Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung von Herzen im Zebrafisch in 4 Dimensionen (4D) zu visualisieren. 4-D-Bildgebung, über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) dauert 3-dimensionale (3D) Bilder im Laufe der Zeit entwickelnde Herzen zu rekonstruieren. Wir zeigen qualitativ und quantitativ die Scherspannung aktiviert endokardialen Kerbe Signalisierung während der Entwicklung der Kammer, die kardiale Trabeculation fördert.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die hämodynamischen Kräfte durch die Herzen Einfluss kardiale Entwicklung, vor allem Trabeculation, bildet ein Netz von verzweigten Auswüchse von Myokard erlebt. Genetisches Programm Mängel in der Kerbe Signalisierung Kaskade ventrikuläre Defekte wie linken Ventricular Non-Compaction-Kardiomyopathie oder hypoplastischen Links-Heart-Syndrom beteiligt sind. Unter Verwendung dieses Protokolls, kann festgestellt werden, dass Schubspannung angetrieben Trabeculation und Notch signaling miteinander verbunden sind. Mit Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie war Visualisierung der entwickelnden Zebrafisches Herzen möglich. In diesem Manuskript wurde geprüft, ob hämodynamischen Kräfte die Einleitung der Trabeculation über die Kerbe Signalisierung modulieren und somit KONTRAKTILE Funktion beeinflussen auftritt. Für qualitative und quantitative Scheren Spannungsanalyse, 4-D (3-D + Zeit) Bilder wurden während der Zebrafisch kardiale Morphogenese erworben und integrierten Licht-Blatt-Fluoreszenz-Mikroskopie mit 4D Synchronisation erfasst die ventrikuläre Bewegung. Viskosität des Blutes verringerte Down-Regulierung Kerbe Signal- und mildernde Trabeculation über gata1a- Morpholino Oligonucleotides (MO) Mikro-Injektion, Schubspannung, dadurch zu verringern. Co-Injektion von Nrg1 mRNA mit gata1a MO gerettet Kerbe-Genen um die Trabeculation wiederherzustellen. Bestätigen Schubspannung getrieben Notch signaling beeinflusst Trabeculation Cardiomyocyte Kontraktion verhaftet weiter über tnnt2a-MO hämodynamischen Kräfte dabei reduzieren Down-Regulierung Kerbe Zielgene, non-trabekulierte zu entwickeln Myokard. Zu guter Letzt wurde Bestätigung der Expressionsmuster von Scherbeanspruchung reagierende Kerbe Gene von Endothelzellen pulsierender Strömung unterwerfen durchgeführt. So deckte die 4-D-Licht-Blatt-Mikroskopie hämodynamischen Kräfte zugrunde liegenden Kerbe Signal- und Trabeculation mit klinischer Relevanz, nicht-Verdichtung Cardiomyopathy.
Einleitung
Biomechanische Kräfte, wie hämodynamische Schubspannung sind kardiale Morphogenese eng beteiligt. In Reaktion auf die hämodynamische Scherkräfte entwickeln myokardialen Rillen und Nuten in einem wellenartigen trabekuläre Netzwerk in Übereinstimmung mit der Richtung der Schubspannung in der ventrikulären (AV) Ventil1. Kardiale Trabeculation ist notwendig, KONTRAKTILE Funktion und myokardialen Masse2zu erhöhen. Mutationen im Notch Signalwege führen angeborene Herzfehler bei Menschen und anderen Wirbeltieren3. Beispielsweise wurden gata1a4 und tnnt2a
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Die folgenden Methoden wurden in Übereinstimmung mit UTA und UCLA IACUC Protokolle durchgeführt. Diese experimentellen Gruppen dienten mit transgenen Tg(cmlc2:gfp), Wea (schwache Atrium) oder Clo (Cloche) Mutanten: (a) Wildtyp (WT) Kontrolle, (b) gata1a MO und (C) tnnt2a MO-Injektionen (Tabelle 1).
| Modell | Name | Veränderten Genen | Phänotyp | Referenz |
| .... |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
LSFM wurde in diesem Manuskript verwendet, um hochauflösende 2-D und 3-d-Bilder zu erwerben. Wie in Abbildung 1A und 1 b, leitet die Beleuchtung Linse leichte Blatt an der Probe. Wegen der Schlankheit des leichten Blatts leuchtet nur ein einziges Flugzeug. Die Erkennung Linse ist senkrecht auf die Beleuchtung Linse positioniert und konzentriert sich auf die beleuchtete Fläche (Abbildung 1 b). Das leichte Blatt vo.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass 4-D-Bildgebung verwendet werden kann, um die Entwicklung der trabekuläre Netzwerk als Reaktion auf Veränderungen der biomechanischen Kräfte zu verfolgen. Insbesondere initiiert die Scherspannung erfahrenen von Endothelzellen die Kerbe Signalkaskade, die wiederum Trabeculation fördert. In dieser Handschrift haben wir gezeigt, dass (1) gata1a MO-Injektion verminderte Blutbildung und daher es reduziert Wand Schubspannung, (2) tnnt2a MO-Injektion gehemmt ventrikul.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren möchten mit William Talbot von der Stanford University für die Bereitstellung des menschliches Dankbarkeit Nrg1 cDNA und Deborah Yelon von UCSD für die Bereitstellung der WEA Mutanten. Die Autoren möchten auch Cynthia Chen Danke für die Hilfe bei der Bildaufnahme. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse NIH HL118650 (zu t. k. Hsiai), HL083015 (zu t. k. Hsiai), HD069305 (zu N.C. Chi und t. k. Hsiai.), HL111437 (zu t. k. Hsiai und NC-Chi), HL129727 (zu t. k. Hsiai), T32HL007895 (....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Clontech Hifi PCR Vormischung | Takara | 639298 | PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4 |
| Humane Nrg1 cDNA | Geschenk von William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA | n/a | Wird für die Trabekulation rescue 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1 |
| CFX Connect™ Real-Time-PCR-Nachweissystem | Bio-Rad | 1855201 | PCR-Maschine 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2 |
| pCS2+ | GE Health | Plasmid zur Synthese von mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5 | |
| Nukleospin-Aufreinigungskit | Clontech | 740609.25 | DNA-Reinigung 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2 |
| T4-DNA-Ligase | Clontech | 2011A | PCR-Ligationslösung 1.1.2.5 |
| Stellare kompetente Zellen | Clontech | 636763 | E. coli Zellen, die für die Transformation verwendet werden 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2 |
| Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz | Life Technologies | 11668027 | Transfektionsreagenz 1.1.4 |
| mMessage SP6 Kit | Invitrogen | AM1340 | Kit zur Synthese von mRNA 1.1.6.3 |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | reinigt RNA 1.1.6.4, 3.1.2 |
| GeneTools 4.3.8 | GeneTools | N/A | Software für das Primer-Design 1.2.1, 3.1.3 |
| EPO cDNA | Creative Biogene | CDFH006026 | erhöht WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7 |
| AG1478 | Sigma-Aldrich | T4182 | ErbB-Inhibitor 1.3.1 |
| E3-Medium | Zur Züchtung von Embryonen 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5 | ||
| DAPT | Sigma-Aldbsp; | D5942 | γ-Sekretasehemmer 1.3.2 |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Zur Aufnahme von Embryonen 2.1.1.1 |
| ORCA-Flash4.0 LT Digitale CMOS-Kamera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Zur Aufnahme von Bildern 2.1.1.2, 2.1.1.3 |
| Amira Software | FEI Software | N/A | Visualisierte und analysierte Bilder in 3D und 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8 |
| Tricaonmesylat | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | Sedierung oder Tötung von Embryonen 3.1.1 |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Synthetisiert cDNA 3.1.2 |
| Eppendorf 5424 Mikrozentrifuge | Eppendorf | 05-400-005 | Mikrozentrifuge 4.1.1.3 |
| GI254023X | Sigma-Aldrich | 260264-93-5 | ADAM10-Inhibitor 4.1.2, 4.1.3 |
| Isoprenalinhydrochlorid | Sigma-Aldrich | I5627 | Isoproterenol erhöht WSS 5.1.5 |
| MATLAB | Mathworks | N/A | Analyse der Herzmechanik |
Referenzen
- Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
- Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.
The author list was updated from:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
to:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
The author affiliation for Rongsong Li was updated from:
Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA
to:
College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
