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Methodenartikel

Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

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⸱

DOI:

10.3791/57688

⸱

19. Juni 2018

 ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Department of Bioengineering, University of California at San Diego

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine skalierbare Methode mit einer einfachen Kombination von Activin A und Lentivirus-vermittelten Id1-Überexpression, erste Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen zu generieren.

Zusammenfassung

Die Generation der große Mengen von funktionalen menschlicher pluripotenter Stammzellen gewonnen kardiale Stammväter und Herzzellen definierten Herz Bereich Ursprungs ist eine wichtige Voraussetzung für kardiale Zelltherapien und Krankheit Modellierung. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Id Gene notwendig und ausreichend, um erste Herz Bereich Vorfahren während der vertebrate Entwicklung angeben. Diese Differenzierung-Protokoll nutzt diese Erkenntnisse und nutzt Id1 Überexpression in Kombination mit Activin A als potente Angabe Hinweise, um erste Herz Bereich-wie (FHF-L) Vorfahren zu produzieren. Wichtig ist, differenzieren resultierende Stammväter ventrikuläre wie Kardiomyozyten effizient (~ 70 – 90 %). Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode, um (1) erzeugen Id1-überexprimierenden hPSCs und (2) skalierbare Mengen an cryopreservable FHF-L Stammväter und ventrikuläre wie Kardiomyozyten differenzieren.

Einleitung

Produktion in großem Maßstab menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs)-abgeleitete kardialen Vorläuferzellen und Herzzellen ist eine wichtige Voraussetzung für stammzellbasierte Therapien1, Modellierung,2,3 und die schnelle Charakterisierung der Krankheit neuartige Wege zur Regulierung kardialen Differenzierung4,5,6 und Physiologie7,8. Obwohl eine Reihe von Studien9,10,11,12,13,14haben,15 zuvor beschriebenen hocheffiziente kardialen Differenzierung Protokolle von hPSCs, hat keiner den Herzen Feld Ursprung des daraus resultierenden Kardiomyozyten, trotz der Identifizierung von molekularen Unterschiede zwischen Links angesprochen (erste Herz-Feld) und rechts (zweites Herz-Feld) ventrikuläre Kardiomyozyten16 und die Existenz von Herzen feldspezifischen angeborene Herzerkrankungen; d. h. hypoplastischen Linksherz-Syndrom17 oder Arrhythmogenic rechtsventrikuläre Dysplasie18. So, die Generation der kardialen Vorläuferzellen und Herzzellen definierten Herz Feld Herkunft aus hPSCs werden immer eine Notwendigkeit, um ihre Relevanz als therapeutische zu erhöhen und Krankheiten Modellierungs-Tools.

Dieses Protokoll setzt auf die konstitutive Überexpression des Id1, ein neu identifizierte5 erste Herz Feld angeben Stichwort, das in Kombination mit Activin A, notwendig und ausreichend, um Cardiogenesis in hPSCs zu initiieren. Vor allem, Cunningham Et al. (2017) 5 zeigen, dass Id1-induzierte Stammväter speziell erste Herz-Feld (HCN4, TBX5) aber keine zweite Herz Feldmarken (SIX2, ISL1) Ausdrücken, wie sie kardialen Differenzierung zu unterziehen. Darüber hinaus zeigen die Autoren auch, dass transgene mausembryonen fehlt die ganze Id -Familie von Genen (Id1-4), zu entwickeln, ohne zu bilden erste Herz Bereich kardiale Stammväter, während mehr medialen und hinteren kardialen Vorläuferzellen ( zweites Herz-Feld) kann noch bilden, was darauf hindeutet, dass Id Proteine wichtig sind, erste Herz Feld Cardiogenesis in Vivozu initiieren. Bequem, Id1-induzierte Stammväter können kryokonserviert und spontan in Kardiomyozyten anzeigen ventrikuläre-ähnliche Merkmale, einschließlich der ventrikulären-spezifische Marker (IRX4, MYL2) Ausdruck zu unterscheiden und ventrikuläre wie Aktionspotentiale.

Hier beschreiben wir eine einfache und skalierbare Methode erste Herz Bereich-wie (FHF-L) kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen von Id1 überexprimierenden hPSCs zu erzeugen. Ein wichtiges Merkmal dieses Protokolls ist die Möglichkeit zur Erzeugung von kardialen Vorläuferzellen aus nachfolgenden Cardiomyocyte Produktion mit einer bequemen Kryokonservierung Schritt zu entkoppeln. Zusammenfassend lässt sich sagen dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte (1) generieren Id1-überexprimierenden hPSCs, (2) generieren FHF-L kardialen Vorläuferzellen aus hPSCs, (3) resultierende Stammväter Tiefgefrieren und (4) wieder aufnehmen FHF-L kardialen Vorläuferzellen Differenzierung und generieren hochangereichertes (> 70 – 90 %) gegen ventrikuläre wie Kardiomyozyten.

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Protokoll

(1) Id1 Virus Vorbereitung und Infektion

  1. Id1 überexprimierenden Lentivirus Co transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G und pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR zu generieren (Addgene: Plasmid #107735) in HEK293T Zellen. Viruspartikel zu sammeln, Filtrat aus der Überstand zu reinigen und lagern bei-80 ° C wie Kitamura Et al. (2003) 19. Alternativ produzieren Id1 Lentivirus kommerziell durch pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR an einen Lentivirus produzierenden Lieferanten senden.
    Achtung: Bitte folgen Sie Lentivirale Sicherheitsvorschriften und Standardbetrieb Protokolle.
    Hinweis: Wichtig: optimale Virustiter sollte mindestens 108 109 Transducing Einheiten/mL (TU/mL).
  2. Vor der Infektion Mantel einen Brunnen von einer 96-well-Platte mit 50 µl Reagenz Beschichtung, in der Regel eine gallertartige Proteinmischung sezerniert Engelbreth-Holm-Schwarm Sarkom Mauszellen (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Einen Brunnen von pluripotenten Stammzellen gewachsen in einem 6-well-Platte durch Zugabe von 1 mL PBS ohne Ca2 + und Mg2 + und mit 0,5 mM EDTA zu distanzieren.
    Hinweis: Dissoziation Zeit variiert von 3 – 10 Minuten. Wenn Sie mehr als 80 % der Zellen von der Unterseite der Platte abgenommen sind, fahren Sie mit nächsten Schritt.
  4. In Kunststoff Zentrifugenröhrchen 15 mL sammeln Sie Zellsuspension mit sterilen pipettieren.
  5. Dissoziation-Reagenz mit 5 mL PBS-haltigen Ca2 + und Mg2 +zu neutralisieren.
  6. Pellet-Zellen durch Zentrifugation (200 X g für 3 min).
  7. Entfernen Sie überstand und streichen Sie sanft das Rohr um die Pellets zu verdrängen.
  8. Wieder aussetzen Sie Zellen in 1 mL der Stammzell-Medien.
  9. Zählen der Zellen mittels eines automatisierten Zelle Zählers Hersteller befolgen.
  10. Platte 20.000 lebensfähige Zellen pro Brunnen (96-Well-Platte) in 50 µL der Stammzelle Medien ergänzt mit 2 µM RHO/ROCK Pathway Inhibitor beschichtet (siehe Tabellen 1 und 2).
  11. Nach 24 Stunden Überwachung für Zellhaftung und Medien mit 100 µl Stammzell-Media ergänzt mit 2 µM RHO/ROCK Pathway Inhibitor und 6 ng/mL Hexadimethrine Bromid zu ersetzen (siehe Tabellen 1 und 2), 1 h vor der Lentivirale Infektion.
    Hinweis: Zellen sollten fest an der Unterseite der Platte angebracht werden.
  12. Id1-Lentivirus auf Eis Auftauen.
  13. Fügen Sie 3 µL des gereinigten Lentivirus pro Bohrloch (Virustiter sollte zwischen 108 bis 109 TU/mL), und übertragen Sie dann die Platte wieder auf Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, 20 % O2).
  14. 24 h Post-virale Infektion, infizierte Zellen 100 µL der frischen Stammzellen Medien hinzufügen.
  15. 48 h nach dem Lentivirale Infektion, ersetzen Virus mit Medien mit 200 µL der frischen Stammzellen Medien mit 1 µg/mL Puromycin ergänzt.
  16. Aktualisieren Sie die Medien täglich mit 200 µL der Stammzell-Medien mit 1 µg/mL Puromycin ergänzt.
  17. Wenn Kulturen 80 % Konfluenz erreichen, distanzieren Sie Zellen mit 200 µL PBS ohne Ca2 + und Mg2 + + 0,5 mM EDTA (für einen Brunnen einer 96-Well-Platte).
  18. Sammeln Sie Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen.
  19. Dissoziation-Reagenz mit 5 mL PBS-haltigen Ca2 + und Mg2 +zu neutralisieren.
  20. Pellet-Zellen durch Zentrifugation (200 X g für 3 min).
  21. Entfernen Sie überstand und streichen Sie sanft das Rohr um die Pellets zu verdrängen.
  22. Wieder aussetzen Sie Zellen in 1 mL der Stammzell-Medien mit 2 µM RHO/ROCK Pathway Inhibitor ergänzt.
  23. Übertragen Sie alle Zellen (1 mL) auf eine beschichtete gut von einem 12-Well-Platte.
  24. Nach 24 h Monitor zur Zelle Befestigung an den Brunnen und ersetzen Medien mit 1 mL der Stammzell-Medien mit 2 µM RHO/ROCK Pathway Inhibitor und 6 ng/mL Hexadimethrine Bromid, ein h vor Transduktion ergänzt.
  25. Id1-Lentivirus auf Eis Auftauen.
  26. Fügen Sie 5 µL des gereinigten Virus pro Bohrloch (12-Well-Platte).
  27. 24 h nach dem Lentivirale Infektion, ersetzen Virus mit Medien mit 1 mL frische Stammzellen Medien mit 3 µg/mL Puromycin ergänzt.
  28. 48 h post Lentivirale Infektion, Virus, enthält Medien mit 1 mL frische Stammzellen Medien ergänzt mit 6 µg/mL Puromycin zu ersetzen.
  29. Wenn Kulturen 80 % Konfluenz erreichen, distanzieren Sie Zellen mit 500 µL PBS ohne Ca2 + und Mg2 + und mit 0,5 mM EDTA (für einen Brunnen von einem 12-Well-Platte).
  30. Die Hälfte zu übertragen (250 µL) die Zellsuspension zu einem Brunnen eines Reagenzes Beschichtung beschichtet 6-Well-Platte mit 2 mL der Stammzell-Medien mit 2 µM RHO/ROCK Pathway Inhibitor ergänzt.
  31. Verwenden Sie die andere Hälfte (250 µL) der Probe für die RNA-Extraktion und qRT-PCR um festzustellen, Lentivirale-vermittelten Id1 Ausdruck Niveau wie Colas Et Al. (2012) 4.
    Hinweis: Wichtig: Wenn Id1 mRNA Ausdruck Niveaus niedriger als 0,005 Falte des GAPDH Ausdruck Niveaus (siehe Tabelle 3 qRT-PCR-Primer), wiederholen Sie Infektion wie oben beschrieben, bis Id1 Ausdruck überschreitet die Schwelle.

2. hPSCsId1 -Wartung

  1. Kultur hPSCsId1 in beschichteten 6 Well-Platten und wachsen in 3 mL pro Bohrloch Stammzell-Medien mit 6 µg/mL Puromycin ergänzt.
  2. Wenn hPSCsId1 erreichen 80 % Konfluenz Durchgang Zellen als Zuschlagstoffe (Split im Verhältnis 1:6) mittels enzymfreien Dissoziation Reagenz nach Hersteller-Richtlinien und wachsen in 3 mL pro Bohrloch Stammzell-Medien mit 6 µg/mL Puromycin ergänzt.

3. Vorbereitung des hPSCsId1 zur Differenzierung

  1. Eine 12-Well-Platte mit 500 µL pro Bohrloch Beschichtung Reagenz zu beschichten.
  2. Wenn hPSCsId1 erreichen 90 % Konfluenz Zellen zu trennen, durch Zugabe von 1 mL PBS ohne Ca2 + und Mg2 + und mit 0,5 mM EDTA pro Bohrloch für 5 – 10 min. Dissoziation Prozess überprüfen Sie jede Minute, und einmal 80 % der Zellen sind getrennt von der Platte , mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  3. Sammeln Sie Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen.
  4. Dissoziation-Reagenz mit 5 mL PBS-haltigen Ca2 + und Mg2 +zu neutralisieren.
  5. Pellet-Zellen durch Zentrifugation (200 X g für 3 min).
  6. Entfernen Sie überstand und streichen Sie sanft das Rohr um die Pellets zu verdrängen.
  7. Wieder aussetzen Sie Zellen in 2 mL Stammzell-Medien mit 2 µM RHO/ROCK Pathway Inhibitor ergänzt.
  8. Anzahl Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler.
  9. Platte 300.000 Zellen pro Bohrloch in 1 mL der Stammzell-Medien in Gewebekultur Inkubator mit 2 µM RHO/ROCK Pathway Inhibitor und 6 µg/mL Puromycin und Übergabeplatte ergänzt.
  10. Medien täglich mit 2 mL der Stammzell-Medien mit 6 µg/mL Puromycin ergänzt, bis Kulturen 90 % Konfluenz erreichen zu aktualisieren. Zu diesem Zeitpunkt initiieren kardialen Differenzierung (nächster Schritt).

4. Differenzierung der hPSCsId1 in ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter (FHF-L CPs)

  1. Für 12-Well-Plattenformat, initiieren Differenzierung (Tag 0) indem Stammzell-Medien mit 1,5 mL Induktion Medien (Tabelle 1) ergänzt mit Activin ein (100 ng/mL) (siehe Tabelle 2 für Empfohlene Mengen und Activin A Konzentrationen für verschiedene Plattenformate).
  2. Am Tag 1 (24 h nach Differenzierung eingeleitet wird) ersetzen Sie Medien mit 2 mL Induktion Medien ohne Activin A (pro Bohrloch einer 12-Well-Platte).
  3. Am 3. Tag erneuern Sie Medien mit 2 mL Induktion Medien ohne Activin A (pro Bohrloch einer 12-Well-Platte).
  4. Am 5. Tag sammeln FHF-L CPs für die Kryokonservierung (nächster Schritt).
    Hinweis: Wichtig: Kryokonservierung wird an dieser Stelle bevorzugt, da es ermöglicht, um kardialen Vorläuferzellen Generation von nachfolgenden Cardiomyocyte Produktion und Biobank große Chargen von Zellen zu entkoppeln. Beachten Sie, dass alternativ 5.Tag FHF-L CPs können an einer frisch beschichtete Platte Differenzierung fortzusetzen, verweisen wir auf die Schritte 5.1-5.5, PassFHF-L CPs und gehen dann zu Schritt 6.5 für Differenzierung übergeben werden.

5. die Kryokonservierung von FHF-L CPs

  1. Aspirieren Sie alle Medien aus Brunnen mit 5.Tag FHF-L CPs und schnell 1 mL Warm (37 ° C) 1 x enzymhaltigen Dissoziation Reagenz (siehe Tabelle der Materialien). Legen Sie die Platte in der Gewebekultur-Inkubator.
  2. Nach 1 min schütteln Sie Platte seitlich im Inkubator.
  3. Entfernen Sie nach 2 min (Gesamtzeit) die Platte aus dem Inkubator und 1 mL 10 % FBS Medien.
  4. Sanft pipettieren Zellen oben und unten mit einer 5 mL pipettieren Zelle Loslösung von der Platte zu erleichtern.
  5. Sammeln Sie Zellsuspension auf eine Zentrifuge Rohr- und Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 200 X g für 3 min
  6. Wieder auszusetzen Sie Zelle Pellet in 2 mL Reagenz Kryokonservierung.
  7. Anzahl Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler.
  8. Kryokonservierung Reagenz hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) in ausreichender Menge zum Tiefgefrieren Zellen bei gewünschten Konzentration (in der Regel 5 – 10 x 106 Zellen/mL).
  9. Zellen zur Kryokonservierung Ampullen und platzieren Sie Fläschchen im Kühlgerät (1 ° C/min) zu und Kühleinrichtung im-80 ° C Gefrierschrank über Nacht.
  10. Nach 24 h transfer gefrorenen Fläschchen zu flüssigem Stickstoff für langfristige Lagerung.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

6. FHF-L CP Differenzierung in ventrikuläre wie Kardiomyozyten

  1. Übertragen Sie 5.Tag FHF-L CPs eingefroren Fläschchen von flüssigem Stickstoff Lagerung in Trockeneis Behälter.
  2. Legen Sie Fläschchen in 37 ° C Wasserbad für 2-3 min, bis Zellsuspension vollständig aufgetaut ist.
    Hinweis: Wichtig: das Auftauen ist zeitkritisch. Verfügbarmachen von Zellen für die Kryokonservierung Medien für ein Übermaß an Zeit (z.B. 10 min) Zellviabilität zu verringern.
  3. Übertragen Sie Zellen auf 15 oder 50 mL Zentrifugenröhrchen, abhängig von der Anzahl der aufgetauten Fläschchen.
  4. Tropfenweise (5 Tropfen alle 30 Sekunden) vorgewärmt (37 ° C) kardiogenen Medien (Tabelle 1) Zelle Lösung zu verzichten. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu einer 1:3 Kryokonservierung Medien: kardiogener Medien-Verhältnis erreicht ist. An diesem Punkt erhöhen die kardiogenen Medien zusätzlich Rate bis eine 01:10 Kryokonservierung Medien: kardiogener Medien-Verhältnis erreicht ist.
    Hinweis: Wichtig: schnelle Osmolarität Änderungen erhöht Zelltod während das Auftauen; Daher wird tropfenweise Zugabe von kardiogener Medien wie oben beschrieben dringend empfohlen.
  5. Zentrifugieren Sie Zelle Federung und Pellet Zellen durch Zentrifugation (200 X g für 3 min).
  6. Entfernen Sie überstand und streichen Sie sanft Zentrifugenröhrchen, Zelle Pellet zu verdrängen.
  7. Aussetzen Sie Zellen mit kardiogenen Medien ergänzt mit 2 µM RHO/ROCK Pathway Inhibitor wieder.
    Hinweis: Zellviabilität kann variieren von Tauwetter, Tauwetter und, im Allgemeinen, > 65 % Lebensfähigkeit prognostiziert gute Beschichtung Effizienz.
  8. Verdünnter Zellsuspension konzentriert mit kardiogenem Medien ergänzt mit 2 µM RHO/ROCK Pathway Inhibitor für die gewünschte Zelle Konzentration für Überzug zu erhalten (siehe Tabelle 2 für verschiedene Plattenformate).
    Hinweis: Wichtig: Beachten Sie, dass die kardialen Differenzierung Effizienz zurückgehen kann, wenn Zellen zu dünn gesät sind.
  9. Samenzellen auf Platte.
  10. Halten Sie Teller in der Gewebekultur Haube für 20 min vor der Übertragung auf Gewebekultur Inkubator.
  11. Am 6. Tag der Differenzierung Zellhaftung zu überwachen.
    Hinweis: Cardiac Stammväter sind am 5. Tag der Unterscheidung kryokonserviert. 24 h nach dem Auftauen der Zellen wäre am 6. Tag der Differenzierung.
    Hinweis: Die Anwesenheit von Einzelfeldern (tot) ist üblich.
  12. Am 7. Tag Aspirieren Sie 50 % der Medien und mit einer gleichen Menge von frischen kardiogenen Medien ersetzen.
    Hinweis: Die Zugabe von RHO/ROCK Pathway Inhibitor zu den kardiogenen Medien ist nach diesem Zeitpunkt nicht notwendig.
  13. Ersetzen Sie 50 % der Medien mit kardiogenem Medien jeden zweiten Tag.
  14. Hinweis: spontane schlagen, die zwischen 11 und 13 Tag angezeigt.
  15. Am Tag 15, quantifizieren kardialen Differenzierung Effizienz durch Immunfluoreszenz mit DAPI (Kern Fleck) und ACTC1 (Pan-kardialen Marker).

7. Übergabe und Wartung von ventrikulären-wie Kardiomyozyten

Hinweis: Von Tag 14 – 16, sollte eine Monolage spontan Contracting ventrikuläre wie Kardiomyozyten eingeholt werden. An dieser Stelle wird es vorgeschlagen, distanzieren und neu Platte Kardiomyozyten um die Kultur zu homogenisieren und verhindern, dass Zellen von der Platte lösen.

  1. Aspirieren Sie alle Medien aus Brunnen und schnell 1 mL vorgewärmten (37 ° C) 1 x enzymhaltigen Dissoziation Reagenz.
    Hinweis: 1 x enzymhaltigen Dissoziation Reagenz Bände je Plattenformat, aber sollte vollständig bedecken Sie den Boden der gut Oberfläche.
  2. Übertragen Sie Platte in einer Gewebekultur Inkubator.
  3. Schütteln Sie vorsichtig Platte zur anderen Seite alle 2 min in die brutmaschine zu Ablösung beschleunigen.
  4. Nach 5 – 15 min bei 80 % bis 100 % der Zellen von der Unterseite der Platte gelöst sind, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und hemmen Sie 1 x enzymhaltigen Dissoziation Reagenz Aktivität zu, indem man ein gleiches Volumen 10 % FBS Medien.
    Hinweis: Inkubationszeit mit 1 X enzymhaltigen Dissoziation für diesen Prozess wird von Charge zu Charge variieren.
  5. Sammeln Sie ein Zentrifugenröhrchen Zellsuspension.
  6. Mischen Sie Zellsuspension mit pipettieren und Anzahl Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler.
  7. Zellsuspension auf die gewünschte Zelle Konzentration zu verdünnen (siehe Tabelle 2 für verschiedene Plattenformate) mit Wartung Medien mit 2 µM RHO/ROCK Pathway Inhibitor ergänzt.
  8. Nach der Aussaat Kardiomyozyten auf den Teller, die Zellen gleichmäßig verteilen und die Zellen, die für 10 – 20 min vor der Übertragung Platte in Gewebekultur Inkubator legen lassen.
  9. 24 h nach neu Plattieren, überwachen Zellhaftung und Erholung.
    Hinweis: Die Anwesenheit von Einzelfeldern (tot) ist üblich. 48-72 h nach neu Plattieren, sollten Cardiomyocyte spontane Kontraktion fortsetzen.
  10. Um Cardiomyocyte Kultur zu pflegen, ersetzen Sie 50 % der Medien durch die Wartung Medien jeden zweiten Tag bis zum Gebrauch der ventrikulären-wie Kardiomyozyten für spätere Experimente.

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Ergebnisse

Generation von hPSCs Id1 Linien
hPSCs sind mit einem Lentivirus Vermittlung Id1 Überexpression (Abb. 1A) infiziert. Sobald hPSCId1 erzeugt werden, wird die Transgene Ausdruck durch qRT-PCR (Abbildung 1B) quantifiziert. Nur hPSCId1 Linien auszudrücken Id1 mRNA Ebene größer als 0,005 Falte des GAPDH<...

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Diskussion

Achten Sie für erfolgreiche Differenzierungen darauf, eng oben aufgelisteten Anweisungen folgen. Darüber hinaus stellen wir hier wichtige Parameter, die Differenzierung Ergebnisse stark beeinflussen. Bevor Sie beginnen eine Differenzierung, die folgenden drei morphologische Parameter beachtet werden: ein Stamm Morphologie der hPSCsId1, eine hohe Verdichtung der zellulären und eine hohe Confluence (> 90 %) der Kultur an Tag 0. In dieser Hinsicht optimale Differenzierung Bedingungen entstehen am besten durch Bes...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Mitglieder des Colas Lab für hilfreiche Diskussionen und Kritiken des Manuskripts. Diese Studie wurde unterstützt durch NIH/NIEHS R44ES023521-02 und CIRM DISC2-10110 räumt Dr. Colas.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ACTC1 AntikörperSigmaA7811
Activin AStem Cell TechnologiesHu Recom Activin A
Antibiotikum Antimykotikum (Anti-Anti)Thermo FisherScientific 15240062
B27 SupplementThermo FisherScientific 17504044
B27 Supplement ohne - InsulinThermo Fisher ScientificA1895601
B27 Supplement ohne - Vitamin AThermo Fisher Scientific12587001
CDH5 AntikörperR& D SystemsAF938
CryoStor CS10Stem Cell Technologies7930Kryokonservierungsreagenz
DMEM mit hohem GlukosegehaltMediatech10-013-CV 
DPBS mit Ca & MgCorning21-030-CV
EDTAThermo Fisher Scientific15575-038
FBSVWR89510-186
FluoVolt Membranpotential-Kit   Thermo Fisher ScientificF10488Informationen zur Erfassung des optischen Wirkungspotenzials finden Sie unter McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum ReplacementGibco10828010
Matrigel, Growth Factor ReducedCorning356231Coating Reagent
mTeSR1 MediaKit Stem Cell Technologies5850
PBS ohne Ca & mgCorning21-040-CV
Penicillin-StreptomycinGibco
PuromycinAcros227422500
ReLeSRStem Cell Technologies5872Reagenz für enzymfreie Dissoziation
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
TAGLN-AntikörperAbcamab14106
ThiazovivinStem Cell Technologies72254RHO/ROCK-Signalweg-Inhibitor
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605 -0101X enzymhaltiges Dissoziationsreagenz
Tyrodes Lösungsmix-Pakete   SigmaT2145-10X1L(Zur Erfassung des optischen Aktionspotentials verweisen wir auf McKeithan et al. 2017)

Referenzen

  1. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  2. Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
  3. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  4. Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
  5. Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
  6. McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 1, Unit 1F 13(2012).
  7. McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766(2017).
  8. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
  9. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
  10. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
  13. Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
  14. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  15. Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
  16. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
  17. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
  18. Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
  19. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Vorl uferzellen des ersten HerzfeldesId1 berexpressionActivin A Differenzierunglentivirale InfektionKryokonservierungsprotokollkardiale Differenzierungventrikul re MarkerAktionspotentialanalyse
Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen
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