Die Pflanze-Infektion-Test: Spray und Wunde-vermittelten Inokulation mit Pflanzen Pathogen Magnaporthe Grisea

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Pflanze Virulenz mit dem Werk Erreger testen Magnaporthe Grisea. Dieser Bericht wird dazu beitragen, das große Screening von Pathotypen von Pilzen Isolaten und dienen als ein ausgezeichneter Ausgangspunkt für das Verständnis der resistenten Mechanismen der Pflanzen während der molekularen Züchtung.

Zusammenfassung

Pflanzen besitzen ein leistungsstarkes System zur Selbstverteidigung gegen potenzielle Bedrohungen durch pathogene Pilze. Für landwirtschaftlich wichtigen Pflanzen jedoch aktuelle Maßnahmen gegen solche Erreger zu konservativ erwiesen und somit nicht ausreichend wirksam, und sie können möglicherweise aufwerfen Umweltrisiken. Daher ist es äußerst notwendig, um Host-Resistenzfaktoren bei controlling Pflanzenkrankheiten natürlich durch die Identifizierung von resistenten Keimplasma, die Isolierung und Charakterisierung von Genen und der molekularen Züchtung identifizieren der resistenten Sorten. In dieser Hinsicht gibt es brauchen, um eine präzise, schnelle und großflächige Impfung Methode zum Züchten und entwickeln Pflanze-Resistenz-Gene zu etablieren. Der Reis pilzliche Erreger Magnaporthe Grisea Ursachen schwere Krankheitssymptome zu sprengen und Verluste ergeben. Vor kurzem, hat M. Grisea als Modellorganismus zur Erforschung der Mechanismen der Pflanze-Pilz Pathogen Interaktionen entstanden. Daher berichten wir über die Entwicklung einer Pflanze Virulenz Testmethode, die spezifisch für M. Grisea. Diese Methode bietet für Spray Inokulation mit conidial Federung und verletzte Inokulation mit Myzel Würfel oder Wassertropfen conidial Aufhängung. Der entscheidende Schritt der Verwundung Inokulation Methode für freistehende Reis Blätter soll Wunden auf Pflanzenblättern, die vermeidet Störungen verursacht durch Host eindringwiderstand. Dieses Spray/Verwundung Protokoll trägt zur schnellen, genauen und groß angelegte Vorführung des Pathotypen M. Grisea -Isolate. Diese integrierte und systematische Anlage Infektion Methode wird als ein ausgezeichneter Ausgangspunkt für die Gewinnung einer breiten Perspektive Fragen in Pflanzenpathologie dienen.

Einleitung

Reis-Explosion, verursacht durch M. Grisea, ist eine der schwersten Krankheiten für Reis Sorten weltweit,^1,2. Der Prozess, durch den M. Grisea Wirtspflanzen infiziert, umfasst eine Konidien Produktion und Oberfläche Anlage, eine Konidien Keimung und Appressorium Bildung, eine Formation von penetrationspflocks und infektiöse Ascokarpen Differenzierung und Ausbreitung einer Krankheit ³. alle diese Stadien sind häufig in viele andere Pflanze pathogene Pilze, und in der Tat eine Blockade von jeder einzelnen Phase verhindert die Infektion von Wirtspflanzen. Aufgrund seiner wirtschaftlichen Bedeutung und genetische Lenkbarkeit entstanden M. Grisea als Modellorganismus zur Erforschung der Mechanismen der Pflanze-Pilz Pathogen Interaktionen^1,4. Daher wird studieren die Molekulare Grundlagen der diese Entwicklungsstadien in M. Grisea zur Aufklärung der molekularen Mechanismen Pilz Pathogenität und die Identifizierung von Kandidaten Zielgene für Screening und Gestaltung Roman Fungizide-⁵.

Jüngste Berichte über M. Grisea Infektion konzentrierten sich auf die molekularen Mechanismen der Pre Eindringen Stufen, vor allem die Conidiation, die Appressorium Bildung Eindringen Stöpsel und ansteckende Wachstum^{3, 6}. Daher ist es wichtig, ein detailliertes Protokoll um zu testen, M. Grisea Infektion zu entwickeln. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Methode für eine Infektion-Test, der Spray-vermittelte Infektion Assays mit einer conidial Federung und die Impfung von Wunden mit Myzel Stecker M. Griseanutzt. In diesem Bericht konzentriert sich das Protokoll auf die Kultur der Stämme, die Vorbereitung der Conidiation Lösung zum aufsprühen und das Myzel Stecker-vermittelten Inokulation von Pflanzen mit M. Grisea. Diese Schritte werden im folgenden ausführlich und eine schematische Darstellung zeigt den gesamten Workflow von der Methode beschrieben und eine typische Läsion sind in den Abbildungen 1 und 2, bzw. gezeigt.

Protokoll

1. Spray Inokulation mit einer Suspension von M. Grisea Konidien

1. Pilzartige Kultur für M.grisea
   1. Bereiten Sie die Haferflocken Tomate Agar (OTA) Kulturmedium für pilzstämmen.
   2. Gewicht von 30-50 g Haferflocken, fügen Sie diese auf 800 mL destilliertem/deionisiertes Wasser (DdH₂O) und Kochen Sie die Mischung für 30 min in den elektrischen Topf.
   3. Filtern Sie die gekochten Haferflocken Saft in das Becherglas mit einem Stück Gaze.
   4. Das Filtrat in den Becher 150 mL Tomatensaft und 20 g Agar-Agar hinzufügen und fügen Sie DdH₂O bis zu 1.000 mL.
2. Vorbereitung der experimentellen Materialien
   1. Ca. 50 Samen der Sorte Reis (Oryza Sativa) Lijiangxintuan-Heigu (LTH) DdH₂O für 3-d genießen oder Einweichen ca. 50 Samen der Gerste (Hordeum Vulgare cv Golden Promise) DdH₂O für ca. 1 d.
   2. Wickeln Sie die Samen von Reis oder Gerste in feuchte Gaze und Keimen sie auf feuchtem Filterpapier in etwa 30 Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm x 10 cm bei 28 ° C. Die Reis Samen keimen dauert ca. 2-3 d, Gerste Samen keimen ist etwa 2 d. Die Relative Luftfeuchtigkeit im Gewächshaus beträgt ca. 70 %.
   3. Pflanzen Sie der Setzlinge von Reis oder Gerste in Töpfen mit autoklaviert Blumenerde und Tränken und dann mit einer Schicht Vermiculite abdecken.
   4. Setzen Sie die Pflanzen in einem geeigneten Gewächshaus oder Wachstum Kabinett bei 25 ° C für ca. 1 ~ 2 Wochen.
   5. 3 Lagen Filterpapier in Kreisen mit sterile Chirurgische Schere (jeder Kreis hätte einen Durchmesser von 8 cm) schneiden und legen Sie sie auf 100 mm steril Kunststoffplatten.
   6. Jedes Gericht, das Filterpapier Einweichen fügen Sie DdH₂O hinzu.
   7. Sicherstellen Sie, dass das Filterpapier komplett nass ist aber fügen Sie kein zusätzliches Wasser hinzu.
   8. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit einer Vakuumpumpe.
   9. Platz 2 sterilen Zahnstocher in der Kulturschale Reis/Gerste unterstützen Blätter; Raum der Zahnstocher ~ 2-3 cm auseinander.
   10. Sammeln Sie die Blätter der Reis 2 Wochen nach der Aussaat der Samen zu oder nehmen Sie die Blätter der Gerste 7D nach der Aussaat der Samen.
   11. Mit 4 - 6 Blatt Sämlinge von Reis/Gerste, schneiden Sie den unteren Teil des Stammes an ~ 5 cm von der Spitze und sammeln Sie die Blätter zu.
3. Spray-Impfung-Protokoll
   1. Kultur der Pilzen Belastung für OTA-Platten in einem thermostatischen Inkubator (25 ° C) für ~ 4 d.
   2. Hinzugeben Sie ~ 2 mL DdH₂O mit einer 0,5 - 5 mL-Pipette auf jede 4 Tage alte Platte.
   3. Mit einem Impfschlinge Kratzen der myzelien von M. Grisea Wildtyp Stamm und der Mutante in myzelien Schutt.
   4. Die myzelien Trümmer zu sammeln und auf eine neue OTA-Platte übertragen. Nehmen Sie die myzelien Schutt und fönen in der sauberen Werkbank.
   5. Abdeckplatte mit 3 Schichten von Gaze um die Luftfeuchtigkeit benötigt für das Wachstum der Konidien in einem Gewächshaus bei 25 ° C am Tag (14 h) und 23 ° C in der Nacht (10 h) für 24-48 h zu gewährleisten.
   6. Jedes Gericht 2 mL DdH₂O hinzu und kratzen Sie die Konidien sanft mit sterilen Wattestäbchen, gefolgt von einer Filtration durch 2 Papierlagen Objektiv. Achten Sie darauf, dass Sie nicht an der Oberfläche des Kulturmediums.
   7. Übertragen Sie die Konidien Suspension in eine neue 50 mL-Tube mit einer 100-1.000 µL Pipette.
   8. Zentrifuge für 5 min auf ein Minimum von 5.000 x g bei 25 ° C.
   9. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Pellet um 2 x 10⁴ Konidien pro mL in einem 0,025 % (V/V) Tween-20 Lösung zu geben. Die Tween-20-Lösung ist in der Regel ca. 10-20 mL.
   10. Gießen Sie die Spore-Suspension in einer Hand Sprayer.
   11. Spay ca. 10 mL der conidial Suspension auf die Reis-Blätter der Sämlinge 2 Wochen alten Reis oder Gerste Blätter der Gerste 7-Tag-alte Sämlinge und inkubieren sie bei 25 ° C in einer dunklen, feuchten Kammer für ~ 24 h Spray die kontrollpflanzen mit 0,025 % (V/V) Lösung Tween-20.
   12. Übertragen Sie die Blätter in einem anderen feuchten Kammer unter Leuchtstofflampenlicht bei 25 ° C für eine Photoperiode von 12 h.
   13. Notieren Sie die Krankheitssymptome bei 5D nach der Inokulation. Untersuchen Sie die erkrankten Reis/Gerste Schaufeln von ~ 6 cm in der Länge. Die Evaluation standard entspricht dem scoring-System für Blast Widerstand des International Rice Research Institute (IRRI). Die Details der scoring-System für Blast Widerstand sind in Tabelle 1dargestellt.
   14. Fotografieren Sie die Blätter, die Infektion der getesteten Stämme zu bewerten. Die Infektion wurde durch die Anzahl der Läsionen pro 3,6 cm²bewertet.

(2) Verwundung Inokulation mit Myzel Würfel oder Tröpfchen Conidial Aussetzung des M. grisea

1. Kratzen Sie mit Hilfe einer anatomischen Nadel drei ca. 2-3 cm lange Wunden in den wichtigsten Venen der freistehende Reis/gerstenblättern; Achten Sie darauf, nicht um die Blätter zu durchdringen.
2. Die Geschabte Blätter auf Zahnstocher und sprühen Sie eine 0,02 % (V/V) Lösung Tween-20 auf den Blättern, eine Schicht von Tröpfchen zu bilden.
3. Geschnitten Sie 0,5 cm x 0,5 cm Myzel Stecker für jede M. Grisea Belastung (Wildtyp, mutierten, Ergänzung Stämme oder andere Test-Stämme) aus einer OTA-Platte.
4. Setzen Sie das Myzel Stecker oder 25 µL Tröpfchen von conidial Suspension auf die Verwundeten verlässt und inkubieren Sie die Blätter bei 25 ° C in einer feuchten Kammer für 3-8 d.
5. Untersuchen Sie die Läsionen bei 5-7 d nach Impfung. Die Methode der Untersuchung ist das gleiche wie für die Beimpfung Sprühverfahren (siehe Schritt 1.3.13.).
6. Prüfen Sie die erkrankten Reis/Gerste Schaufeln von ~ 6 cm in der Länge zu und zu fotografieren Sie, um die Infektion der getesteten Stämme zu bewerten. Die Infektion wurde durch die Anzahl der Läsionen pro 3,6 cm²bewertet.

Ergebnisse

Der gesamte Workflow für die Technik ist in Abbildung 1dargestellt. Die Pflanze-Infektion-Assays wurden an 14 Tage alten anfällig Reis Sämlinge durchgeführt (O. Sativa cv CO-39) oder anfällig für 7 Tage alten Gerste verlässt (H. Vulgare cv Golden Promise)^7,8,9. Um eine Infektion auf die Reis-Blätter zu testen, wurden eine conidial Suspension (1,0 x ...

Diskussion

Pflanze-Krankheit-Resistenz-Gene spielen eine wesentliche Rolle bei der Verhinderung von Infektionen durch Krankheitserreger, einschließlich pilzerreger^1,12. Reis-Explosion wurde als Modell zu verstehen, die Art des Erregers Bevölkerungsstrukturen und Werk Widerstand Gene⁴identifizieren eingesetzt. Daher ist es notwendig zu prüfen, die Krankheit Widerstand Genotyp und avirulenz Genotypen der wichtigsten Sorten der landwirtschaftlichen Pfla...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Filterpapier	Marke GE Healthcare (Schweden)
50-ml-Röhrchen	CORNING(Amercia)	430290
Zentrifuge	Eppendorf(Amercia)	5804R
Kulturschale	Thermofisher(Amercia)	150326
0,5-5 mL Pipette	Eppendorf
100-1000uL Pipette	Eppendorf	4920000083
Vakuumpumpe	Leybold	D25B
Präpariernadel	FST	26000-35
Inkubator	MEMMERT	PYX313
Impfring	Greiner Bio One	731175

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