Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Sabyasachi Dash; Muthukumar Balasubramaniam; Chandravanu Dash; Jui Pandhare

doi:10.3791/57786

Methodenartikel

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

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DOI:

10.3791/57786

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12. Juni 2018

Sabyasachi Dash¹^,²^,³ , Muthukumar Balasubramaniam² , Chandravanu Dash² , Jui Pandhare²

¹School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, ²1. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, ³Kalinga Institute of Industrial Technology University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.

Zusammenfassung

Micro-RNAs (MiRNAs) sind eine Klasse von kleinen Forensisches RNAs, die post-transcriptionally zellulären Genexpression regulieren. MiRNAs binden an die 3' untranslatierten Region (UTR) target mRNA zu Protein Übersetzung hemmen oder in einigen Fällen verursachen mRNA Abbau. Die Bindung von MiRNA, die 3' UTR des Ziels, die mRNA durch eine 2 – 8 Samen Nukleotidsequenz am 5'-Ende der MiRNA vermittelt wird. Während die Rolle von MiRNAs als zelluläre Regulatorische Moleküle gut etabliert ist, bleibt Identifikation von der Ziel-mRNAs mit funktionelle Relevanz eine Herausforderung. Bioinformatic Hilfsmittel sind eingesetzt worden, Sequenzen innerhalb der 3' UTR von mRNAs als potentielle Ziele für MiRNA Bindung vorherzusagen. Diese Werkzeuge wurden auch genutzt, um die evolutionäre Erhaltung solcher Sequenzen unter verwandten Arten in einem Versuch, die funktionelle Rolle Vorhersagen zu bestimmen. Aber diese Berechnungsmethoden oft falsch-positive Ergebnisse zu generieren und beschränken sich auf die Vorhersage kanonische Zusammenspiel von MiRNA und mRNA. Experimentelle Verfahren, die direkte Bindung von MiRNA mRNA Ziel Messen sind daher notwendig, um funktionelle Interaktion herzustellen. In diesem Bericht beschreiben wir eine empfindliche Methode für die direkte Interaktion zwischen der zellulären MiRNA-MiR-125b und der 3' UTR von PARP-1 mRNA Validierung. Wir erarbeiten ein Protokoll, in dem synthetischen biotinylierte-MiRNA imitiert wurden in Säugerzellen transfiziert und der MiRNA-mRNA-Komplex in die zelluläre lysate wurde mit magnetischen Beads Streptavidin beschichteten abgerissen. Schließlich das Ziel, die, das mRNA in das nach unten gezogen-Nukleinsäure komplexe quantifiziert wurde mit einem qPCR-basierte Strategie.

Einleitung

Micro-RNAs (MiRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs, die Protein-Expression-¹negativ regulieren. Vorläufer der MiRNA befinden sich im Cluster durch viele Regionen des Genoms, am häufigsten in den intergenetischer Regionen und Introns der Protein-kodierenden Gene²^,³. Biogenese von MiRNAs beinhalten Transkription von Pri-MiRNAs von MiRNA-Kodierung Gene⁴. Die Pri-MiRNAs unterziehen sequenzielle Verarbeitung, zuerst in den Zellkern und dann im Zytoplasma, einzelne gestrandeten Reife MiRNAs⁴^,⁵zu generieren. ....