Methodenartikel

Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse

DOI:

10.3791/57781

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28. Juni 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Arbeit stellt eine Methode, um eine optogenetische Monoblock-Aufnahme zuverlässig aus einem wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode durchführen.

Zusammenfassung

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Es ist ein wichtiges Anliegen in den Neurowissenschaften wie verschiedene Arten von Neuronen arbeiten auf neuronale Schaltkreise. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben die Identifizierung des neuronalen in in Vivo elektrophysiologischer Experimente in breiten Hirnregionen aktiviert. Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Jedoch ist es oft schwer zu Anregung Licht an den tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns liefern. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Hier beschreiben wir eine Methode um Spike Antworten auf das Licht von einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in den tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.

Einleitung

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Das zentrale Nervensystem besteht aus verschiedenen Arten von Neuronen, die unterschiedliche Funktionen haben. Wie diese verschiedenen Arten von Neuronen innerhalb der neuronalen Schaltung funktionieren, ist eines der wichtigsten Anliegen in den Neurowissenschaften. In vielen Regionen des Gehirns war es jedoch unmöglich, die neuronalen Typen in in-Vivo -Aufnahmen der elektrischen Aktivitäten zu unterscheiden, denn es keinen klaren Unterschied in der elektrischen Spike-Signal selbst, mit einigen Ausnahmen gibt. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben einen Durchbruch1,2. Mit transgenen Tieren in der lichtempfindlichen Opsin (z.B.Channelrhodopsin-2) in bestimmten neuronalen Arten ausgedrückt ist, wurde es möglich, die neuronalen Arten effizient in in Vivo Aufnahmen3, 4,5,6. Bei diesen Tieren die Neuronen mit lichtempfindlichen Opsin sind durch lichtreize während der elektrische Aufnahmen geben aufgeregt, aber anderen Neuronen sind nicht. Opsin-positiven Neuronen, zeichnen daher leicht von anderen Neuron durch ihre Reaktionen auf Licht.

Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Als nicht-invasive Methode richtet das Licht oft von Oberfläche des Gehirns. Jedoch weil das Licht Stärke verringert während es Hirngewebe durchläuft, ist es schwer, die tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns zu stimulieren. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Elektrophysiologische Experimente wurden oft an narkotisierten Tieren durchgeführt, weil die Bewegung des Körpers Lärm in den Aufnahmen verursacht. Wie gut dokumentiert ist, ist jedoch Anästhesie bekannt, um die neuronalen Antworten7,8,9,10zu ändern. Daher ist es notwendig, wach Tiere zu nutzen, um neuronale Reaktionen ohne künstliche Effekte der Narkose zu studieren. Im Gegensatz zu den Experimenten mit narkotisierten Tieren werden die elektrophysiologischen Aufnahmen nach der Erholung von der Operation in den Experimenten mit wach Tieren durchgeführt. Während der Zeit zwischen der Operation und die Aufnahmen Gewebe Exsudat oft sammelt sich auf der Oberfläche des Gehirns und macht die optische Transparenz von der Oberfläche des Gehirns gering.

Hier beschreiben wir eine Methode um Monoblock-Aufnahmen aus einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.

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Protokoll

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Alle Verfahren sind im Einklang mit den Leitprinzipien der physiologischen Gesellschaft von Japan und mit Zustimmung der Animal Care Ausschuss von Kanazawa medizinischen Universität durchgeführt.

(1) Bau von Optrode Glashalter

Hinweis: Um ein Glashalter Optrode zu bauen, eine kommerzielle Elektrodenhalter verwendet (Abbildung 1A).

  1. Ziehen Sie das Stahlrohr für Druckregelung vorsichtig aus dem Faß des Inhabers.
  2. Durch Bohren, das Loch des Pin-Sitz-Seite in den Lauf des Inhabers zu erweitern. Machen Sie das Loch 3 mm im Durchmesser und 12 mm in der Tiefe.
  3. Setzen Sie ein Edelstahl-Rohr (Durchmesser 3 mm, 0,5 mm dick und 8 mm Länge; Abbildung 1A ( 2) in das Loch.
  4. Legen Sie eine Keramik Paarung Hülse für ⌀2.5 mm Ferrulen (Abbildung 1A1) in das Loch aufgeteilt.
  5. Befestigen Sie den Lauf des elektrodenhalters zu einem L-förmigen Falz mit Epoxy-Kleber.
  6. Machen Sie die Löcher (3 mm im Durchmesser) in den Falz und an einem Manipulator mit Schrauben befestigen.

2. Leiter Post Installation

  1. Bereiten Sie einen speziell angefertigten Kopf Beitrag gemacht der eine Leiterplatte Abstandhalter vor. Machen Sie den säulenförmigen Leiterplatte Abstandhalter in Form eines quaderförmigen mit einer Fräse und schneiden Sie es in 2 Kopf stellen mit einer Säge (Abbildung 1 b). Glätten Sie die Unterseite der Kopf Post mit einer Fräse.
  2. Bereiten Sie die transgenen Tieres, in denen eine lichtempfindliche Opsin in ein bestimmtes Neuron-Typ für die Studie zum Ausdruck kommt. In dieser Arbeit wird die transgenen Maus (VGAT-ChR2 Mäuse) in der hemmenden Neuronen Channelrhodopsin-2 (ChR2)11 Ausdrücken verwendet.
  3. Betäuben Sie das Tier mit einer Mischung von 0,3 mg/kg Medetomidine, 4,0 mg/kg Midazolam und 5,0 mg/kg Butorphanol durch intraperitoneale Verwaltung. Um zu bestätigen, dass das Tier vollständig betäubt ist, testen Sie seine Reaktionen um die Rute einklemmen.
  4. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen. Sauberen pad der stereotaktischen Rahmen und die Heizung mit 70 % Alkohol im voraus. Stellen Sie die Zähne in das Loch von der Snack-Bar, und ziehen Sie die Nase Spannbacke leicht an. Befestigen Sie beide Seiten des Kopfes mit Ohr-Stangen. Wenn der Kopf richtig durch die Ohr-Balken befestigt ist, ziehen Sie die Nase Spannbacke an. Anwenden einer ophthalmologischen Salbe für die Augen.
  5. Rasieren Sie die Kopfhaut mit einer kleinen Schere und Reinigen der Kopfhaut mit einem Wattestäbchen von Chlorhexidin Gluconat. Sterilisieren Sie vor der Operation alles, was, die der chirurgischen Instrumente und einen Kopf mit Autoklav (121 ° C, 15 min Posten).
  6. Die Kopfhaut entlang der Mittellinie mit einer Schere schneiden und zur Seite schieben. Den Schnitt von der Rückseite des Kopfes, der Augen (ca. 20 mm) zu machen. Entfernen Sie das Periost mit einem Wattestäbchen in 70 % Alkohol getaucht und trocknen Sie den Schädel.
  7. Legen Sie die Kopf Post auf der Manipulator. Positionieren Sie den Kopf Pfosten flach auf den Schädel um die Bregma mit der Manipulator.
  8. Mischen Sie das Monomer (4 Tropfen), Katalysator (1 Tropfen) und Polymer (1 kleiner Löffel) dental Zement auf einen kleinen Teller, der vorher im Kühlschrank gekühlt wird. Dental Zement (unter 1 g) legte die frontalen und parietalen Knochen des Schädels, die Kopf Post an den Schädel zu beheben.
  9. Nach der zahnärztliche Zement hart wird, entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen. Setzen Sie eine antibiotische Salbe auf die Haut. Spritzen Sie Medetomidine Antagonist (0,3 mg/kg) und Antibiotika (Oxytetracycline; 20 mg/kg). Platzieren überwachen Sie die Maus auf das Wärmekissen in einem Käfig zu, bis er erwacht und schicken Sie es an einem Gehäuse-Käfig.
  10. Haus das Tier in einem einzelnen Gehäuse-Käfig mit einigen Bereicherung Gerät. Ändern der tierischen Papiers Betten täglich, um den Käfig sauber zu halten und eine Infektion verhindern. Überprüfen Sie sorgfältig, ob das Tier Anzeichen von Unwohlsein zeigt. Soweit Lidocain auf die Wunde Schmerzen vermutet wird. Verwalten Meloxicam oder Carprofen einmal alle 24 h für 48 h nach beide Leiter-Installation und Kraniotomie Operationen Post. Die lokale Lidocain zusätzlich gegeben werden kann, wenn die NSAR nicht ausreicht.

(3) Akklimatisierung

  1. Akklimatisieren Sie (mindestens) zwei Tage nach der Erholung von der Narkose, die Tiere in den Kopf fixiert Zustand in der Aufnahme-Kammer. Führen Sie die Akklimatisierung Sitzungen für mindestens 5 Tage.
  2. Während der Akklimatisierung-Sessions legen Sie das Tier in der Aufnahme-Kammer mit dem Kopf Beitrag an einer speziell angefertigten Klemme befestigt. Während der Sitzung, um Bewegung zu begrenzen Abdeckung des Körpers mit einem maßgeschneiderten Harz Halbschlauch (Abbildung 1), machte mit einem 3D-Drucker.
    Hinweis: Am 1. Tag, sollte die Akklimatisierung Session 5 min lang sein. Es wird dann täglich um 10, 20, 40 und 60 min für Tage 2, 3, 4 und 5, bzw. erhöht.
  3. Am Ende jeder Sitzung belohnen Sie dem Tier essen. Wenn das Tier ständig während der Akklimatisierung kämpft, beenden Sie die Sitzung.

4. Kraniotomie

Hinweis: Nach der Akklimatisierung ist eine Kraniotomie über die Gehirnregion für die Aufnahme gemacht. Die Kraniotomie erfolgt in der stereotaktischen Rahmen unter Narkose, da mit dem Kopf Installation Posten. Die Post-operative Verfahren ist das gleiche wie die Leiter Installation Post.

  1. Reinigen Sie vor der Kraniotomie den Schädel mit einem Wattestäbchen mit Chlorhexidin Gluconat und 70 % Alkohol.
  2. Kratzen Sie sorgfältig den Schädel über die Aufnahme-Website mit einem Zahnbohrer. Sobald die Knochen dünn genug ist, schneiden Sie es mit der Spitze des Skalpells und entfernen Sie es.
  3. Dental Zement um der exponierten Region gelegt, um den Schädel zu stärken.
  4. Decken Sie die exponierte Hirnareal mit Silikonkleber, nachdem der dental Zement hart wird. Nach der Operation verläuft wie in Schritt 2.8 beschrieben.

5. elektrophysiologische Aufnahme

  1. Lassen Sie das Tier, für mindestens 1 Tag nach der Kraniotomie vor der Durchführung der elektrophysiologischen Aufnahme erholen. Legen Sie das Tier in der Aufnahme-Kammer, in der gleichen Weise, die es während der Akklimatisierung-Sessions gemacht wurde, wenn die Aufnahme beginnt.
  2. Glaspipetten aus Borosilikatglas Kapillaren zu machen (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm 90,0 mm lang) auf eine Elektrode Puller gezogen. Ihr Tipp-Durchmesser beträgt 2 – 3 µm, und ihr Widerstand ist 4 – 6 MΩ, wenn sie mit 10 mM PBS gefüllt sind. Die Länge der Elektrode ist 40-50 mm. In manchen Aufnahmen ergänzt, 2 % Neurobiotin 10 mM PBS.
  3. Die maßgeschneiderte Optrode Halter die gefüllten Glaspipette zuordnen.
  4. Die Glaspipette Ag-Cl beschichtet Silberdraht (0,2 mm im Durchmesser) umgesetzt. Verbinden Sie den Silberdraht mit ein Stift über eine dünne beschichtete Elektrokabel. Verbinden Sie die Pin mit der Headstage des Verstärkers Aufnahme.
  5. Die LWL-Patchkabel verbinden (Kern = 960 µm Verkleidung = 1.000 µm, NA = 0,63) mit einem Zirkonia zwinge (OD = 2,5 mm) nach der Paarung Hülse auf dem Optrode Halter Split. Drücken Sie die Patch-Kabel in die Hülse, bis die Spitze der zwinge am Ende die Glaspipette Kontakte. Die Patch-Kabel liefert das Licht (Wellenlänge = 465 nm) von LED. Das LED-Licht wird durch ein Einkanal-LED-Treiber gesteuert.
  6. Entfernen Sie den Silikonkleber über die Kraniotomie. Put angewärmte Kochsalzlösung (38 ° C) auf der Oberfläche des Gehirns in regelmäßigen Abständen zu verhindern, dass die Gehirn Oberfläche Trocknen während der Aufnahme-Session. Falls erforderlich, entfernen Sie die Dura mit scharfen Pinzette.
  7. Legen Sie die Glaselektrode in das Hirngewebe mit einem Manipulator. Der elektrodenwiderstand zu überwachen, wenn sie eingefügt wird. Die Elektrode zu ersetzen, wenn der Widerstand niedriger ist als erwartet, da die Elektrodenspitze möglicherweise beschädigt. Suchen Sie in einer Tiefe von Interesse und isolieren Sie die Einheit Spikes durch die Tiefe in 2 bis 5 µm Schritten anpassen.
  8. Nachdem die Einheit isoliert ist, liefern Sie die LED-Leuchte und beobachten Sie die Reaktion auf die lichtreize.
  9. Notieren Sie die neuronalen Aktivitäten nach der Identifizierung der Zelltypen. Führen Sie die Aufnahmen für 2 – 3 h. Erfolgt die Aufnahme an aufeinander folgenden Tagen (maximal 2 Tage), decken Sie die Kraniotomie mit Silikonkleber. Wenn die Aufnahme beendet ist, und das Tier geopfert, die Kopf Post abrufen und steckte es in Aceton zu waschen und wiederverwenden.

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Ergebnisse

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In Abbildung 2untersuchten wir die Auswirkungen der Werkzeugspitze ändern und die Länge der glaspipetten auf die Lichtleistung an der Spitze der Pipetten (Abbildung 2A-B). Die Lichtleistung wurde durch eine optische Leistungsmesser platziert 1 mm von der Spitze gemessen. Die volle Länge wurde auf 50 ± 2 mm eingestellt, wenn die Spitzengröße variiert während der Werkzeugspitze ändern bis 2,5 µm festgelegt wurde, w...

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Diskussion

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Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug in den Neurowissenschaften geworden. Es ist verwendet worden, für bestimmtes Neuron Typen in Vivo zu identifizieren sowie die Aktivitäten der spezifischen neuronalen Bahnen zu manipulieren. Die Klärung der neuronalen Aktivitäten der verschiedenen neuronalen Arten fördert das Verständnis des Mechanismus der neuronalen Schaltkreise. Hier haben wir eine Methode, um das Licht um die Aufnahme-Site durch eine Glaselektrode im IC von wach VGAT-ChR2 Mäusen zu liefern.

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Unterstützt wurden die Autoren von der Japan Society for Promotion of Science KAKENHI Grant JP16K11200 und 17 H 02223 und der Zuschuss für die Forschung von Kanazawa Medizinische Universität S2016-8 und C2017-3. Wir danken Yuhichi Kuda für seine Unterstützung bei der Aufnahme der Fotos.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ElektrodenhalterMolecular Device1-HL-UPipettenhalter für Mikroelektrodenverstärker
Keramische geteilte GegenhülseThorlabsADAF1f2,5 mm Ferrule
LeiterplattenabstandshalterTeishin DenkiSPA-320f8,0 mm, 20,0 mm lang
Stereotaktischer Rahmen für MäuseNarishigeSR-6M-HTStereotaktische Instrumente für Mäuse
ManipulatorNarishigeNAManueller Manipulator
SuperbondSun MedicalM: 204610557Zahnadhäsivharz
Zement Form2FormlabsNA3D-Drucker
Kwik-SilWPIKWIK-SILSilikonkleber mit geringer Toxizität
BorosilikatglaskapillarenNarishigeGD-1,5OD 1,5 mm, ID 0,9 mm, 90,0 mm lang
LWL-PatchkabelDoric LensesMFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5Monofiberoptik-Patchkabel, OD, 2,5 mm, Kern = 960 mm, Cladding = 1000 mm, NA = 0,63
Angeschlossene LEDDoric LensesLEDC-1B_FCZentrale Wellenlänge = 465 nm, Ausgangsleistung = 45 mW (Core 960 mm 0,63 NA )
LED-TreiberDoric LensesLEDRV_1CH_10001 Kanal LED-Treiber, maximale Leistung = 1000 mA
ElektrodenabzieherNarishigePB-7Zweistufiger Glas-Mikropipettenabzieher
Borosilikatglas KapillareNarishigeGD-1.5Bolosilikatglaskapillare, OD, 1,5 mm, ID, 0,9 mm, 90,0 mm lang
GENTACINMSD CO., Ltd185711173Antibiotische Salbe
Terramycin®-LAZoetisG 333Oxytetracyclin
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/JJackson Labs#14548VGAT-ChR2 Mäuse
Multiclamp 700BMolekulare Bauelemente2500-0157Mikroelektrodenverstärker

Referenzen

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Schlagwörter

Neuronale Identifizierungelektrophysiologische AbleitungGlasfaserkabelFixierung des Kopfst tzstiftsKraniotomie VerfahrenVGAT Channelrhodopsin IISpike Response Ableitung

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