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Methodenartikel

Eine neuartige Tenorrhaphy-Nahttechnik mit tissue engineered Collagen Graft zur Reparatur großer Sehnendefekte

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DOI:

10.3791/57696

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10. Dezember 2021

 ,  , 
1Division of Surgery and Interventional Science, University College London, 2Blond McIndoe Laboratories, Division of Cell Matrix and Regenerative Medicine, MAHSC, University of Manchester, 3Department of Surgical Research, Northwick Park Institute for Medical Research, Northwick Park Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel stellen wir ein In-vitro- und In-situ-Protokoll vor, um eine Sehnenlücke von bis zu 1,5 cm zu reparieren, indem sie mit künstlichem Kollagentransplantat gefüllt wird. Dies wurde durch die Entwicklung einer modifizierten Nahttechnik erreicht, um die mechanische Belastung zu tragen, bis das Transplantat in das Wirtsgewebe reift.

Zusammenfassung

Die chirurgische Behandlung großer Sehnendefekte mit Sehnentransplantaten ist eine Herausforderung, da es eine begrenzte Anzahl von Stellen gibt, an denen Spender leicht identifiziert und verwendet werden können. Derzeit wird diese Lücke mit Sehnen-Auto-, Allo-, Xeno- oder künstlichen Transplantaten gefüllt, aber klinische Methoden, um sie zu sichern, sind aufgrund des Ausmaßes nicht unbedingt auf Tiere übertragbar. Um neue Biomaterialien zu bewerten oder ein Sehnentransplantat aus Kollagen Typ 1 zu untersuchen, haben wir eine modifizierte Nahttechnik entwickelt, um die konstruierte Sehne in Übereinstimmung mit den Sehnenenden zu halten. Die mechanischen Eigenschaften dieser Transplantate sind der nativen Sehne unterlegen. Um die konstruierte Sehne in klinisch relevante Modelle der belasteten Reparatur zu integrieren, wurde eine Strategie gewählt, um das gewebezüchtige Sehnentransplantat zu entladen und die Reifung und Integration der konstruierten Sehne in vivo zu ermöglichen, bis eine mechanisch gesunde Neosehne gebildet wurde. Wir beschreiben diese Technik unter Einbeziehung des Kollagen-Typ-1-Gewebe-Manipulierten-Sehnenkonstrukts.

Einleitung

Sehnenruptur kann aufgrund extrinsischer Faktoren wie traumatischer Platzwunden oder übermäßiger Belastung der Sehne auftreten. Aufgrund der äußeren Zugkräfte, die auf eine Sehnenreparatur ausgeübt werden, bildet sich bei den meisten Sehnenreparaturtechniken unweigerlich ein Spalt. Derzeit werden Sehnendefekte / -lücken mit Auto-, Allo-, Xeno- oder künstlichen Transplantaten gefüllt, aber ihre Verfügbarkeit ist endlich, und die Spenderstelle ist eine Quelle der Morbidität.

Der Tissue-Engineering-Ansatz zur Herstellung von Sehnentransplantaten aus einem natürlichen Polymer wie Kollagen hat den entscheidenden Vorteil, biokompatibel zu sein und kann lebenswichtige extrazelluläre Matrixkomponenten (ECM) liefern, die die Zellintegration erleichtern. Aufgrund mangelnder fibriller Ausrichtung sind die mechanischen Eigenschaften der konstruierten Sehne (ET) jedoch der nativen Sehne unterlegen. Um die mechanischen Eigenschaften des schwächeren Kollagens zu erhöhen, wurden viele Methoden verwendet, wie z.B. physikalische Vernetzung unter Vakuum, UV-Strahlung und dehydrothermale Behandlungen1. Auch durch chemische Vernetzung mit Riboflavin erhöhten enzymatische und nicht-enzymatische Methoden die Kollagendichte und den Young-Modul des Kollagens in vitro2,3. Durch die Zugabe von Vernetzungsmitteln wird jedoch die Biokompatibilität des Kollagens beeinträchtigt, da Studien eine Veränderung der mechanischen Eigenschaften um 33% und einen Verlust der Zelllebensfähigkeit um 40% gezeigt haben3,4,5. Allmählicher Aufbau von Ausrichtung und mechanischer Festigkeit kann durch zyklische Belastung6erreicht werden; dies kann jedoch effizient in vivo7erworben werden.

Damit ET sich in vivo integrieren und Stärke erwerben kann, ohne dass eine chemische Veränderung erforderlich ist, wäre ein Ansatz, eine stabilisierende Nahttechnik zu verwenden, um das schwächere Konstrukt an Ort und Stelle zu halten. Die meisten Sehnenreparaturen beruhen auf dem Nahtdesign, um Sehnenenden zusammenzuhalten; Daher könnte eine Modifikation dieser bestehenden Techniken eine logische Lösungliefern 8,9.

Bis in die 1980er Jahre waren 2-Strang-Reparaturen weit verbreitet, aber neuere chirurgische Literatur beschreibt die Verwendung von 4 Strängen, 6 Strängen oder sogar 8 Strängen in der Reparatur10,11. Im Jahr 1985 beschrieb Savage 6-Litzen-Nahttechniken mit 6 Ankerpunkten, und es war deutlich stärker als die Bunnell-Nahttechnik, die 4 Stränge verwendet 12. Auch 8-Strang-Reparaturen sind 43% stärker als andere Stränge in Leichen- und In-situ-Modellen, aber diese Reparaturen sind nicht weit verbreitet, da es technisch schwierig wird, die Reparaturen genau zu reproduzieren13,14,15,16. Daher bezieht sich eine größere Anzahl von Kernnahtsträngen auf eine proportionale Zunahme der biomechanischen Eigenschaften der reparierten Sehne. Es gibt jedoch einen Verlust der Zelllebensfähigkeit um die Nahtpunkte, und ein Trauma durch übermäßiges Nähen kann zum Nachteil der Sehne sein, was die Sehnenheilung beeinträchtigen kann17. Nahttechniken sollten eine starke geometrische Reparatur bieten, die ausgewogen und relativ unelastisch ist, um Sehnenlücken nach der Reparatur zu minimieren. Darüber hinaus müssen die Lage der Naht und ihrer Knoten strategisch platziert werden, damit sie das Gleiten, die Blutversorgung und die Heilung nicht beeinträchtigen, bis eine ausreichende Kraft erreicht ist10,18.

Um die Machbarkeit zu ermitteln, schwächeres ET-Transplantat oder anderes Transplantatmaterial zwischen gerissenen Sehnen zu sichern, haben wir eine neuartige Nahttechnik entwickelt, die das Transplantat abladen kann, so dass es reifen und sich allmählich in das Wirtsgewebe in vivo integrieren kann.

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Protokoll

HINWEIS: Das Versuchsdesign und die ethische Genehmigung wurden vom UCL Institutional Review Board (IRB) eingeholt. Alle Experimente wurden gemäß der Verordnung des Innenministeriums und den Richtlinien des Animals (scientific procedure) Act 1986 mit überarbeiteter Gesetzgebung der europäischen Richtlinie 2010/63 / EU (2013) durchgeführt. Kaninchen wurden regelmäßig von einem benannten Tierarzt (NVS) und zweimal täglich von einem benannten Tierpflege- und Tierschutzbeauftragten (NACWO) inspiziert (gemäß den Richtlinien und Vorschriften des Innenministeriums). Sie zeigten keine Anzeichen von Schmerz, bis sie eingeschläfert wurden.

1. Vorbereitung von Tissue Engineered Tendon (ET) Transplantat

  1. Um das Kollagenhydrogel herzustellen, fügen Sie 4 ml Rattenschwanzkollagen Typ 1 monomere Kollagenlösung (2,15 mg / ml in 0,6% Essigsäure mit 0,2% w / v Gesamtprotein) und 500 μL 10x Minimal Essential Medium hinzu. Neutralisieren Sie dies durch Titratierung gegen 5 M und 1 M Natriumhydroxid und fügen Sie 500 μL Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu.
  2. Gießen Sie 5 ml dieser Lösung in eine speziell angefertigte rechteckige Metallform (33 mm × 22 mm × 10 mm, 120 g Gewicht)(Abbildung 1). Bewahren Sie die Form in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 für 15 Minuten auf, um eine Matrixmontage zu ermöglichen19.

2. Herstellung des Transplantats

  1. Nach der Polymerisation wird das Kollagenhydrogel aus der Form entfernt und in eine Standard-Kunststoffkompressionsanordnung gegeben (Abbildung 2A)19.
  2. Legen Sie das Kollagenhydrogel zwischen zwei 50 μm Nylongewebeplatten und üben Sie eine statische Belastung von 120 g (Gesamtoberfläche 7,4cm2,was einem Druck entspricht 1,6 kPa) für 5 Minuten aus, um interstitielle Flüssigkeit aus dem Hydrogel zu entfernen (Abbildung 2A). Verwenden Sie vier Schichten Filterpapier, um die entladene Flüssigkeit aus Hydrogelen zu absorbieren.
  3. Verwenden Sie vier Schichten komprimierter Gele, die übereinander gerollt sind(Abbildung 2B)und in 15 mm große Segmente geschnitten werden(Abbildung 2C),um die ET herzustellen.
    HINWEIS: In den Experimenten wurden weiße männliche Kaninchen aus Neuseeland im Alter von 16 bis 25 Wochen verwendet.
  4. Sedieren Sie Tiere mit einer intramuskulären (i.m.) Dosis Hypnorm (0,3 mg/ ml) und euthanasieren Sie durch Verabreichung einer Überdosis Pentobarbiton.
  5. Schneiden Sie unmittelbar nach der Euthanasie die Haare an beiden Hinterbeinen ab. Machen Sie dann mit einer chirurgischen Klinge der Größe 20 einen 9 cm langen Schnitt um den unteren tibiofibulären Bereich, um die Tibialis posterior (TP) -Sehne freizulegen.
  6. Mit der gleichen chirurgischen Klinge schneiden Sie Lapine TP-Sehnen mit einer durchschnittlichen Länge von 70 mm aus und halten Sie PBS während des experimentellen Prozesses feucht, um ein Austrocknen zu vermeiden.

3. Entwicklung einer neuartigen Tenorrhaphy-Technik

HINWEIS: Die Nähte (siehe Materialtabelle)sind nicht resorbierbar und bestehen aus einem isotaktischen kristallinen Stereoisomer von Polypropylen, einem synthetischen linearen Polyolefin. Die Kernverriegelungsnähte bestanden hauptsächlich aus 3-0 und die peripheren Nähte aus 6-0. Dies waren die beiden Hauptnähte, die in allen Experimenten verwendet wurden.

  1. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Klinge die TP-Sehne in der Mitte ab. Schneiden Sie ein 15 mm langes Segment der Sehne aus der Mitte der Sehne heraus und ersetzen Sie es durch das ET-Kollagentransplantat (Abbildung 2D). Verzahnen Sie die 3-0-Naht proximal von den nativen Sehnenenden entfernt (Abbildung 3A).
  2. Führen Sie die 3-0-Kernnähte über die gesamte Länge des Transplantats und verriegeln Sie distal vom geschnittenen Ende entfernt.
  3. Befestigen Sie beide Enden des ET an der nativen Sehne mit 6-0 und kontinuierlich laufenden Nähten um die Peripherie, indem Sie zwei Sehnenenden koppeln (Abbildung 3B). Dies geschieht, damit das Transplantat leicht auf der Naht bewegt werden kann, indem Spannung auf die native Sehne20gelegt wird.
  4. Nachdem Sie die Naht wie oben beschrieben gesichert haben, stellen Sie manuell sicher, dass die Spannung an den Nähten angemessen ist und dass es keine Schlaffheit in der gesamten Naht gibt.

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Ergebnisse

Wir haben Kollagentransplantate verwendet, die aus Kollagen vom Typ I hergestellt wurden, da dies das vorherrschende Protein in der Sehne ist. Es macht fast 95% des gesamten Kollagens in der Sehne aus; Daher hat Kollagen alle idealen Eigenschaften für die Nachahmung der Sehne in vivogezeigt 21,22.

In dieser Studie wurde das verwendete Kollagen Typ I aus der Ratt...

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Diskussion

In dieser Studie wurden Gewebe-Techn-Kollagentransplantate vom Typ I als Sehnentransplantat ausgewählt, da Kollagen ein natürliches Polymer ist und als Biomaterial für verschiedene Tissue-Engineering-Anwendungen verwendet wird27,28. Außerdem macht Kollagen 60% der Trockenmasse der Sehne aus, von denen 95% Typ 1 Kollagen 21,29,30,31...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Die Autoren danken UCL für die Finanzierung dieses Projekts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rattenschwanz Typ 1 Kollagen First Link, Birmingham, Großbritannien60-30-810
Prolene Nähte 6-0Ethicon Ltd, Edinburgh, Großbritannien
prolene näht 3-0Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.D8911
Whatman FilterpapierSIGMA-ALDRICH 
Gibco  DMEM, ThermoFisher Scientific mit
Nylon-Mesh Plastok (Netze und Filtration) GmbHNa
EP8726HWHA10010155 hohem Glukosegehalt11574486

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