Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

Hrvoje Brzica; Wazir Abdullahi; Bianca G. Reilly; Patrick T. Ronaldson

doi:10.3791/57698

Methodenartikel

Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

DOI:

10.3791/57698

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7. Mai 2018

Hrvoje Brzica^*¹ , Wazir Abdullahi^*¹ , Bianca G. Reilly¹ , Patrick T. Ronaldson¹

¹Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Arizona, Tucson

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.

Zusammenfassung

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Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine dynamische Barriere-Gewebe, die auf verschiedenen pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Solche Veränderungen, die durch diese Reize können stark modulieren Drug-Delivery zum Gehirn und durch Verlängerung, erhebliche Herausforderungen bei der Behandlung des zentralen Nervensystems (ZNS) Krankheiten verursachen. Viele BBB-Veränderungen, die Pharmakotherapie, beeinflussen beinhalten Proteine, die lokalisiert und auf der Ebene der Endothelzellen ausgedrückt. In der Tat hat dieses Wissen über die Physiologie der BBB in Gesundheit und Krankheit erhebliches Interesse an der Erforschung dieser Membran Proteine ausgelöst. Aus Sicht der wissenschaftlichen Grundlagen-Forschung bedeutet dies eine Anforderung für eine einfache, aber robuste und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren geerntet. Um Membran Proben aus frisch isolierte mikrogefäßen vorzubereiten, ist es wichtig, dass Probe Vorbereitungen in Endothelzellen bereichert aber in Gegenwart von anderen Zelltypen der Neurovaskuläre Einheit (z.B. Astrozyten, Mikroglia, Neuronen begrenzt, perizyten). Ein weiterer Vorteil ist die Fähigkeit, Proben von einzelnen Tieren vorzubereiten, um die wahre Variabilität der Proteinexpression in einer experimentellen Bevölkerung zu erfassen. In dieser Handschrift sind Einzelheiten über eine Methode, die verwendet wird für die Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und Vorbereitung der Membran-Proben zur Verfügung gestellt. Kapilläre Anreicherung von Proben abgeleitet, ist erreicht, indem vier Zentrifugation Schritte wo Dextran in den Probenpuffer aufgenommen. Dieses Protokoll kann leicht durch andere Labore für ihre eigenen spezifischen Anwendungen angepasst werden. Proben aus diesem Protokoll generiert wurden gezeigt, robuste Versuchsdaten aus Protein-Analyse Experimente liefern, die das Verständnis der BBB Reaktionen auf physiologische und pathophysiologische pharmakologische Reize sehr helfen können.

Einleitung

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Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist an der Schnittstelle zwischen dem zentralen Nervensystem (ZNS) und die systemische Zirkulation vorhanden und spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Insbesondere die BBB-Funktionen, um präzise Kontrolle gelösten Konzentrationen im Gehirn extrazellulären Flüssigkeit und effizient diese Nährstoffe liefern, die von Hirngewebe benötigt werden, um die erheblichen metabolischen Anforderungen der CNS¹zu erfüllen. Diese Rollen implizieren, dass die BBB, die in erster Linie auf der Ebene der mikrovaskuläre Endothelzellen existiert, diskrete Mechanismen besitzen muss, die es e....

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Protokoll

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Alle unten beschriebene Verfahren durch eine institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und entsprechen den National Institutes of Health (NIH) und Animal Research: In Vivo Experimente (Ankunft) Richtlinien zum Berichten. Der verfahrenstechnische Ablauf für das Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Set-up für das Verfahren

Bereiten Sie den Gehirn kapilläre Puffer (BMB). Starten Sie durch mit einem Gewicht von 54,66 g D-Mannit, 1,90 g EGTA und 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (d. h. Tris) Basis in ein sauberes Becherglas. 1,0 L entionisiert....

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Ergebnisse

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Der experimentelle Fluss zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Probenpräparation kapilläre Membran ist in Abbildung 1dargestellt. Bei der hier vorgestellten Verfahren erfolgreich Isolation intakt mikrogefäßen aus rattengehirn zeigt (Abbildung 2A). Diese Schiffe wurden nach Abschluss der Zentrifugation mit Dextran und unmittelbar vor Beginn der Ultrazentrifugation, Membran-Proben (d. h. nach Abschluss von Schrit.......

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Diskussion

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In diesem Artikel wird eine einfache und effektive Methode der Membrane Protein Probenvorbereitung von mikrogefäßen frisch von Ratte Gehirngewebe isoliert beschrieben. In der Literatur¹³^,²⁰^,²¹^,²² wurden mehrere Ansätze zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen oder Generierung von Membran-Zubereitungen aus isolierten Microvasculature gemeldet. ^, ²⁴. zwar di.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01-NS084941) und die Arizona biomedizinische Forschungskommission (ADHS16-162406), PTR. WA erhielt vorbei an Unterstützung von Pre-doc Termin für eine nationale Institute der Gesundheit Ausbildung Grant (T32-HL007249).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Protease-Inhibitor-Cocktail	Sigma-Aldrich	#P8340	Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns
Trizma Base	Sigma-Aldrich	#T1503	Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns
Dextran (MW 75.000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Dextran wird in Zentrifugationsschritten verwendet, um Mikrogefäße vom Hirnparenchym zu trennen
Zetamin	MWI Animal Health	#501072	Allgemeinanästhetikum
Xylazin	Western Medical Supply	#5530	Allgemeinanästhetikum
0,9% ige Kochsalzlösung	Western Medical Supply	N/A	Allgemeinanästhetikum
Verdünnungsmittel-Filterpapier (12,5 cm Durchmesser)	VWR	#28320-100	Wird zur Entfernung von Hirnhäuten aus Hirngewebe
verwendet Zentrifugenröhrchen	Sarstedt	#60.540.386	Einwegröhrchen für Dextran-Zentrifugationsschritte
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay	ThermoFisher Scientific	#23236	Messung der Proteinkonzentration in Membranpräparaten
Wheaton Overhead Power Homogenizer	DWK Life Sciences	#903475	Erforderlich für die Homogenisierung von Proben
10,0 ml Glasmörser und Stößel Tissue-Mühle	DWK Life Sciences	#358039	Erforderlich für die Homogenisierung von
Proben Salzsäure	Sigma-Aldrich	#H1758	Erforderlich für die pH-Einstellung von Puffern
Rinderserumalbumin	ThermoFisher Scientific	#23210	Proteinstandard für Bradford Assay
Standard Pinzetten	Fine Science Tools	#91100-12	Wird für die Dissektion von Hirngewebe
verwendet Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	#16020-14	Wird zum Öffnen des Schädels verwendet, um das Gehirn zu isolieren
50 ml konische Zentrifugenröhrchen	ThermoFisher Scientific	#352070	Wird zur Entnahme von Hirngewebe nach der Isolierung
Glaspasteurpipetten	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Wird zur Aspiration von Zelltrümmern nach Dextran-Spins verwendet
Ethanol, wasserfrei	Sigma-Aldrich	#459836	Wird zur Reinigung von Gewebeschleifmaschinen verwendet; auf 70% mit destilliertem Wasser
verdünntUltrazentrifugenröhrchen	Beckman-Coulter	#41121703	Wird für die Ultrazentrifugation von Proben verwendet

verwendet

Referenzen

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Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T.

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Schlagwörter

Dextran Zentrifugation Membranpr paration Blut Hirn Schranke Rattenhirngewebe Western Blot Analyse Proteinanreicherung Mikrogef isolation Zentrifugationsschritte Endothelzellmarker

Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

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