4400</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure 95%</td><td>Daejung Chemicals & Metalle</td><td>7781-4100</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid 30%</td><td>Daejung Chemicals & Germany Metalle</td><td>4104-4400</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexan 95%</td><td>Daejung Chemicals & Metalle</td><td>4081-4400</td><td></td></tr><tr><td>Toluol 99,5%</td><td>Daejung Chemicals & Metalle</td><td>8541-4400</td><td></td></tr><tr><td>(heptadecafluor-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorsilan</td><td>Gelest</td><td>SIH5840.4</td><td>Feuchtigkeitsempfindliches</td></tr><tr><td>Methoxynonafluorbutan 99%</td><td>Sigma aldrich</td><td>464309</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenlösung</td><td>Stemcell</td><td>#4902</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1890</td><td>Proteinüberzugslösung</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Heathcare</td><td>17-1440-03</td><td>Hydrophile Polysaccharidlösung</td></tr><tr><td>EGM-2MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>Endothelzellexpansionsmedium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma aldrich</td><td>G5882-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid</td><td>Sigma aldrich</td><td>201030-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Octylphenolethoxylat&nbsp;</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-Vinculin-Primärantikörper</td><td>Sigma aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>F-Aktin-Sonde</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A12379</td><td>Fluoreszenz-konjugiertes Phalloidin</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-konjugiertes Anti-Maus&nbsp; IgG-Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A11001</td><td>Fluoreszenz-konjugierter Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humaner vWF-Primärantikörper&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mensch&nbsp; CD144 primärer Antikörper&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>#555661</td><td></td></tr><tr><td>Eponat 12&Handel; Einbettungskit, mit BDMA</td><td>Ted Pella</td><td>18012</td><td>Epoxidharz</td></tr><tr><td>Uranylacetat, 25 g</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>Bleicitrat, Trihydrat, 10 g</td><td>Ted Pella</td><td>19312</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareine Aluminiumplatte</td><td>Goodfellow</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrolplatte</td><td>Goodfellow</td><td>ST313120</td><td></td></tr><tr><td>8,0" Siliziumwafer</td><td>Siltron</td><td>29-01024-03</td><td>Einseitig poliert, 725 & Mikro; m dick</td></tr><tr><td>Vakuumexsikkator, 4,4 L</td><td>Kartell</td><td>KA.230</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>Vakuumer</td><td>V3. VOP100</td><td></td></tr><tr><td>Netzteil</td><td>Unicorntech</td><td>UDP-3003</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>Daihan scientific</td><td>SL. </td><td></td>SMS03022</tr><tr><td>Überkopfrührer</td><td>Daihan scientific</td><td>HT120DX</td><td></td></tr><tr><td>Zirkulator</td><td>Daihan scientific</td><td>WCR-P12</td><td></td></tr><tr><td>Linearer beweglicher Tisch</td><td>Zaber</td><td>A-LSQ300A-E01-KT07</td><td></td></tr><tr><td>Winkel, 90 Grad</td><td>Zaber</td><td>AB90M</td><td>Zubehör des linearen bewegtischen Tisches</td></tr><tr><td>PMP Pinzette, 145 mm</td><td>Vitlab</td><td>67995</td><td>Nichtmetallische Pinzette</td></tr><tr><td>PTFE-Becherglas, 250 mL</td><td>Cowie</td><td>CW007.25</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr><tr><td>PCB-Cutter</td><td>Hozan Tool Industrial</td><td>K-110</td><td></td></tr><tr><td>Nanoimprint-Gerät</td><td>Nanonex</td><td>NX-2000</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoff-Plasmagenerator</td><td>Femto Science</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Niedertemperatur-Sterilisator</td><td>Lowtem</td><td>Crystal 50</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Confoal Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>JEOL</td><td>JSM6701</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>Hitachi</td><td>H-7500</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von gradient nanopattern durch thermische nanoimprinting technik und screening der reaktion des menschlichen koloniebildenden endothelzellen

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography finden sich in unterschiedlichen extrazellulären Matrizen (ECMs) um den Körper und ist bekannt als wichtige regulatorische Maßnahmen auf zelluläre Reaktionen haben. Allerdings ist es schwierig, das Verhältnis zwischen der Größe einer Nanostruktur und die Reaktionen der Zellen aufgrund der mangelnden richtigen Screening-Tools bestimmen. Hier zeigen wir die Entwicklung von reproduzierbaren und kostengünstige gradient Nanopattern Platten für die Manipulation von zellulären Antworten. Mit anodische Aluminiumoxid (AAO) als ein master-Form, gradient Nanopattern Platten mit Nanopillars der zunehmenden Durchmesserbereiche [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) und 280-360 nm (GP 280/360)] wurden durch eine thermische Prägung Technik hergestellt. Diese Gradienten Nanopattern Platten wurden entwickelt, um die verschiedenen Größen des Nanotopography in das ECM zu imitieren und wurden verwendet, um die Reaktionen des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen (hECFCs) Bildschirm. In diesem Protokoll beschreiben wir Schritt für Schritt Verfahren der Herstellung von gradient Nanopattern Platten für Zelle engineering, Techniken der hECFCs aus dem menschlichen peripheren Blut zu kultivieren und Kultivierung von hECFCs auf Nanopattern Platten.

Abbildung 1 zeigt die SEM Bilder der vorgefertigten Gradienten AAO Formen je nach Art und Lage. Abbildung 2 zeigt SEM Bilder der gradient Nanopattern Platten mit regelmäßigen runden Nanopillars und Abbildung 3 ist Quantifizierung Daten der Nanopillar Durchmesser. In Tabelle 1 sind die Merkmale von vorgefertigten Nanopillars.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Fertigung der gradient Nanopattern Platten über thermische Nanoimprinting und die Methode der screening-Antworten der menschlichen endotheliale Vorläuferzellen in Nanostrukturen. Durch den Einsatz der beschriebenen Technologie ist es möglich, ein Gerüst zu produzieren, die Zelle Verhalten durch physikalische Reize bearbeiten können.

Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Gradientenmuster mit hoher Reproduzierbarkeit erzeugen kann und das Screening der Zellreaktion auf Parasitenbeobachtungsstrukturen ermöglicht. Die beobachtete Reaktion auf körperliche Stimulation ist noch nicht vollständig erforscht. Wir glauben, dass unsere Methode ein wesentliches Werkzeug sein wird, um diese unbekannten Mechanismen aufzudecken.Schließen Sie zunächst ein Doppelmantelbecherglas mit der Elektropolierlösung an eine Umwälzpumpe an und stellen Sie die Temperatur auf sieben Grad Celsius ein. Lassen Sie die Lösung mindestens 30 Minuten lang unter Rühren, bis die Temperatur auf sieben Grad Celsius sinkt. Tauchen Sie die hochreine Aluminiumplatte und die Kohlenstoff-Gegenelektrode mit Krokodilklemmen und Kupferdraht in die Elektropolierlösung.Stellen Sie die Position der Aluminiumplatte in der Carbon-Gegenelektrode so ein, dass sie zueinander zeigt. Verbinden Sie die Aluminiumplatte mit dem Pluspol und verbinden Sie die Kohlenstoff-Gegenelektrode mit dem Minuspol eines Gleichstromnetzteils. Nach dem Anlegen einer Spannung von 20 Volt wechselt die Aluminiumplatte von einer rauen, glanzlosen Oberfläche zu einer spiegel

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben ein Protokoll für die Mikrofabrikation der Gradienten-erzeugenden Mikrofluidik-Gerät, das räumliche und zeitliche Verläufe in klar definierten Mikroumgebung erzeugen können. Bei diesem Ansatz kann der Gradient-Erzeugung mikrofluidischen Gerät verwendet, um gerichtete Wanderung, Embryogenese, Wundheilung und Krebs Metastasen zu untersuchen.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Herstellung von biomimetischen Herzzellkultursubstraten, die aus zwei unterschiedlichen Polymermaterialien mittels Kapillarkraftlithographie hergestellt werden.  Die beschriebenen Methoden bieten eine skalierbare, kostengünstige Technik, um die Struktur und Funktion von makroskopischem Herzgewebe für in vitro und in vivo Anwendungen zu entwickeln.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Wir berichten über Techniken zur Mikrostruktur nanoporöse Gold Dünnschichten durch Schablonendruck und Photolithographie, sowie Verfahren zur Kultivierung von Zellen auf den mikrofabrizierten Muster. Darüber hinaus beschreiben wir Bildanalysemethoden der Morphologie des Materials und der kultivierten Zellen mit dem Rasterelektronenmikroskop und Fluoreszenzmikroskopie zu charakterisieren.

Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

Wir beschreiben ein Protokoll zur Modifikation der Zellaffinität einer Gerüstoberfläche in wässriger Umgebung. Die Methode nutzt die Titandioxid-Photokatalyse, um organische Schichten im lichtbestrahlten Bereich zu zersetzen. Wir zeigen, dass es verwendet werden kann, um Mikrodomänen von Gerüstproteinen zu erzeugen, sowohl ex situ als auch in situ.

Photostrukturierungs Proteinen und Zellen in wässriger Umgebung Mit TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Photokatalyse

Dieser Artikel stellt eine einfache Methode zur Bereitstellung von nicht-kontinuierlichen gradienter statische Belastungen auf eine konzentrische Zelle beladenen Hydrogel, Ausrichtung der Zellen für das Tissue Engineering zu regulieren.

Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel

Es wird ein Protokoll zur Herstellung einer großen Fläche von nanostrukturiertem Substrat aus kleinen nanostrukturierten Formen zur Untersuchung der nanotopographischen Modulation des Zellverhaltens vorgestellt.

Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens

Die Kontrolle von chemischen und Sauerstoffgradienten ist essentiell für Zellkulturen. In diesem Artikel wird über ein mikrofluidisches Gerät aus Polydimethylsiloxan-Polycarbonat (PDMS-PC) berichtet, das in der Lage ist, zuverlässig Kombinationen von chemischen und Sauerstoffgradienten für Zellmigrationsstudien zu erzeugen, die in biologischen Labors ohne ausgefeilte Instrumente praktisch eingesetzt werden können.

Polydimethylsiloxanhaltigen Polycarbonat Mikrofluidiksysteme für Zellmigrationsstudien unter Perpendicular Chemische und Sauerstoff Gradients

Dieser Artikel beschreibt die detaillierte Methode ein Array gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME) Vorbereitung für Hochdurchsatz-Manipulation von physikalischen und chemischen imitiert in Vivo zellulären Mikroumgebungen Queues und Identifizieren Sie die optimale zelluläre Umgebung für menschliche pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einzelligen profiling.

Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

Wir stellen ein Protokoll für die Hochdurchsatzproduktion von Gefäßkanälen mit flexiblen Größen und gewünschten Mustern auf einer Standard-Sechs-Well-Platte unter Verwendung der 3D-Bioprinting-Technologie vor, die als Gefäße auf einer Platte (VOP) bezeichnet wird. Diese Plattform hat das Potenzial, die Entwicklung von Therapeutika für die mit einem kompromittierten Endothel verbundenen Erkrankungen voranzutreiben.

Hochdurchsatz-Bioprinting-Verfahren zur Modellierung der Gefäßpermeabilität in Standard-Sechs-Well-Platten mit Größen- und Musterflexibilität

Erfahren Sie die Herstellung von Gradient-Nanostrukturen durch thermisches Nanoimprinting zur Untersuchung menschlicher endothelialer Progenitorzellen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Muster für die Zellbiologie.

Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen (Video) | JoVE Journal

Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

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