Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung von Herzen im Zebrafisch in 4 Dimensionen (4D) zu visualisieren. 4-D-Bildgebung, über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) dauert 3-dimensionale (3D) Bilder im Laufe der Zeit entwickelnde Herzen zu rekonstruieren. Wir zeigen qualitativ und quantitativ die Scherspannung aktiviert endokardialen Kerbe Signalisierung während der Entwicklung der Kammer, die kardiale Trabeculation fördert.

Zusammenfassung

Die hämodynamischen Kräfte durch die Herzen Einfluss kardiale Entwicklung, vor allem Trabeculation, bildet ein Netz von verzweigten Auswüchse von Myokard erlebt. Genetisches Programm Mängel in der Kerbe Signalisierung Kaskade ventrikuläre Defekte wie linken Ventricular Non-Compaction-Kardiomyopathie oder hypoplastischen Links-Heart-Syndrom beteiligt sind. Unter Verwendung dieses Protokolls, kann festgestellt werden, dass Schubspannung angetrieben Trabeculation und Notch signaling miteinander verbunden sind. Mit Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie war Visualisierung der entwickelnden Zebrafisches Herzen möglich. In diesem Manuskript wurde geprüft, ob hämodynamischen Kräfte die Einleitung der Trabeculation über die Kerbe Signalisierung modulieren und somit KONTRAKTILE Funktion beeinflussen auftritt. Für qualitative und quantitative Scheren Spannungsanalyse, 4-D (3-D + Zeit) Bilder wurden während der Zebrafisch kardiale Morphogenese erworben und integrierten Licht-Blatt-Fluoreszenz-Mikroskopie mit 4D Synchronisation erfasst die ventrikuläre Bewegung. Viskosität des Blutes verringerte Down-Regulierung Kerbe Signal- und mildernde Trabeculation über gata1a- Morpholino Oligonucleotides (MO) Mikro-Injektion, Schubspannung, dadurch zu verringern. Co-Injektion von Nrg1 mRNA mit gata1a MO gerettet Kerbe-Genen um die Trabeculation wiederherzustellen. Bestätigen Schubspannung getrieben Notch signaling beeinflusst Trabeculation Cardiomyocyte Kontraktion verhaftet weiter über tnnt2a-MO hämodynamischen Kräfte dabei reduzieren Down-Regulierung Kerbe Zielgene, non-trabekulierte zu entwickeln Myokard. Zu guter Letzt wurde Bestätigung der Expressionsmuster von Scherbeanspruchung reagierende Kerbe Gene von Endothelzellen pulsierender Strömung unterwerfen durchgeführt. So deckte die 4-D-Licht-Blatt-Mikroskopie hämodynamischen Kräfte zugrunde liegenden Kerbe Signal- und Trabeculation mit klinischer Relevanz, nicht-Verdichtung Cardiomyopathy.

Einleitung

Biomechanische Kräfte, wie hämodynamische Schubspannung sind kardiale Morphogenese eng beteiligt. In Reaktion auf die hämodynamische Scherkräfte entwickeln myokardialen Rillen und Nuten in einem wellenartigen trabekuläre Netzwerk in Übereinstimmung mit der Richtung der Schubspannung in der ventrikulären (AV) Ventil¹. Kardiale Trabeculation ist notwendig, KONTRAKTILE Funktion und myokardialen Masse²zu erhöhen. Mutationen im Notch Signalwege führen angeborene Herzfehler bei Menschen und anderen Wirbeltieren³. Beispielsweise wurden gata1a⁴ und tnnt2a⁵ Morpholino Oligonucleotides (MO) gezeigt, Erythropoese, reduzieren, während Erythropoetin (EPO) mRNA⁶ und Isoproterenol (ISO)⁷ roten Blutkörperchen zu erhöhen Zellen und Herzfrequenz Wand bzw. daher Scherspannung (WSS). Darüber hinaus ErbB2-Signalisierung, flussabwärts von Notch, fördert die Cardiomyocyte Proliferation und Differenzierung Kontraktionskraft, generieren die Einkerbung^8,9Signalisierung wiederum aktiviert. Es wird vorgeschlagen, dass die Schubspannung Notch signaling gesteuerte Trabeculation für ventrikuläre Entwicklung regelt. Derzeit gibt es viele Studien, die versuchen, weiter zu verstehen, die genetische Programmierung Ereignisse auf angeborene Defekte (KHK)^10,11,12, aber sehr wenig untersuchen, wie mechanische Kräfte beeinflussen das Umformen Herz.

Um die mechanischen Kräfte untersuchen muss auf Endokards, genaue Beobachtung während der Entwicklungszeit umgesetzt werden. Allerdings ist es schwierig, gute Bildqualität von in Vivo Proben durch die Inhärenz des traditionellen Mikroskopie¹³schlagen zu erhalten. Um die Entwicklung im Laufe der Zeit innerhalb einer Probe zu beobachten, müssen daher körperliche schneiden und färben,^13,14,15auftreten. Obwohl der konfokalen Mikroskopie weit verbreitet ist, die 3-d-Struktur der Proben^14,16Bild, ist diese bildgebenden Systemen Erwerb noch durch langsame Scan-Geschwindigkeit begrenzt.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) ist eine einzigartige bildgebendes Verfahren, die die Visualisierung von in Vivo dynamischen Events mit lange arbeiten Abstand¹³ermöglicht. Diese Technik verwendet eine Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, optisch eine Probe¹⁷Abschnitt. Durch Beleuchtung nur eine dünne Folie aus Licht auf die Probe ist ein Rückgang der Foto-Bleichen und Foto Toxizität^13,18. Das große Sichtfeld und langem Arbeitsabstand erlaubt für große Proben intakt bleiben, wie sie abgebildeten^13,14,17sind. Die geringe Vergrößerung ermöglicht einen größeren Bereich abgebildet werden, während der langen Arbeitsabstand ermöglicht dickere Proben abgebildet werden, ohne das Signal-Rausch-Verhältnis. Viele Gruppen haben LSFM verwendet, um Bild gesamte Embryonen¹⁷,^14,18, Muskeln und Herz¹⁹ unter anderen Geweben, Gehirne, zeigen die vielfältigen Arten von Proben, die abgebildet werden können.

Obwohl die bisherige Forschung reduzierte hämodynamische Querkraft nachgewiesen durch den Zufluss oder Abfluss Spuren der Zebrafisch Herzen verschließen, sind die Informationen ausschließlich qualitative. Es ergibt sich eine abnorme Dritte Kammer, verminderte kardiale looping und beeinträchtigt Ventil Bildung²⁰. Die 4-D LSFM Bilder geben eine neue Perspektive in die Lebensweise, die der hämodynamischen beeinflussen Scherkräfte, die Entwicklung der das Herzgewebe. Diese mechanische Kräfte können Kraft-Sensitive Signalmoleküle aktivieren und induzieren die Bildung von den trabekulären Kämmen. Wegen der Nachspielzeit Aspekt der 4-D-Bildgebung kann man zum Nachverfolgen von Änderungen in der Entwicklung in Echtzeit, die zu neuen Enthüllungen führen könnten, die bisher unbemerkt hatte. Der Zebrabärbling ist ein ideales Modell für imaging, weil Wissenschaftler eine ganze vertebrate Tier im Vergleich zu nur Zell-Zell-Interaktionen beobachten können. Sauerstoff kann auch durch den gesamten Embryo diffundieren die Entwicklung ohne je nach Kreislauf-Systems, im Gegensatz zu Säugetieren Entwicklung auftreten können. Obwohl der Zebrafisch-Herz der pulmonalen Organe, die erfordern ein vier-Kammer-Herz fehlen, gibt es eine große Anzahl von kardialen Gene, die zwischen Menschen und Zebrafisch²¹konserviert sind.

In diesem Manuskript beschreiben wir, wie Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie verwenden, um die Entwicklung Trabekel im Zebrafisch Herzen unter verschiedenen Umständen Bild. Zunächst wurden Injektion von gata1a⁴ oder tnnt2a⁵ MOs niedriger die Viskosität des Blutes und damit WSS verwendet. Die Morphologie des Herzens wurde dann aufgezeichnet. In einer separaten Gruppe von Fischen wir erhöht die WSS durch Verabreichung von EPO mRNA⁶ oder Isoproterenol⁷ und die Ergebnisse zu beobachten. Wir haben auch eine Zelle-Studie mit verschiedenen pulsierender oder oszillierende Durchflussraten. Nach jeder Gruppe imaging, fanden wir, dass WSS durch Endokards über Kerbe spürte Signalisierung Eingeweihten Trabeculation.

Protokoll

Die folgenden Methoden wurden in Übereinstimmung mit UTA und UCLA IACUC Protokolle durchgeführt. Diese experimentellen Gruppen dienten mit transgenen Tg(cmlc2:gfp), Wea (schwache Atrium) oder Clo (Cloche) Mutanten: (a) Wildtyp (WT) Kontrolle, (b) gata1a MO und (C) tnnt2a MO-Injektionen (Tabelle 1).

Modell	Name	Veränderten Genen	Phänotyp	Referenz
Kontrolle	Wildtyp	Keine	N/A
	TG(cmlc2:GFP)	Kardialen Myosin-Leichtketten	Grüne Flourescence speziell im Myokard ausgedrückt	34
Verminderte Wand Schubspannung	Schwache Atrium (Wea) mutant	Atrium-spezifische Myosin Heacy Kette	Atrium kann nicht Vertrag, kompakte Ventrikel, myokardiale dickwandigen, engen Lumen, Dialated Atrium	37
	Cloche (Clo) mutant	N/A	Vollständige Entfernung des Endokards, Unaturally große Atrium mit kleinen Ventrikel, nicht vorhandene kardiale cushins	41
	gata1a MO	gata1a	Anämie aus Mangel an roten Blutkörperchen	4
	tnnt2a MO	tnnt2a		39
Erhöhte Wand Schubspannung	EPA -mRNA	Keine	Schwere Polyzythämie, Erhöhung der Anzahl der zirkulierenden Blutzellen, erhöhte Viskosität	6
	Isoprotenerol	Keine	Erhöhte kardiale rate	7

Tabelle 1: Zebrafisch Beschreibungen. Definitionen und Beschreibungen der Zebrafisch in Experimenten verwendet.

1. studieren Sie Setup

1. Trabeculation Rettung Nrg1 und EPA mRNA vorbereiten.
   1. Menschliche Nrg1 cDNA erhalten und von einem Spender-Plasmid zu verstärken.
      Hinweis: Die menschlichen Nrg1 cDNA wurde von William Talbot von der Stanford University begabt.
      1. Nehmen Sie notwendigen Reagenzien und Materialien, nämlich PCR Mastermix (gespeichert in-20 ° C), Primer (siehe Tabelle 2) (gespeichert in-20 ° C), eine PCR-Platte (bei Raumtemperatur gelagert) und einer 20 μl Pipette (bei Raumtemperatur gelagert). Siehe Tabelle der Materialien für Beispielprodukte.
         
         Tabelle 2: Primer zum Nrg1 Klonen.
      2. Bereiten Sie den Mastermix für jede Grundierung in dreifacher Ausfertigung mit der 20 μl Pipette festgelegt. Verwenden Sie für 1 Satz Triplicates 37,5 μl der Mastermix, 3 μl DNA-freie Wasser, 4,5 μl Grundierung. Multiplizieren Sie für mehr Triplicates einfach mit der Anzahl der Stichproben.
      3. Verdünnen Sie die Arbeitslösung menschlichen Nrg1 cDNA (20 ng/μg Konzentration) im Primer-Streifen mit DNA-freies Wasser, so dass es 10 μL pro Well pro Probe insgesamt.
         Hinweis: Stellen Sie sicher, dass jede Lösung unter Schritt 1.1.1 gleichmäßig verteilt ist. Zu diesem Zweck mischen jede Lösung durch pipettieren rauf und runter. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie eine PIPETTENSPITZE für nur eine Probe.
      4. Aliquoten Nrg1 cDNA mit der 10 μL Mehrkanal-Pipette zum gewünschten Brunnen in der PCR-Platte.
      5. Die cDNA in den Vertiefungen 14,5 μL der Mastermix hinzufügen. Die PCR-Platte zur Abdichtung der Brunnen, und legen Sie in der PCR-Maschine zuweisen Sie ein klebrigem Cover.
      6. Starten Sie die PCR-Maschine und sicherzustellen Sie, dass der Zyklus entsprechende Temperaturen entsprechend der Enzyme und Primer verwendet.
   2. Klonen Sie die Nrg1 cDNA in das Plasmid pCS2⁺ an den Standorten BamHI und EcoRI mit überschüssigen Enzymen BamHI und EcoRI cDNA ist in alle Plasmide ligiert.
      1. Mischen die Nrg1 cDNA mit dem Spender Plasmid pCS2⁺, handelsübliche Master mix, Lösung und Primer (Tabelle 2).
         Hinweis: Das gesamte Reaktionsvolumen sollte 50 μL mit 25 μL des master-Mix, 3 μL der Zündkapseln und 1 μl 20 ng/μl Spender Plasmids mit Nrg1 cDNA.
      2. Legen Sie die Mischung aus Schritt 1.1.2.1 in der PCR-Maschine und stellen Sie die Parameter für den folgenden Spezifikationen entsprechen: 98 ° C für 10 s, 55 ° C für 5 oder 15 s und 72 ° C für 5 s/kb.
      3. Das PCR-Produkt mit einer Reinigung Kit nach den Anweisungen des Herstellers zu reinigen. Eluieren Sie das Produkt in 50 μL der Elution Buffer.
      4. Verdauen die gereinigten PCR-Produkt und 5 μg pCS2⁺ mit BamHI und EcoRI separat bei 37 ° C für 2 h in einem Reaktionsvolumen von 200 μL. Die daraus resultierende Verdauung mit einem kommerziellen Kit reinigen und eluieren in 20 μl und 100 μl Tris-HCl (pH 8,5), beziehungsweise.
      5. Verbinden von 4 μL Nrg1 cDNA und 2 μL der verdauten pCS2⁺ Plasmid in einer 25 μL Reaktion mit 1 μl der Ligase Katalysator bei 16 ° C über Nacht.
         Hinweis: Das Verfahren kann hier für die Inkubation über Nacht gestoppt werden.
      6. Verwenden Sie 2 μL der Ligatur Lösung aus Schritt 1.1.2.5. und Transformation in 50 μL der E. Coli Bakterienzellen geeignet für das Klonen (siehe Tabelle der Materialien).
   3. Bestätigen Sie, dass die Transformation erfolgte durch Screening die Nrg1 cDNA Klone mittels PCR. Klone nach dem Zufallsprinzip auswählen und hinzufügen zu einer Lösung von spezifischen Primern, Polymerase und Deoxyribonucleotide Triphosphate (dNTPs).
      Hinweis: Die Kontrollen waren der Vektor (pCS2⁺) mit und ohne Einlage (menschliche cDNA). Nehmen nicht zu groß für eine Kolonie, weil übermäßige Bakterien PCR hemmen können.
      1. Wählen Sie aus der Transformation und Bildschirm pCS2 8 Kolonien⁺-Nrg1-Klone unter Verwendung der PCR Zündkapseln aus Tabelle 2.
      2. Kultur einen Klon mit Nrg1 cDNA zu isolieren, die pCS2⁺-Nrg1 Plasmid DNA. Impfen mit 100 μL der E. Coli -Bakterien mit pCS2⁺-Nrg1 Plasmid in 100 mL LB Medien und Kultur durch Schütteln (160-225 u/min) bei 37 ° C.
   4. Transfizieren gereinigten pCS2⁺-Nrg1 Plasmid in HEK-293-Zellen in einem 6-Well-Platte mit einem kommerziellen Transfektion Reagenz nach den Anweisungen des Herstellers.
   5. 24 h nach Transfektion, lösen Sie die Zellen mit einer Lyse-Puffer und durchlaufen eine SDS-PAGE-Gel, auf einer Gel-Membran übertragen und dann färben mit Anti-Nrg1 Antikörper²². Überprüfen Sie die Nrg1 -Protein-Expression mit einem Western-Blot.
      Hinweis: Die Steuerung ist eine leere pCS2⁺ Plasmid. Kann hier angehalten werden, wenn Gel Membran über Nacht erfolgt.
   6. Synthetisieren Sie Nrg1 mRNA mit einem kommerziellen Produkt ähnlich dem in der Tabelle der Materialien zu und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
      1. Nehmen Sie 5 μL der pCS2⁺-Nrg1 DNA aus den isoliert Bakterienkultur und verdauen mit NotI in einer 200 μL Reaktion für 2 h bei 37 ° C auf das Plasmid zu linearisieren.
      2. Reinigen Sie die linearisierte Plasmid mit einem kommerziellen Kit und eluieren in 20 μl Tris-HCl (pH 8,5).
      3. Durchführung von in-vitro- Transkription mit einem kommerziellen RNA isolierungskit in einem 20 μl-Reaktion unter Verwendung der 5 μL des linearisierten Plasmids nach den Anweisungen des Herstellers.
      4. Fügen Sie die in-vitro- Nrg1 auf 350 μL der RNA Lyse Puffer übertragen und dann mit einem RNA-Isolierung-Kit zu reinigen. Die RNA in 60 μl Tris-HCl (pH 8,5) eluieren.
      5. Die RNA-Konzentration zu messen und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.
   7. Folgen Sie den Schritten 1.1.6.1 - 1.1.6.5 oben für die EPA cDNA und mRNA Vorbereitung aber Klon die cDNA in der pCS2 + Plasmid EcoRI und XhoI statt Standorten.
2. Morpholino in Zebrafish Einspritzen
   1. Design-²³ MO-Injektionen, die über ein online-Tool (Table of Materials) gegen die ATG Abfolge der gata1a⁴ (5′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3 ') und tnnt2a⁵ (5′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3 ').
   2. Fügen Sie hinzu, gata1a und tnnt2a MO separat Nuklease-freies Wasser die Endkonzentrationen von 8 ng/nL und 4 ng/nL, bzw. zu machen. Wiederholen Sie mit EPO mRNA mit einer Endkonzentration von 20 Pg/nL. Stellen Sie sicher, dass das endgültige Volumen 1 mL.
   3. Spritzen 1 nL 8 ng/nL der gata1a MO und 1 nL 4 ng/NB der tnnt2a MO in separaten Zebrafisch-Embryonen im 1 bis 4-Zell-Stadium, Ventrikelwand Scherspannung (WSS)²⁴zu reduzieren. Steigerung der WSS injizieren 1 nL 20 Pg/nL EPA mRNA⁶ in der Zebrafisch-Embryonen im 1 - 4-Zell-Stadium.
3. Behandeln Sie chemisch Zebrafisch um Trabeculation zu hemmen
   1. Mit einer Pipette 20 mL verdünnen die 10 mg/mL AG1478 in 1 % DMSO in E3 Medium, eine Endkonzentration von 5 μM bei 30 hpf in einem 15 mL-Tube. Als Kontrolle jeder Fisch mit nur 1 % DMSO zu behandeln.
   2. N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-Butyl-Ester (DAPT) in 1 % DMSO hinzufügen (100 μM), E3 Medium in einer 15 mL Tube zu hemmen, Kerbe Signalisierung bei 40 hpf in ähnlicher Weise. Als Kontrolle mit nur 1 % DMSO behandeln.

2. die bildgebenden Verfahren

1. 4-D kardiale LSFM Imaging mit Synchronisation Algorithmus
   1. Übernehmen Sie 2-D-Bilder von der gesamten Fisch-Embryo mehrere Herz schlagen Zyklen mit den Schritten unten (Abbildung 1). Sicherstellen Sie, dass die Licht-Blechstärke ca. 5 μm. Nehmen Sie 1 μm für verlustfreie digitale Probenahme gemäß Nyquist Sampling-Prinzip²⁵500 X-y-Rahmen mit einer Belichtungszeit von 10 Ms. Set Z-Scan.
      1. Erstellen Sie eine 1 % (w/V) Agarose-Gel 100 mL 1 g Agarose hinzufügen und erhitzen, bis alle Agarose aufgelöst ist. Laden Sie einen kleinen Plastikschlauch mit dem Embryo und Agarose mit einer 20 μl Pipette zu und sichern Sie ihn auf der Bühne.
      2. Öffnen Sie das Bild-Viewer-Software, und klicken Sie auf Live um zu sehen, die live-Ansicht der Probe. Passen Sie das Ziel mit dem Regler, so dass die Probe im Fokus befindet. In ähnlicher Weise verschieben Sie die Phase, so dass die live-Ansicht der Probe der obere Teil des Embryos zeigt.
      3. Nehmen Sie Bilder 500 Mal für 5 s bei 10facher Vergrößerung mit dem Mikroskop Software²⁶.
      4. Verschieben Sie die Phase mit den Motor auf eine neue Ebene (1 μm in der z-Achse) und wiederholen Sie bildgebende Verfahren.
      5. Wiederholen Sie über 2 Schritte bis ganzes Herz voll abgebildet wird.
   2. Datenintegrität durch Nichtbeachtung der ersten und letzten Herzzyklus Bilder zu gewährleisten. Finden Sie den Zeitraum von dem Herzzyklus durch passende Bilder, die zum gleichen Zeitpunkt in der Diastole, sondern in verschiedenen Zeiten aufgenommen wurden. Verwenden Sie die folgende Formel, die entwickelt wurde, um den Zeitraum zu finden:
      (1)
      wo D die Kostenfunktion verwendet ist für den Einbau einer Periode Hypothese, ich_m das aufgenommene Bild τ' die Zeit der Aufnahme war Z_k Z-Richtung Index des Bildes, X_m ist die Vektor des Indexes Pixel und T' ist die periodische Hypothese.
   3. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die relative Verschiebung zwischen zwei Bildern in ähnliche Stadien zu finden:
      (2)
      wo Q_{k', k} kennzeichnet eine Kostenfunktion für die relative Verschiebung, R ist die mögliche räumliche Nachbarschaft, L ist die gesamte Zeit von der Aufnahme, X ist das Pixel-Index, Z_k und -Z_k' sind die ersten und zweiten Z-Richtung Scheiben, t ist an der Zeit, und s ist die relative Verschiebung-Hypothese.
   4. Konvertieren Sie die relative Verschiebung in absolute Veränderung in Bezug auf das erste Bild und lösen Sie die lineare Gleichung mit dem Pseudo-inverse-Ansatz, um der absolute Bezug zum richten Sie des nächsten Abschnitts der Bilder als zuvor beschriebenen²⁷zu finden.
   5. Die letzten 4-D-Bilder wurden mit Bildbearbeitungssoftware (Table of Materials) verarbeitet.
      1. Stapeln von 2-D-Bilder in 3D
         1. Öffnen Sie eine kommerzielle Bildverarbeitungs-Software.
         2. Klicken Sie auf Open Data.
         3. Wählen Sie die Bilder in 3-d gestapelt werden > Klick Laden.
         4. Fügen Sie in die Voxel-Größe von 0,65 x 0,65 x 1 > Klicken Sie auf "OK".
         5. Klicken Sie auf Feld Multi-Planar Ansicht um das 3D-Bild zu visualisieren.
         6. Mit der rechten Maustaste der blaue slice_1.tiff -Box > Wählen Sie Anzeige > Wählen Sie Volren.
         7. Klicken Sie auf Bearbeiten > Optionen > Bearbeiten Farbtabelleauswählen.
         8. Passen Sie die Farbe über die Felder in rot beschriebenen > Klicken Sie auf OK.
      2. Umwandlung von 3-d 4-d
         1. Klicken Sie auf "Datei > Öffnen Zeitreihendaten.
         2. Wählen Sie die 3-d-TIFF-Dateien, die gerade gemacht wurden > Klick Laden.
         3. Geben Sie die gleiche Voxel-Größe wie vor.
         4. Die blaue slice_1.tiff -Box einen Rechtsklick > Wählen Sie "Anzeige" > Wählen Sie Volren.
         5. Klicken Sie auf Bearbeiten > Optionen > Bearbeiten Farbtabelleauswählen. Passen Sie die Farbe über die Felder > Klicken Sie auf "OK".
         6. Zeitsteuerung-Serie einen Rechtsklick > Klicken Sie auf Movie Maker > drücken Sie den Play -Button um den Film zu sehen.
         7. Fügen Sie einen Dateinamen, Frame-Größe, Frame-Rate, Qualität gleich 1, geben Sie monoskopisches > Klicken Sie auf Apply
         8. Exportieren Sie das Video. Öffnen Sie das Video in einer geeigneten Software.

(3) qRT-PCR-Analyse

1. Zebrafisch Herz RNA Isolation Notch-Liganden, Rezeptoren, zu quantifizieren und gezielt Gene Ausdrücke
   1. Der Zebrabärbling zu Opfern, indem sie auf eine Überdosierung von Tricaine метоксид^28,29. Mit einem zuvor beschriebenen Protokoll³⁰, wurden der Zebrafisch Herzen herausgeschnitten und für RNA Isolierung vorbereitet.
   2. Isolieren Sie die gesamte-RNS zu, und synthetisieren Sie die cDNA mit dem cDNA Synthese Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
   3. Die PCR-Primer-Design für den Notch-Liganden Jag1, Jag2, Dll4, Notch1b-Rezeptor und Signalisierung im Zusammenhang mit Genen Nrg1 und ErbB2. Siehe Tabelle 3 für die Primer, die wir verwendet.
   4. Die PCR-Platte die Primer aus Schritt 3.1.3, die isolierte mRNA aus Schritt 3.1.2 und eine kommerzielle Mastermix hinzufügen. Führen Sie die qRT-PCR bei geeigneten Temperaturen und Zeiten nach der Enzyme verwendet. Die Ergebnisse zum Zebrafisch α-Actin zu normalisieren.
      Hinweis: Hierfür wird der Ausdruck Niveaus für jedes der Gene, Liganden und Rezeptoren berechnet.

4. in-vitro- Experimente der menschlichen Aortenklappe Endothelial Zelle (HAEC)

1. Dynamische Schubspannung Modell
   1. HAEC Zellkulturen mit HAEC Nährmedien. Einmal voll konfluierende, setzen Sie die Zellen Laminar-Flow und pulsierender Durchfluss von 23 x 10^-5 N mit einer Rate von 1 Hz für 24 h.
      1. Wärmen Sie sich EG Medien/DMEM 10 % FBS in einem Wasser Bad für 20 Minuten.
      2. Rufen Sie HAEC Zellen aus flüssigem Stickstoff-Tank ab und setzen Sie das Fläschchen in das Wasserbad bis Sie geschmolzen.
      3. Mit einer 1.000 μl Pipette, die aufgetauten Zellen zu entfernen und steckte sie in eine 15 mL-Tube mit 3 bis 5 mL der Medien. Zentrifugieren Sie die Zelle-Lösung bei 53 X g für 3 min.
      4. Aspirieren Sie die Lösung aus, und fügen Sie genügend Medien für ein Gesamtvolumen von 10 mL. Ergänzen die Zelle Projektmappe um einem sterilen T75 Kolben, den Kolben Mütze und die Zellen gleichmäßig auf der Unterseite der Platte verteilen.
      5. Markieren Sie den Kolben mit Initialen, Datum, Zelltyp und durchgangsnummer. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C, 5 % CO₂, bis 80 % Zusammenfluss Zellen. Vergessen Sie nicht, die Medien alle 2-3 Tage gewechselt.
      6. Verwenden eine kommerzielle Pumpe, befestigen Sie den Schlauch in den Kolben, und legen Sie die Parameter, die oben genannten Schritt 4.1.1^31,32,33.
   2. 50 mL HAEC Medium auf eine Endkonzentration von 5 μM für 30 min GI254023X hinzufügen.
   3. Mit dem vorgemischten GI254023X Inhibitor ADAM10, der Kerbe Signaltechnik, unterdrückt führen die gleichen Laminar-Flow oder pulsierender Fluss Experimente wie in 4.1.1.
   4. Quantifizierung von Notch-Liganden (Jag1, Jag2, und Dll4) und Notch Zielgene (behaarte und Enhancer von Split [Hes]) mit qRT-PCR für vier Gruppen von HAEC Proben (laminare Strömung, laminare Strömung + GI254023X, pulsierender Durchfluss pulsierender Fluss + GI254023X) beschriebenen³².

5. Rettungs- und Überexpression von Notch-Signalisierung

1. Spritzen 1 nL der vorbereiteten Nrg1 mRNA in einer Konzentration von 5 Pg/nL (aus Schritt 1.1.6) im 1-4-Zell-Stadium mit gata1a MO um Kerbe Ziel Gene²⁴overexpress.
2. Spritzen 1 nL Nrg1 mRNA in Wea -Mutante in einer ähnlichen Art und Weise²⁴.
3. Verdoppeln die Konzentration von Nrg1 mRNA (10 Pg/nL) und Spritzen²⁴ 1 nL in Zebrafisch, die Linksventrikuläre Morphologie zu beobachten.
4. Spritzen 1 nL 20 Pg/NB von EPA mRNA⁶ in der Zebrafisch-Embryonen im 1-4-Zell-Stadium Hämatopoese ventrikuläre WSS wie zuvor gezeigt²⁴erhöhen zu erweitern.
5. Spritzen 1 nL 50 μM Isoproterenol⁷, wodurch die Rate der Kontraktilität, dem E3-Medium für 24 h beim Zebrafisch erhöht werden wie bisher gezeigte²⁴kultiviert.
6. Durchführen Sie 4-D LSFM Bildgebung für jede Gruppe. Folgen Sie den Anweisungen in den Schritten 2.1.1-2.1.5.2.8.

(6) Quantifizierung der gebrochene Verkürzung und Lautstärke ändern im Laufe der Zeit

1. 4-D LSFM Bildgebung führen Sie für jede Gruppe in 50, 75 und 100 hpf. Befolgen Sie die Anweisungen im Schritte 2.1.1-2.1.5.2.8. Unterteilen Sie jedes Bild, damit jede 600 Knoten für die Replikation der Herzwand Bewegung hat.
2. Messen Sie die Änderung im Durchmesser des Ventrikels während der Diastole und Systole mithilfe der folgenden Formel:
   (3)
   Laden ventrikuläre 3D-Bilder auf jeden 0,1 s mit Visualisierungs-Software und Messen Sie das Volumen.
3. Zeichnen die Volumenänderung im Laufe der Zeit für jede Versuchsgruppe bei 75 hpf und 100 hpf.

Ergebnisse

LSFM wurde in diesem Manuskript verwendet, um hochauflösende 2-D und 3-d-Bilder zu erwerben. Wie in Abbildung 1A und 1 b, leitet die Beleuchtung Linse leichte Blatt an der Probe. Wegen der Schlankheit des leichten Blatts leuchtet nur ein einziges Flugzeug. Die Erkennung Linse ist senkrecht auf die Beleuchtung Linse positioniert und konzentriert sich auf die beleuchtete Fläche (Abbildung 1 b). Das leichte Blatt vo...

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass 4-D-Bildgebung verwendet werden kann, um die Entwicklung der trabekuläre Netzwerk als Reaktion auf Veränderungen der biomechanischen Kräfte zu verfolgen. Insbesondere initiiert die Scherspannung erfahrenen von Endothelzellen die Kerbe Signalkaskade, die wiederum Trabeculation fördert. In dieser Handschrift haben wir gezeigt, dass (1) gata1a MO-Injektion verminderte Blutbildung und daher es reduziert Wand Schubspannung, (2) tnnt2a MO-Injektion gehemmt ventrikul...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Clontech Hifi PCR Vormischung	Takara	639298	PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Humane Nrg1 cDNA	Geschenk von William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA	n/a	Wird für die Trabekulation rescue 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time-PCR-Nachweissystem	Bio-Rad	1855201	PCR-Maschine 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+	GE Health		Plasmid zur Synthese von mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nukleospin-Aufreinigungskit	Clontech	740609.25	DNA-Reinigung 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4-DNA-Ligase	Clontech	2011A	PCR-Ligationslösung 1.1.2.5
Stellare kompetente Zellen	Clontech	636763	E. coli Zellen, die für die Transformation verwendet werden 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz	Life Technologies	11668027	Transfektionsreagenz 1.1.4
mMessage SP6 Kit	Invitrogen	AM1340	Kit zur Synthese von mRNA 1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820	reinigt RNA  1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8	GeneTools	N/A	Software für das Primer-Design 1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA	Creative Biogene	CDFH006026	erhöht WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478	Sigma-Aldrich	T4182	ErbB-Inhibitor 1.3.1
E3-Medium			Zur Züchtung von Embryonen 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT	Sigma-Aldbsp;	D5942	γ-Sekretasehemmer 1.3.2
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Zur Aufnahme von Embryonen 2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT  Digitale CMOS-Kamera	Hamamatsu Photonics	C11440-42U	Zur Aufnahme von Bildern 2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software	FEI Software	N/A	Visualisierte und analysierte Bilder in 3D und 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaonmesylat	Sigma-Aldrich	886-86-2	Sedierung oder Tötung von Embryonen 3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890	Synthetisiert cDNA 3.1.2
Eppendorf 5424 Mikrozentrifuge	Eppendorf	05-400-005	Mikrozentrifuge 4.1.1.3
GI254023X	Sigma-Aldrich	260264-93-5	ADAM10-Inhibitor 4.1.2, 4.1.3
Isoprenalinhydrochlorid	Sigma-Aldrich	I5627	Isoproterenol erhöht WSS 5.1.5
MATLAB	Mathworks	N/A	Analyse der Herzmechanik