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Methodenartikel

Modellierung von Osteosarkom mit Li-Fraumeni-Syndrom, die Patienten abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen

8.4K Ansichten

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DOI:

10.3791/57664

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13. Juni 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth, 3Department of Musculoskeletal Oncology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4Women's Health Institute, Cleveland Clinic Foundation, 5Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for the Prevention of Human Diseases, The University of Texas Health Science Center at Houston, 6Center for Precision Health, School of Biomedical Informatics and School of Public Health, The University of Texas Health Science Center at Houston

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von Li-Fraumeni Syndrom (LFS) Patienten abgeleiteten Fibroblasten, Differenzierung der iPSCs über mesenchymalen Stammzellen (MSCs), Osteoblasten und Modellierung in vivo Tumorgenese mit LFS Patienten abgeleitet Osteoblasten.

Zusammenfassung

Li-Fraumeni Syndrom (LFS) ist eine autosomal dominant erblichen Krebs-Erkrankung. Patienten mit LFS sind anfällig für eine verschiedene Art der Tumoren, darunter Osteosarkom--eines der am häufigsten primären nicht-hämatologischen malignen Erkrankungen im Kindes- und Jugendalter. LFS bietet daher eine ideale Vorlage um diese Bösartigkeit zu studieren. Unter Ausnutzung der iPSC Methoden, LFS-assoziierten Osteosarkom erfolgreich durch Differenzierung LFS Patienten iPSCs mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und dann Osteoblasten--die Zellen der Ursprung für Osteosarkome modelliert werden kann. Diese LFS Osteoblasten rekapitulieren Onkogene Eigenschaften des Osteosarkom, bietet ein attraktives Modellsystem für die Abgrenzung der Pathogenese der Osteosarkom. Diese Handschrift zeigt ein Protokoll für die Erzeugung von iPSCs von LFS Patienten Fibroblasten, Differenzierung der iPSCs zu MSCs, Differenzierung von MSCs Osteoblasten und in Vivo Tumorgenese mit LFS Osteoblasten. Diese iPSC Krankheitsmodell kann erweitert werden, um potenzielle Biomarker oder therapeutische Ziele für die LFS-assoziierten Osteosarkom zu identifizieren.

Einleitung

Zwischen 2006 und 2007 führte mehrere bahnbrechende Erkenntnisse aus den Labors von Dr. Shinya Yamanaka und James A. Thomson zur Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)1,2,3. Durch Reprogrammierung von somatischen Zellen mit definierten transcriptional Faktoren zu Form iPSCs, konnten Forscher Zellen mit wichtigen Eigenschaften nämlich generieren, Pluripotenz und Selbsterneuerung, die zuvor nur galt bestehen in humanen embryonalen Stammzellen (hESC). iPSCs konnte von jedem Individuum oder Patienten generiert werden und mussten nicht aus Embryonen, erheblich erweitern das Repertoire der verfügbaren Krankheiten und Hintergründe für die Studie abgeleitet werden. Seitdem wurden Patienten abgeleitet iPSCs zur rekapitulieren des Phänotyps der verschiedenen menschlichen Krankheiten, Alzheimer-Krankheit4 und Amyotrophe Lateralsklerose5 bis lange QT-Syndrom6,7, 8.

Diese Fortschritte in der iPSC-Forschung haben auch neue Wege für die Krebsforschung eröffnet. Mehrere Gruppen haben kürzlich Patient iPSCs zu Krebs Modellentwicklung unter einem anfälligen genetischen Hintergrund9,10,11, mit erfolgreichen Anwendung zeigte bisher in Osteosarkom9verwendet, Leukämie10,11,12, und Darmkrebs13. Obwohl Krebs iPSC-abgeleitete Modelle noch in den Kinderschuhen sind, zeigten sie großes Potenzial in Phenocopying krankheitsassoziierten Malignome, verdeutlichend pathologische Mechanismen und therapeutische Verbindungen14zu identifizieren.

Li-Fraumeni Syndrom (LFS) ist eine autosomal dominant erblichen Krebs-Erkrankung, verursacht durch TP53 Germline Mutation15. Patienten mit LFS sind anfällig für eine verschiedene Art der Malignome einschließlich Osteosarkom, machen LFS iPSCs und ihre abgeleiteten Zellen besonders gut geeignet für das Studium dieser Bösartigkeit16. Eine iPSC-basierte Osteosarkom-Modell wurde gegründet im Jahr 2015 mit LFS Patienten abgeleitet iPSCs9 anschließend an mesenchymalen Stammzellen (MSCs) differenziert und dann zu Osteoblasten, die aus Zellen des Osteosarkom. Diese LFS Osteoblasten rekapitulieren Osteosarkom-assoziierten osteogene Differenzierung Mängel und Onkogenen Eigenschaften demonstriert Modells Potenzial als "Knochentumor in einer Schale" Plattform. Interessanterweise genomweite Transkriptom-Analysen zeigen Aspekte ein Osteosarkom-gen-Signatur in der LFS Osteoblasten und die Features von diesem AKE Genexpressionsprofil korrelieren mit einer schlechten Prognose in Osteosarkom9, unter Angabe der Potenzial der LFS iPSCs Krankheitsmodelle, Funktionen von klinischer Relevanz zu offenbaren.

Diese Handschrift enthält eine detaillierte Beschreibung der LFS Patienten abgeleitet iPSCs, Modell Osteosarkom Verwendung. Es wird ausführlich auf die Generation der LFS iPSCs, Differenzierung der iPSCs MSCs und dann zu Osteoblasten und Nutzung eines in Vivo Xenograft-Modells mit LFS Osteoblasten. Das LFS Krankheitsmodell umfasst mehrere Vorteile, vor allem die Möglichkeit, unbegrenzte Zellen in allen Entwicklungsstadien für mechanistische Studien, Biomarker identifizieren und Drogen-screening-9,14Osteosarkom zu generieren, 16.

Zusammenfassend bietet das LFS iPSC-basierte Osteosarkom Modell ein attraktives komplementäre System für Osteosarkom Forschung voranbringen. Diese Plattform bietet auch ein Proof-of-Concept für die Krebs-Modellierung mit iPSCs Patienten abgeleitet. Diese Strategie beschrieben leicht erweiterbar auf Modell Malignome mit anderen genetischen Erkrankungen mit Krebs Prädispositionen verbunden.

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Protokoll

Diese Arbeit wurde von der University of Texas Health Science Center in Houston (UTHealth) Animal Welfare Committee genehmigt. Die Experimente werden durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit den Normen festgelegten UTHealth Zentrum für Labormedizin Tier & Care (CLAMC), der American Association für Laboratory Animal Care (AAALAC International) anerkannt ist. Die Versuchspersonen in dieser Studie fallen unter Szenario ein ("No menschlichen Themen Research"), entsprechend den Festlegungen der NIH-SF424 Dokumentation. Deshalb braucht er keine Genehmigung durch UTHealth Humanforschung Ethikkommission.

1. Generation der LFS iPSCs (Abbildung 1A)

  1. Am Tag-2, Platte 2 x 104 LFS Patienten Fibroblasten in einem Brunnen von einem 6-Well-Platte und Kulturzellen mit Fibroblasten Medium (Tabelle 1) bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 Inkubator. Sicherstellen Sie, dass die Fibroblasten Zusammenfluss von 50-60 % am Tag der Transduktion (Tag 0) erreichen.
  2. Sendai-Virus Transduktion am Tag 0 ausführen. Um dies zu tun, ersetzen Sie die abgebrannte Medium mit vorgewärmten Fibroblasten Medium. Tauen Sie die kommerzielle Sendai Virus Umprogrammierung kit (siehe Tabelle der Materialien), auf dem Eis auf. LFS Fibroblasten mit gemischten Sendai Viren nach den Anweisungen des Herstellers zu infizieren.
  3. Wartung der transduced Zellen in Fibroblasten Medium (Tag 1-6):
    1. Am Tag 1, 24 h nach Transduktion entfernen Sie die Fibroblasten Medium, die restlichen Sendai-Virus zu und ersetzen Sie es mit 2 mL frische Fibroblasten Medium. Kultur die transduced Fibroblasten bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 Inkubator.
    2. Ändern Sie das Medium mit dem Fibroblasten Medium jeden zweiten Tag ab dem Tag 2-6.
  4. Wartung der transduced Zellen in der Feeder-Kultur-Bedingung (Tag 7-28):
    1. Bereiten Sie bestrahlten CF1 Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) Kultur Gerichte an Tag 6. Um diesen Mantel zu tun Aspirieren sechs 100 mm Gewebekultur Schalen durch Zugabe von 5 mL 0,1 % Gelatine auf jede Platte bei Raumtemperatur für 30 min. 0,1 % Gelatine nach der Beschichtung.
    2. MEFs aus flüssigem Stickstoff Container entfernen. Tauen Sie MEFs mit dem im Handel erhältlichen Auftauen-System nach den Anweisungen des Herstellers. Platte die Zellen auf die Gelatine beschichtete Platten mit MEF/MSC Kulturmedium (Tabelle 1) bei einer Aussaatdichte von rund 6,7 x 105 Zellen pro 100 mm Gewebe Kulturschale.
    3. Impfen die transduced Zellen auf MEF-Platten (Tag 7): Trypsinize die transduced Zellen mit 0,25 % 1 mL Trypsin-EDTA pro 100 mm Schale für 2-4 min bei Raumtemperatur. Trypsin mit 9 mL Fibroblasten Medium zu neutralisieren. Übertragung an konischen Rohren und Zentrifuge Zellen bei 230 X g bei 37 ° C für 4 min. Platte transduced Fibroblasten auf sechs MEF Gerichte an Tag 6 und Kultur sie in 8 mL Fibroblasten Medium pro Schale.
      Hinweis: Die Konfluenz der MEFs liegt etwa 20 % vor der Aussaat ausgestrahlt Zelle auf MEF-Platten.
    4. Am 8. Tag verwerfen die Fibroblasten-Medium und ersetzen mit hESC Medium (Tabelle 1).
    5. Warten Sie, bis das Aufkommen von iPS Klone von Tagen 9-28 (Abbildung 1C). Das abgebrannte hESC Medium täglich verändern und die Entstehung von iPS Klone unter dem Mikroskop zu überwachen. Warten Sie iPSCs Klone groß genug, um mit dem bloßen Auge beobachtet werden und fahren Sie anschließend mit iPS-Klone in Feeder-freie Kultur Zustand zu erweitern.
  5. Ausbau der aufgetauchten iPS-Klone in Feeder-freie Kultur Zustand (Tag 29-79 ~ 99):
    1. Um die Matrix-beschichtete Platte vorzubereiten, Mantel eine 48-Well-Platte mit 120 µL der Basalmembran Matrix Beschichtungslösung (Tabelle 1) pro Bohrloch. Stellen Sie sicher die Basalmembran Matrix Beschichtungslösung deckt den Brunnen und die Kultur Gericht Oberfläche überzieht. Lassen Sie es bei Raumtemperatur 1 h. Aspirat Beschichtungslösung unmittelbar vor der Anwendung, und fügen Sie 250 µL hESC Medium pro Bohrloch mit 2 µM ROCK Inhibitor Thiazovivin.
    2. Am 28. Tag Aspirieren der abgebrannten hESC-Medium und waschen iPS Klone mit 1 X DPBS. Sichtbare iPS Klone mit 1 mL Pipettenspitze und Übertragung in einen Brunnen von einem behandelten 48-Well-Platte (Schritt 1.4.1) abholen. Samen einer Kolonie pro Bohrloch des 48-Well-Platte.
    3. Zentrifugieren Sie die Platte bei 230 X g für 4 min um die Zellhaftung zu erleichtern. Kultur iPS Klone bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 Inkubator.
    4. Am nächsten Tag (Tag 29), entfernen Sie das abgebrannte hESC-Medium und fügen Sie 250 µL des Mediums im Handel erhältlichen iPSC in jede Vertiefung hinzu.
    5. Pflegen iPS Klone bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 Inkubator und Änderung der iPSC-Medium jeden zweiten Tag.
    6. Wenn iPS Klone Zusammenfluss von 85 % erreichen, Subkultur Zellen bei einer 01:10 Verhältnis von Kulturkreis. Fügen Sie 60 µL der kommerziellen passaging Lösung zu trennen die Zellen, bei 37 ° C für 3 min inkubieren.
    7. Samen Sie die Hälfte der freistehende iPSCs auf eine Basalmembran Matrix-beschichtete 12-Well-Platte in 1 mL hESC Medium mit 2 µM ROCK Inhibitor Thiazovivin. Kultur iPS Klone in einer 12-Well-Platte mit 1 mL des Mediums im Handel erhältlichen iPSC pro Brunnen und Subkultur iPSCs am eine 01:10 Verhältnis bis zum Durchgang 10 erreichen.
      Hinweis: iPSCs sind Sub kultiviert alle 5-7 Tage bei einem 01:10 Verhältnis. Es dauert bis zu 10 Wochen für iPS-Klone, Durchgang 10 zu erreichen. iPSC Charakterisierungen einschließlich Zellmorphologie, Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) und der Ausdruck der Pluripotenz Faktoren und hESC-Marker, können untersucht werden, nach der Bestätigung der Entfernung von Sendai-Virus in iPSCs (in der Regel demonstriert nach rund 10 Passagen) (Abbildung 1 b-E). Antikörper und Primer Informationen für iPSC Charakterisierung sind in Tabelle 2 und 4enthalten.

(2) Differenzierung der LFS iPSCs an mesenchymalen Stammzellen (MSCs) (Abbildung 2A)

  1. Kultur-iPSC-Klone auf MEF-Platten für mindestens 2 Wochen (Tag ~-14-0): die MEF Gerichte (100 mm Gewebekultur Schalen) wie oben beschrieben (1.3.1 - 1.3.2). Pflegen Sie iPSCs hESC Medium und verändern Sie Medium täglich. Wann immer iPSCs erreichen 90 % Zusammenströmen, Subkultur iPSCs von 01:10 Verdünnung.
  2. Entfernung von MEFs aus iPSCs (Tag 0):
    1. Nach Aufrechterhaltung iPSCs auf MEFs für 2 Wochen, Kultur iPSCs in 100 mm Gewebekultur Schalen bis Zellen erreichen 80-90 % Zusammenfluss. Entfernen Sie das abgebrannte hESC-Medium zu und waschen Sie iPSCs mit 5 mL 1 X DPBS. Fügen Sie 1 mL der Zelle Ablösung Lösung lösen die Zellen und bei Raumtemperatur 3 min inkubieren.
    2. Fügen Sie 9 mL Kulturmedium MEF/MSC auf der Platte die Zellaktivität Ablösung Lösung zu neutralisieren und die freistehenden Zellen auf ein neues 100 mm Gewebekultur Gericht ohne jede Beschichtung übertragen.
    3. Inkubation der Zellen bei Raumtemperatur für 30 min erlauben die MEFs an der Platte befestigen.
    4. Den überstand enthält ungebundene iPSCs und Zentrifuge bei 230 X g bei 4 ° C für 4 min sorgfältig zu sammeln.
      Hinweis: Achtlos Spülung Platte unten führt zur Ablösung der MEFs.
  3. Differenzierung der iPSCs in Richtung MSCs (Tag 0 - 28):
    1. Drei Brunnen von einem 6-Well-Platte mit 1 mL 0,1 % Gelatine pro Bohrloch bei Raumtemperatur für 30 min zu beschichten.
    2. 2.2.4 entnehmen Sie den überstand die gesammelten iPSCs.
    3. Aufschwemmen Sie iPSCs in 6 mL MSC Differenzierung Medium (Tabelle 1) und Samenzellen in den drei beschichteten Vertiefungen mit 2 mL pro Bohrloch (Tag 0).
    4. Ändern Sie das MSC Differenzierung Medium alle zwei Tage um ungebunden und/oder tote Zellen (Tag1 - 28) zu entfernen.
  4. Reifung der iPSC-abgeleitete MSCs (Tag 28-45):
    1. Entfernen Sie das abgebrannte MSC Differenzierung Medium zu und waschen Sie Zellen mit 1 mL 1 X DPBS.
    2. Trypsinize MSCs mit 0,25 % 0,5 mL Trypsin-EDTA pro Bohrloch bei Raumtemperatur 3 Minuten lang.
    3. Neutralisieren Sie Trypsin zu, indem 1,5 mL des Kulturmediums MEF/MSC und sammeln Sie MSCs aus drei Brunnen in einem 15 mL konische Röhrchen zu. Zentrifuge bei 230 X g bei 4 ° C für 4 Minuten.
    4. Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie MSCs in 3 mL Kulturmedium MEF/MSC und Platte auf einer 60 mm 0,1 % Gelatine beschichtete Platte (Tag 28).
    5. MSCs-Kultur in MEF/MSC Kulturmedium und Medium alle zwei Tage verändern. Wenn die Zellen erreichen 100 % Zusammenströmen, Subkultur MSCs im Verhältnis 1:3 mit 0,25 % Trypsin-EDTA.
      Hinweis: Die MSCs anzeigen eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie (Abb. 2 b). Wenn MSCs in einer hohen Dichte wachsen, können längliche MSCs eine Wirbel-Muster (Abb. 2 b) bilden.
    6. Führen Sie die immunofluorescent beflecken, zum iPSC-abgeleitete MSCs bewerten anhand MSC oberflächenmarker CD44, CD73, CD105 und CD166 (Abbildung 2).
      Hinweis: Die Verdünnung der Antikörper sind in Tabelle 2dargestellt. Immunofluorescent Färbung von lebenden Zellen erfolgt nach Angaben des Herstellers.
    7. Nach der Bestätigung erweitern Sie MSCs im Verhältnis 1:3 in 100 mm Gewebekultur Schalen. Einfrieren, Fläschchen (3 Ampullen pro 100 mm Gewebe Kulturschale) mit dem Einfrieren Medium mit 10 % DMSO und 90 % FBS.
      Hinweis: Um die MSC-Bevölkerung bereichern, MSCs können sortiert werden mit CD105+, CD24-Kriterien von Flow Cytometry9,17. iPSC-abgeleitete MSCs differenziert mit der PDGF-AB-basierte Methode allgemein sind für 2-3 Monate in der Kultur ohne Verlust der MSC Identität9pflegbar. Frieren Sie MSCs aus einer frühen Passagenanzahl nach der Bestätigung MSC Eigenschaften.

3. Differenzierung der LFS MSCs auf Osteoblasten (Abbildung 3A)

  1. Vorbereitung der MSCs osteogene Differenzierung (Tag-1)
    1. Um eine ausreichende Menge von Zellen um das osteogene Differenzierung Protokoll abzuschließen zu gewährleisten, beginnen Sie mit MSCs in 100 mm Gewebekultur Schalen zu 95 % Zusammenfluss kultiviert. Entfernen Sie das abgebrannte Kulturmedium zu und waschen Sie MSCs mit 5 mL 1 X DPBS.
    2. MSCs mit 1 mL Trypsin-EDTA 0,25 % pro 100 mm Schale bei Raumtemperatur 3 min trypsinize. Um sicherzustellen, dass die Zellen nicht mehr als trypsiniert sind, Trypsinization zu stoppen, wenn 50 % der Zelle Abteilung unter dem Mikroskop beobachtet wird.
    3. Neutralisieren Sie Trypsin zu, indem 9 mL Kulturmedium MEF/MSC und sammeln Sie MSCs 3 Brunnen in einem 15 mL konische Rohr. Zentrifuge bei 230 X g bei 4 ° C für 4 Minuten.
    4. Aspirieren des Überstands, Aufschwemmen MSCs in 5 mL Medium MSC und die Anzahl der Zellen durch eine Hemocytometer.
    5. Korrekte Kennzeichen des MSCs auf einem Kultur-Teller.
      Hinweis: Die Details der Zellzahlen 12-Well-Platte, 6 Well-Platte und 100 mm Gewebekultur Schalen sind in Tabelle 3zusammengefasst.
  2. Induktion der osteogene Differenzierung von Osteoblasten Differenzierung Medium (ODM) (Tabelle 1) (Tag 0 - 24):
    1. Aspirieren MEF/MSC Kulturmedium und ersetzen Sie durch die richtige Lautstärke der ODM (1 mL, 2 mL und 8 mL für jedes gut 12-Well-Platte, jede Vertiefung des 6-Well-Platte und Gewebekultur 100 mm Schale), MSCs auf Osteoblasten (Tag 0) zu unterscheiden.
    2. Aspirieren Sie der abgebrannten ODM und ersetzen Sie durch die richtige Lautstärke der ODM alle zwei Tage während des Prozesses osteogene Differenzierung.
    3. Führen Sie die alkalischen Phosphatase (AP) und Färbung zu um erkennen, Knochen-assoziierten alkalische Phosphatase produziert von Preosteoblasts und mineralische Ablagerungen produziert von Alizarin rot S (ARS) Reifen Osteoblasten, bzw. am Tag 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 und 24 ( Abb. 3 b).
      Hinweis: AP Färbung und ARS Färbung erfolgt mit handelsüblichen Kit nach Hersteller-Protokolls.
    4. Untersuchen der Ausdruck Stufen preosteoblast und Reife Osteoblasten Marker (ALPL und COL1A1 für Preosteoblasts; PTH1R und BGLAP für Reifen Osteoblasten) durch qRT-PCR (Abbildung 3).
      Hinweis: Nach Tag 9 osteogene Differenzierung dürfte Positive AP Färbung und positive ARS Färbung nach Tag 21 osteogene Differenzierung erwartet werden. Die MSCs in MEF/MSC Nährmedium wachsen können als Negativkontrolle von AP zu beflecken und ARS Färbung serviert werden.

(4) die Xenograft Modell zur In-Vivo Tumorgenese der LFS MSC abgeleitet Osteoblasten (Abbildung 4a).)

  1. Differenzierung der LFS MSCs auf Osteoblasten:
    1. Samen 3-4.5 x 105 MSCs in 100 mm Gewebe Kulturschale. Bereiten Sie fünf Gerichte für eine subkutane Injektion.
    2. Kultur-MSCs in ODM MSCs auf Osteoblasten zu unterscheiden, wie in 3.2 bis zum Tag 14 beschrieben.
  2. Vorbereitung der differenzierten Osteoblasten für subkutane Injektion:
    1. Zur Vorbereitung der Osteoblasten Ablösung Lösung (Tabelle 1) lösen Sie auf, 1 g Typ II Kollagenase in 1.000 mL αMEM Medium, die Kollagenase II Lösung (1 mg/mL) zu machen. Halten Sie die Kollagenase II Lösung bei-20 ° C. Mischen Sie 0,25 % Trypsin-EDTA und Kollagenase II Lösung im Verhältnis 1:1 die Osteoblasten Ablösung Lösung machen.
    2. Entfernen Sie der abgebrannten ODM und waschen Sie differenzierte Osteoblasten mit 5 mL 1 X DPBS pro 100 mm Schale.
    3. Fügen Sie 1,5 mL der Osteoblasten Ablösung Lösung pro 100 mm Schale hinzu und inkubieren Sie Gerichte bei 37 ° C für 30 min. untersuchen und gewährleisten Sie die Osteoblasten Ablösung durch Mikroskopie zu.
    4. Neutralisieren Sie die Osteoblasten Ablösung Lösung von ODM und sammeln Sie die freistehenden Osteoblasten in einem 50 mL konische Röhrchen. Zentrifuge bei 230 X g bei 4 ° C für 5 Minuten.
    5. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen Zellen in 25 mL ODM Medium. Durchlaufen Sie die Zellen ein 70 µm Zelle Sieb um aggregierte Zellen zu entfernen. Zählen Sie die Zellzahlen unter Verwendung eines Hemocytometer.
    6. 4 min. 1 x 107 Osteoblasten pro subkutane Injektion und Zentrifuge Zellen bei 230 X g bei 4 ° C vorbereiten.
    7. 1 x 107 Osteoblasten in 50 µL eiskalte 1 Aufschwemmen X DPBS. Mix differenziert Osteoblasten mit 50 µL Phenol-rot frei Basalmembran Matrix (Osteoblasten Federung und Basalmembran Matrix wurden im Verhältnis 1:1 gemischt) und Osteoblasten auf dem Eis vor der Injektion zu erhalten.
  3. In Vivo Xenograft Tumor Modell der Osteoblasten LFS MSC abgeleitet:
    1. 8 Wochen alten weibliche immungeschwächte NU/NU-Mäusen in einer Kammer, die Lieferung von 5 % (V/V) inhaliert Isofluran in 1 L/min Sauerstoff (bereitgestellt von CLAMC) zu betäuben. Nachdem das Tier Liegerad wird, die Narkose Liefersystem zu wechseln die bugnase, Lieferung von 2 % (V/V) inhaliert Isofluran in 200mL/min Sauerstoff (bereitgestellt von CLAMC) Überwachen Sie die Tiefe der Narkose durch die Überprüfung der Hornhaut und Pedal Reflexe, um die Mäuse zu machen sind ausreichend betäubt und nicht leiden unter Beschwerden während des Verfahrens.
    2. Desinfizieren Sie den Bereich mit wechselnden Abstriche von Chlorhexidin und 70 % Isopropanol injiziert werden. Verwenden Sie 26 G-Nadel, um subkutane Injektion der Basalmembran Matrix vermischt LFS Osteoblasten in einer Seite der Hinterbeine von 8 Wochen alten immungeschwächten NU/NU Mäusen (Abb. 4A) durchzuführen.
    3. Durchführung von wöchentlichen Palpation an Injektionsstellen für Wachstum der subkutane knotige dichten, um Mäuse zu überwachen. Tumorbildung kann etwa 6 bis 10 Wochen nach der Injektion (Abbildung 4 b) beobachtet werden.
    4. Einschläfern Sie die Mäuse von Kohlendioxid Erstickung Methode gefolgt von zervikale Dislokation. Die entwickelten Tumoren zu sezieren. Bestimmen Sie den Tumorgrad und Differenzierung Index, Preosteoblasts und Reife Osteoblasten durch verschiedene Färbung Methoden (z. B. Färbung Hämatoxylin und Eosin (H & E), Picro Sirius rote Färbung und von Kossa Färbung bzw.).

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Ergebnisse

Dieses Protokoll stellt die Verfahren einschließlich der LFS iPSC-Generation, MSC Differenzierung Osteoblasten Differenzierung und in Vivo Tumorgenese Assay mit LFS MSC abgeleitet Osteoblasten.

Schema für die Generation der LFS iPSCs von Fibroblasten durch die Verwendung eines handelsüblichen Sendai Virus Umprogrammierung Kit ist in Figur 1Agezeigt. Sendai-Virus-basierte Lieferung der Yaman...

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Diskussion

Um höhere Effizienz der MSC-Differenzierung zu erreichen, sind mehrere Aspekte entscheidend. Einer ist der Kultur-Zustand des iPSCs vor Einleitung eines MSC Differenzierung. Das Protokoll präsentiert im Manuskript basiert auf früheren Studien 9,17. iPSCs müssen für mindestens 2 Wochen auf MEFs kultiviert werden. IPSCs in guter Erhaltung sind Bedingungen auf MEFs für Zellen, auf die Gelatine beschichtete Platte für MSC Differenzierung Anhängen von entscheidender B...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

R. Z. wird durch UTHealth Innovation für Krebs Prävention Ausbildung Programm Pre-Doctoral Forschungsstipendium (Krebs-Prävention und Forschung Institute of Texas RP160015 gewähren) unterstützt. J.t. stützt sich auf die Ke Lin Programm der ersten Affiliated Hospital von Sun Yat-Sen-Universität. D.-f.l. ist der CPRIT Gelehrte in der Krebsforschung und vom NIH Weg zu Unabhängigkeit Award R00 CA181496 und CPRIT-Award-RR160019 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kunststoff
100 mm DishCorning430107
60 mm DishCorning430166
6-Well-PlatteFalcon353046
12-Well-PlatteFalcon353043
48-Well-PlatteFalcon353078
1 mL PipettenspitzeUSA Scientific1111-2721
200 & micro; L PipettenspitzeUSA Scientific1111-0706
10 µ L PipettenspitzeUSA Scientific1111-3700
5 mL Serologische PipetteSARSTEDT86.1253.001
10 mL Serologische PipetteSARSTEDT86.1254.001
25 mL Serologische PipetteSARSTEDT86.1685.001
50 mL Röhrchen, PPSARSTEDT62.547.100
15 mL Röhrchen, PPSARSTEDT62.554.100
Kulturmaterialien und Reagenzien
CytoTune- iPS 2.0 Sendai ReprogrammierungskitInvitrogenA16517Kommerzielles Sendai Virus Reprogrammierungskit
Corning hESC-qualifizierte MatrixCorning354277Basalmembranmatrix
CF1 MEFs, bestrahltThermoFisherA34180
DMEMSigma-AldrichD5671
DMEM/F12Corning10-090-CV
α MEMCorning10-022-CV
StielMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368Kommerzielles iPSC Medium
KnockOut DMEM/F-12ThermoFisher12660012
FBS Opti-GoldGenDEPOTF0900-050
KnockOut SerumersatzThermoFisherA3181502
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
MEM Nichtessentielle AminosäurenCorning25-025-CI
L-Glutamin-LösungSigma-AldrichG7513
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Humane FGF-basische (bFGF)PEPROTECH100-18B
Rekombinante Humane PDGF-ABPEPROTECH100-00AB
β-GlycerophosphatSigma-AldrichG9422
DexamethasonSigma-AldrichA4902
AscorbinsäureSigma-AldrichA5960
Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 1x (DPBS)Corning21-031-CV
StemMACS Passaging Solution XFMiltenyi Biotec130-104-688Kommerzielle Haftlösung
Accutatse Zellablösung, Corning25-058-CIZellablösung
Thiazovivin (ROCK-Inhibitor),Calbiochem420220
0,25 % Trypsin-EDTA-LösungSigma-AldrichT4049
Kollagenase, Typ II,  ThermoFisher17101015
humane NANOG-AntikörperR& D SystemAF1997
OCT4 Antikörper (H-134)Santa Cruzsc-9081
Mensch/Maus SSEA-4 PE-konjugierter AntikörperR& D SystemFAB1435P
Alexa Fluor 555 Maus Anti-Human TRA-1-81 AntigenDB Biosciences560123
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ziege IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-545-003
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-545-144
PE Maus Anti-Human CD105eBioscience12-1057-42
FITC Maus Anti-Human CD44DB Biosciences555478
PE Maus Anti-Human CD73DB Biosciences550257
PE Maus Anti-Human CD166DB Biosciences560903
FITC Maus Anti-Human CD24DB Biosciences555427
DonkeySerum Jackson ImmunoResearch017-000-121
ZiegenserumJackson ImmunoResearch005-000-121
Alkalisches Phosphatase-Färbekit IIStemgent00-0055
Alizarinrot SSigma-AldrichA5533
TRIzol-ReagenzThermoFisher15596018
ChloroformThermoFisherC298-500
2-PropanolThermoFisherA416-4
Ethanol, absolut,ThermoFisherBP28184
DNase I, RNase-frei (1 U/&mikro; L)ThermoFisherEN0521
iScript cDNA-SynthesekitBioRad1708891BUN
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708884
Matrigel Matrix High Concentration (HC), phenolrotfreiesCorning354262
1 mL Slip Tip Spritze, 26 Gauge x 5/8 ZollDB Biosciences309597
, , , ,

Referenzen

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