Hier diskutieren wir eine Reihe von Protokollen für die Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in kultivierten Zellen. Wir konzentrieren uns auf unterschiedlichen Seneszenz-induzierende Stimuli und beschreiben die Quantifizierung der gemeinsamen Seneszenz-assoziierten Marker. Wir bieten technische Details mit Fibroblasten als Modell, aber die Protokolle können verschiedene zelluläre Modelle angepasst werden.
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Methodenartikel
Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des permanenten Zellzyklus Festnahme in Reaktion auf verschiedene schädliche Reize aktiviert. Aktivierung der zellulären Seneszenz ist ein Markenzeichen von diversen pathophysiologischen Bedingungen auch den Tumor Unterdrückung, Gewebe, Umbau und Alterung. Die Induktoren der zellulären Seneszenz in Vivo zeichnen sich nach wie vor schlecht. Eine Reihe von Reizen kann jedoch verwendet werden, Förderung der zellulären Seneszenz ex Vivo. Darunter sind die häufigsten Seneszenz-Induktoren replikativen Erschöpfung, ionisierender und nichtionisierender Strahlung, genotoxisch Drogen, oxidativen Stress und demethylating und acetylieren Agenten. Hier bieten wir detaillierte Anweisungen zur Verwendung dieser Reize, um Fibroblasten in Seneszenz zu induzieren. Dieses Protokoll kann problemlos für verschiedene Arten von Primärzellen und Zelllinien, einschließlich Krebszellen angepasst werden. Wir beschreiben auch verschiedene Methoden für die Validierung der Seneszenz Induktion. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Messung der Aktivität des lysosomalen Enzyms Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-gal), die Rate der DNA-Synthese mit 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine (EdU) Einbeziehung Assay, die Höhe der Expression des Zellzyklus Inhibitoren p16 p21, und der Ausdruck und Sekretion von Mitgliedern der Senescence-Associated sekretorischen Phänotyp (SASP). Endlich, wir bieten Beispielergebnisse und besprechen weitere Anwendungen dieser Protokolle.
Einleitung
Im Jahr 1961 berichtet Hayflick und Moorhead, dass primäre Fibroblasten in Kultur ihr proliferative Potential nach aufeinanderfolgenden Passagen1zu verlieren. Dieser Prozess wird durch die fortlaufende Verkürzung der Telomere nach jeder Zellteilung verursacht. Wenn die Telomere eine kritisch kurze Länge erreichen, sie sind anerkannt durch die DNA-Schäden-Antwort (DDR), die eine irreversible Verhaftung der Proliferation aktiviert – auch als replikative Seneszenz definiert. Replikative Seneszenz ist derzeit eines der vielen Reize, die bekannt sind, um einen Zustand der permanenten Zellzyklus Festnahme zu induzieren, die Zellen unempfindlich auf M....
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Protokoll
1. allgemeine Vorbereitung
- D10 Medium vorzubereiten. Ergänzung vom Medium-Glutamax DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin (Endkonzentration: 100 U/mL).
- Bereiten Sie sterile PBS. Lösen sich die Tabletten in Wasser nach Angaben des Herstellers. Von Autoklaven sterilisieren.
- 1 X Trypsin vorzubereiten. Verdünnen Sie 5 mL Trypsin-Versene EDTA/10 x 01:10 in 45 mL sterile PBS.
Hinweis: Im gesamten Protokoll, wir verwenden Zelle Kulturbedingungen, die näher an den physiologischen Bedingungen für primäre Fibroblasten. Dies bedeutet, dass wir Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 brüten, wie normalerweise getan sondern mit <....
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Ergebnisse
Bereicherung der SA-β-gal-Färbung in seneszenten Fibroblasten
Β-Galaktosidase (β-gal) ist eine lysosomale Enzym, das drückt sich in allen Zellen und hat einen optimalen pH-Wert von 4,025,26. Jedoch während der Seneszenz, Lysosomen an Größe zunehmen und infolgedessen seneszenten Zellen ansammeln β-gal. Die erhöhten Mengen dieses Enzyms machen es möglich, seine Tätigkeit auch.......
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Diskussion
Die hier erläuterten Protokolle wurden optimiert für menschliche primäre Fibroblasten, besonders BJ und WI-38 Zellen. Die Protokolle für replikative Seneszenz, ionisierende Strahlung und Doxorubicin, worden erfolgreich angewandt, um andere Arten von Fibroblasten (HCA2 und IMR90) und in andere Zelltypen (nämlich neonatale Melanozyten und Keratinozyten oder iPSC-abgeleitete Herzmuskelzellen) in unserem Labor. Anpassungen für weitere Zelltypen können jedoch durch Anpassung einige Details wie die Anzahl der gesetzten Zellen,.......
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Danksagungen
Wir danken Mitglieder des Demaria Labors für fruchtbare Diskussionen und Thijmen van Vliet für den Austausch von Daten und das Protokoll auf der UV-induzierten Seneszenz.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM Media - GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fötales Rinderserum-Hyklon | SV30160,03 | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10.000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nukleasefreies Wasser (nicht DEPC-behandelt) | Ambion | AM9937 | |
| T75 Kolben | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Lösung | Lonza | CC-5012 | |
| PBS Tabletten | Gibco | 18912-014 | |
| 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL Zentrifugenröhrchen | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-Well-Platte | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-Well-Platte | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm runde Deckgläser | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cäsium137-Quelle | IBL 637 Cäsium-137Γ-Strahlungsgerät | ||
| UV-Strahlungskammer | Opsytec, Dr. Gö bel BS-02 | ||
| Doxorubicin-Dihydrochlorid | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Wasserstoffperoxid-Lösung | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2'-Desoxycytidin | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Natriumbutyrat | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Zitronensäuremonohydrat | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Dibasisches Natriumphosphat | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Kaliumferrocyanid | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Kaliumferricyanid | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Natriumchlorid | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesiumchlorid | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% Glutaraldehyd | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% Formaldehyd (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-Ethinyl-2'-desoxyuridin) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanin3-azid (Sulfo-Cy3-azid) | Lumiprobe | D1330 | |
| Natriumascorbat | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIS Base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, weiß | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 Siegelfolie | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Sondenbibliothek | Sigma-Aldrich | Verschiedenes | |
| Humanes IL-6 DuoSet ELISA | R& D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Zählobjektträger | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Trockenbrutschrank | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamid | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' Laborfilm | Bemis | ||
| Pinzettennadeln | |||
Referenzen
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
