Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Gradientenmuster mit hoher Reproduzierbarkeit erzeugen kann und das Screening der Zellreaktion auf Parasitenbeobachtungsstrukturen ermöglicht. Die beobachtete Reaktion auf körperliche Stimulation ist noch nicht vollständig erforscht. Wir glauben, dass unsere Methode ein wesentliches Werkzeug sein wird, um diese unbekannten Mechanismen aufzudecken.

Schließen Sie zunächst ein Doppelmantelbecherglas mit der Elektropolierlösung an eine Umwälzpumpe an und stellen Sie die Temperatur auf sieben Grad Celsius ein. Lassen Sie die Lösung mindestens 30 Minuten lang unter Rühren, bis die Temperatur auf sieben Grad Celsius sinkt. Tauchen Sie die hochreine Aluminiumplatte und die Kohlenstoff-Gegenelektrode mit Krokodilklemmen und Kupferdraht in die Elektropolierlösung.

Stellen Sie die Position der Aluminiumplatte in der Carbon-Gegenelektrode so ein, dass sie zueinander zeigt. Verbinden Sie die Aluminiumplatte mit dem Pluspol und verbinden Sie die Kohlenstoff-Gegenelektrode mit dem Minuspol eines Gleichstromnetzteils. Nach dem Anlegen einer Spannung von 20 Volt wechselt die Aluminiumplatte von einer rauen, glanzlosen Oberfläche zu einer spiegelnden, silbernen Oberfläche.

Um die Primäreloxierung durchzuführen, gießen Sie einen Liter des Elektrolyten in ein Zwei-Liter-Doppelmantelbecherglas. Tauchen Sie die polierte Aluminiumplatte und die Kohlenstoff-Gegenelektrode mit Krokodilklemmen in Kupferdraht in die Lösung. Installieren Sie einen vertikalen Schacht auf einem U-förmigen Sockel.

Befestigen Sie ein Überkopfrührwerk und ein Laufrad mit Metallklammern. Positionieren Sie den Propeller des Laufrads in der Nähe des unteren Endes beider Elektroden. Stellen Sie die Drehzahl des Überkopfrührwerks zwischen 200 und 300 U/min ein und legen Sie unter Rühren 16 Stunden lang eine Spannung von 195 Volt an.

Nach der Primäreloxierung wechselt die Farbe der Aluminiumplatte von Silber zu Grau. Um den Juckreiz von Aluminiumoxid durchzuführen, tauchen Sie die eloxierte Aluminiumplatte in die Ätzlösung. Den oberen Teil des Becherglases mit Alufolie verschließen und mindestens 10 Stunden rühren lassen.

Während des Ätzschritts ändert sich die Farbe der Aluminiumplatte von grau zu weiß. Für die Sekundäreloxierung stellen Sie die gleichen Versuchsbedingungen wie für die Primäreloxierung ein und legen Sie erneut eine Spannung von 195 Volt für sechs Stunden an. Nach der Sekundäreloxierung ändert sich die Farbe der Aluminiumplatte von weiß zurück zu grau.

Um die Gradientenporenerweiterung durchzuführen, schließen Sie zunächst das Doppelmantelbecherglas mit einer Phosphorsäurelösung an den Zirkulator an und stellen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein. Platzieren Sie einen linearen beweglichen Tisch senkrecht neben dem Becherglas und befestigen Sie eine Halterung an dem beweglichen Teil des Lineartisches. Stellen Sie den beweglichen Teil des linearen Tisches in die Ausgangsposition ein.

Befestigen Sie den Clip der Halterung und legen Sie die eloxierte Aluminiumplatte ein. Manipulieren Sie die Position der Aluminiumplatte manuell, so dass die Aluminiumplatte direkt über die Oberfläche der Lösung kommt. Tauchen Sie die Aluminiumplatte 120 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von vier Komma acht sechs Mikrometern pro Sekunde allmählich in die Lösung, um eine 35-Millimeter-AAO-Form mit einem Größengradienten von 120 Nanometern bis 200 Nanometern herzustellen.

Starten Sie eine Stoppuhr in dem Moment, in dem die Aluminiumplatte die Oberfläche der Lösung berührt. Nach Ablauf von 100 Minuten sollte sich die Hälfte der AAO-Form in der Lösung befinden. Um die Formen GP 200 bis 280 und GP 280 bis 360 herzustellen, tauchte die Form GP 120 bis 200 jeweils zwei bis vier Stunden lang vollflächig in die Porenaufweitungslösung.

Tauchen Sie die AAO-Form und die Piranha-Lösung 30 Sekunden lang mit einer nichtmetallischen Pinzette ein. Spülen Sie die AAO-Form mehrmals mit entionisiertem Wasser aus. Weichen Sie die Form 30 Minuten lang in entionisiertem Wasser ein und geben Sie weitere 30 Minuten Methylalkohol hinzu.

Trocknen Sie die AAO-Form drei Stunden lang vollständig unter Vakuum. Für die selbstorganisierte Monolagenabscheidung tauchen Sie die AAO-Form in 57 Milliliter gefiltertes und Hexan und ein 100-Milliliter-Becherglas. Geben Sie dann drei Milliliter HDFS-Stammlösung zum N-Hexan, um eine 2,9 millimolare HDFS-Lösung herzustellen, und warten Sie 10 Minuten, bis die Reaktion fortgesetzt wird.

Nachdem Sie die AAO-Form in Frische und Hexan überführt hatten, tränkten Sie die AAO-Form in 60 Millilitern Methoxy-Nonafluorbutan. Reinigen Sie die AAO-Form in einem Becherglas jeweils 10 Sekunden lang mit Ultraschall, um physikalisch adsorbierte HDFS-Moleküle zu entfernen. Wiederholen Sie den Reinigungsvorgang 10 Mal, bevor Sie die AAO-Form 24 Stunden lang unter Vakuum trocknen.

Schneiden Sie mit einem Leiterplattenschneider eine ein Millimeter dicke Polystyrolplatte auf eine Größe von zwei Komma neun Millimetern Breite und drei Komma sieben Millimetern Länge. Schneiden Sie bei der Arbeit in einem Reinraum die AAO-Form mit einer Zange 35 Millimeter von unten ab. Markieren Sie den Namen der Probe und die Daten des Herstellers auf der Rückseite.

Reinigen Sie einen Acht-Point-Zero-Inch-Wafer mit der kleinen Dosis Ethylalkohol, legen Sie dann die Polystyrolplatten auf den Wafer und montieren Sie die AAO-Form. Legen Sie als nächstes die untere Folie in die Schublade eines Thermoimprinters und befestigen Sie die obere Folie an der Dichtung, legen Sie dann den Wafer auf die untere Folie und platzieren Sie die Dichtung auf dem Wafer. Stellen Sie sicher, dass sich kein Staub auf dem Wafer befindet.

Nach dem Schließen der Schublade des Thermo- und Druckers 165 Grad Celsius Hitze und 620 Komma fünf/zwei Kilopascal Druck aus 100 Sekunden anwenden. Kühlen Sie die Probe dann auf Raumtemperatur ab. Nach dem Abkühlen entlüften Sie die Kammer und der Druck sinkt auf null Kilo Pascal.

Drehen Sie die Styroporplatte vorsichtig, um die AAO-Form zu lösen. Sammeln Sie 50 Milliliter menschliches Blut mit einem Heparinhemmer-Röhrchen. Geben Sie sechs Milliliter hydrophile Polysaccharidlösung in ein 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie der hydrophilen Polysaccharidlösung acht Milliliter Blut hinzu.

Es muss sofort Blut entnommen und langsam über die hydrophile Polysaccharidlösung gegeben werden. Nachdem Sie das Röhrchen 20 Minuten lang bei 1020 mal G zentrifugiert haben, um die Zellen zu pelletieren, ernten Sie die undurchsichtige Zellschicht und überführen Sie es in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Bei 10 Millilitern PBS, die 10% FBS enthalten, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1020 mal G für 10 Minuten, um die Zellen zu pelletieren.

Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie einen Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu. Nach der fünfminütigen Inkubation auf Eis bei PBS mit 10 % FBS zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 1020 mal G, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter Endothelzellexpansionsmedium hinzu, das mit 10 % FBS ergänzt ist.

Säen Sie acht Komma null Millionen Zellen pro Well für jede kollagenkodierte Schale. Induzieren Sie die menschlichen und ätherischen koloniebildenden Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, und züchten Sie die Zellen für weitere Experimente bis zur siebten Passage. Als nächstes beschichten Sie die Gradienten-Nanomusterplatten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Milliliter Nullkomma-Ein-Prozent-Proteinbeschichtungslösung in PBS.

Herstellung einer Suspension von humanen ECFC aus der Kulturschale durch eine Standard-Zellteilungsmethode unter Verwendung von Trypsin. Nach dem Verdünnen der Zellsuspension, um die gewünschte Konfluenz zu erreichen, säen Sie die humanen ECFCs in einer flachen Kontrolle auf die Gradienten-Nanomusterplatten auf. Kultivieren Sie die Zellen auf flachen oder gradienten Nanomusterplatten für zwei Tage im Inkubator.

Diese Bilder zeigen die AAO-Formen, die unter drei verschiedenen Bedingungen für die Gießverbreiterung hergestellt wurden. Eine Seite mit der kürzesten Zeit, die in die Phosphorsäure-Ätzlösung eingetaucht ist, hat die kleinste Porengröße, während die andere Seite mit der längsten Zeit in der Ätzlösung die größte Porengröße aufweist. Da das Nanomuster durch das thermische Prägeverfahren auf das Polystyrol übertragen wurde, werden Nanosäulenstrukturen auf der Polystyroloberfläche erzeugt und der Größengradient der AAO-Form in Nanomusterplatten beibehalten.

Die konfluenten humanen ECFCs zeigten die typische kopfsteinpflasterartige Morphologie einer Kolonie, die unter einem Phasenkontrastmikroskop leicht unterschieden werden kann. Nach zweitägiger Kultivierung von humanen ECFCs auf der Ebene in Gradienten-Nanomusterplatten wurde in Zellen, die auf GP 120 bis 200 kultiviert wurden, ein signifikantes Wachstum von Filopodien beobachtet. Umgekehrt wurde bei GP 200 bis 280 bzw. GP 280 bis 360 im Vergleich zur flachen Steuerung keine nennenswerte Veränderung beobachtet.

Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Reaktion der Zellen je nach Größe der Oberflächennanostruktur unterschiedlich ist. Es gibt viele Schritte, um eine Nanomusterplatte herzustellen. Es kann also anfangs kompliziert sein, aber wenn Sie es einmal gemeistert haben, werden Sie ohne Schwierigkeiten Muster mit dem gewünschten Größengradienten erhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gradienten-Nanomusterplatten herstellt und wie man auf der Nanomusterplatte zu Menschen und der alberneren koloniebildenden Serie kultiviert. Auch diese Methode steht für verschiedene Arten von Serien zur Verfügung. Diese Methode kann eine Brücke zwischen Materialtechnik und Biotechnologie schlagen, die dazu beitragen wird, die Injektionen von Zellen und die Oberflächen-Nanotopographie zu verstehen.