Method Article

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Micro-RNAs (MiRNAs) sind eine Klasse von kleinen Forensisches RNAs, die post-transcriptionally zellulären Genexpression regulieren. MiRNAs binden an die 3' untranslatierten Region (UTR) target mRNA zu Protein Übersetzung hemmen oder in einigen Fällen verursachen mRNA Abbau. Die Bindung von MiRNA, die 3' UTR des Ziels, die mRNA durch eine 2 – 8 Samen Nukleotidsequenz am 5'-Ende der MiRNA vermittelt wird. Während die Rolle von MiRNAs als zelluläre Regulatorische Moleküle gut etabliert ist, bleibt Identifikation von der Ziel-mRNAs mit funktionelle Relevanz eine Herausforderung. Bioinformatic Hilfsmittel sind eingesetzt worden, Sequenzen innerhalb der 3' UTR von mRNAs als potentielle Ziele für MiRNA Bindung vorherzusagen. Diese Werkzeuge wurden auch genutzt, um die evolutionäre Erhaltung solcher Sequenzen unter verwandten Arten in einem Versuch, die funktionelle Rolle Vorhersagen zu bestimmen. Aber diese Berechnungsmethoden oft falsch-positive Ergebnisse zu generieren und beschränken sich auf die Vorhersage kanonische Zusammenspiel von MiRNA und mRNA. Experimentelle Verfahren, die direkte Bindung von MiRNA mRNA Ziel Messen sind daher notwendig, um funktionelle Interaktion herzustellen. In diesem Bericht beschreiben wir eine empfindliche Methode für die direkte Interaktion zwischen der zellulären MiRNA-MiR-125b und der 3' UTR von PARP-1 mRNA Validierung. Wir erarbeiten ein Protokoll, in dem synthetischen biotinylierte-MiRNA imitiert wurden in Säugerzellen transfiziert und der MiRNA-mRNA-Komplex in die zelluläre lysate wurde mit magnetischen Beads Streptavidin beschichteten abgerissen. Schließlich das Ziel, die, das mRNA in das nach unten gezogen-Nukleinsäure komplexe quantifiziert wurde mit einem qPCR-basierte Strategie.

Introduction

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Micro-RNAs (MiRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs, die Protein-Expression-1negativ regulieren. Vorläufer der MiRNA befinden sich im Cluster durch viele Regionen des Genoms, am häufigsten in den intergenetischer Regionen und Introns der Protein-kodierenden Gene2,3. Biogenese von MiRNAs beinhalten Transkription von Pri-MiRNAs von MiRNA-Kodierung Gene4. Die Pri-MiRNAs unterziehen sequenzielle Verarbeitung, zuerst in den Zellkern und dann im Zytoplasma, einzelne gestrandeten Reife MiRNAs4,5zu generieren. Anschließend die Reife MiRNAs fließen in den RNA-induced silencing-Komplex (RISC): ein Multimeric Protein-RNA-Komplex, der ein Mitglied der Argonaut-Familie von Proteinen für Ziel Anerkennung4,5, enthält 6,7. Reife MiRNAs in komplexen RISC überwiegend binden an die 3' UTR Ziel mRNAs8,9,10 aber können auch gelegentlich in der Kodierung und der 5' UTR Region der mRNA10,11 binden . Die Bindung von MiRNA, die mRNA-Sequenzen Ergebnisse in translational stummschaltungs-12,13,14 und in einigen Fällen mRNA Destabilisierung15. Da ein einzelnes MiRNA viele mRNAs ausrichten kann, diese Regulatorische Moleküle sind fast alle zellulären Prozess beteiligt und haben in verschiedenen Krankheit Bedingungen16,17,18in Verbindung gebracht.

Detailliertes Verständnis der wie MiRNAs zelluläre Signalwege regulieren erfordert Identifizierung des Ziels mRNAs. Mehrere Bioinformatik-Plattformen zur Verfügung, vermeintliche MiRNA:mRNA Interaktionen19,20vorherzusagen. Diese Vorhersagen verlassen sich auf perfekte Watson-Crick-Basenpaarung zwischen den 2 – 8 Samen Nukleotidsequenz von der MiRNA und einer komplementären Sequenz innerhalb der Ziel-mRNA-4,-21. Darüber hinaus diese Tools generieren Sekundärstruktur des MiRNA:mRNA Duplex, thermodynamischen Parameter dieser molekularen Wechselwirkung berechnen und zeigen Erhaltung der die Bindungsstellen über Artgrenzen, funktionelle Relevanz des Ziels zu verbessern Vorhersage. Leider haben diese Tools auch die Begrenzung der Vorhersage falsch positive Ziele um eine sehr hohe Rate (~ 27 – 70 %)15,22. Am wichtigsten ist, nicht diese in Silico -Plattformen, der nicht-kanonischen Wechselwirkungen von MiRNAs mit ihrer Ziele23zu erkennen. Daher sind solche vorausschauenden Analysen oft mit experimentellen Methoden, um funktionell relevante Ziele validieren kombiniert.

Mehrere Ansätze wurden entwickelt, um MiRNA:mRNA Wechselwirkung experimentell zu überprüfen. Genetische Experimente mit MiRNA Mimik, Aufschlüsse Schwämme und Inhibitoren, die die Ebenen von MiRNAs in der Zelle ändern für seine regulierende Wirkung auf die Ziel-Gen Ausdruck24,25,26. Darüber hinaus Reporter basierte Assays über Co-Transfektion eines Klons mit der 3' UTR-Region von der Ziel-mRNA und MiRNA-Fließbildern oder Inhibitoren in Zellen liefern Hinweise auf die regulatorische Funktion der MiRNAs26. Während diese Methoden entscheidend für posttranskriptionelle Regulation der Genexpression von MiRNAs studieren, sind Transfektion Effizienz und Pleotropic Effekte von Veränderungen in der zellulären MiRNA Ebenen wesentliche Einschränkungen diese gentechnische Ansätze23, 26. Daher werden ergänzende biochemische Methoden, die direkte Interaktion zwischen MiRNA und seinem Ziel Sonde eingesetzt, um besser zu verstehen, die zelluläre Funktion der MiRNAs.

Eine weit verbreitete Methode, direkte Interaktion zwischen MiRNA und seinem Ziel zu studieren ist Immunopräzipitation der RISC Komplex, gefolgt von den Nachweis von mRNA Ziel innerhalb der komplexen27,28,29,30 . Vor kurzem wurde auch eine verbesserte RISC-Trap-Methode eingesetzt, um MiRNA Ziele zu identifizieren; Stabilisierung der Ziele innerhalb der RISC-MiRNA-mRNA Zwischenprodukte Paare es mit der Reinigung der mRNA-Ziele. Aber diese Methodsface die inhärenten Herausforderungen der unspezifische Wechselwirkungen zwischen RNA und RNA-bindende Proteine, die in der Regel von zellulären Kompartimenten31,32getrennt werden. Darüber hinaus sind diese Tests auf das Vorhandensein von Protein AGO2 für Immunopräzipitation RISC Komplex33angewiesen. Angesichts der Tatsache, dass AGO2 nicht die einzige Argonaut ist, effiziente MiRNA:mRNA Interaktionen vermitteln, führen verzerrte Ergebnisse34Ausschluss von anderen Argonautes. Deshalb sind alternative Strategien erforderlich, um direkte Bindung von MiRNA zu mRNA zu studieren.

In diesem Bericht erarbeiten wir einen einstufigen Ansatz zum Sondieren direkte Interaktion zwischen einem MiRNA und seinem Ziel mRNA. Erstens sind 3' biotinylierte gesperrt Nukleinsäure (LNA) MiRNA Mimik in Säugerzellen transfiziert. Dann ist der MiRNA:mRNA Komplex in die zelluläre lysate mit Streptavidin beschichteten magnetische Beads erfasst. Die mRNA-Ziel verpflichtet, seine ergänzenden MiRNA wird quantifiziert mit qPCR.

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Protocol

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1. die Transfektion von 3' biotinylierte miRNA

Hinweis: Führen Sie folgende Schritte in eine sterile Laminar-Flow-Kapuze.

  1. 4 x 105– 5 x 105 HEK 293T Samenzellen pro Bohrloch in 2 mL komplett Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) [DMEM mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 1 x Stift-Strep Antibiotikum ergänzt]. Kultur der Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 über Nacht eingestellt.
  2. Am nächsten Tag, überprüfen Sie die Gesundheit und die Einhaltung der vergoldeten Zellen unter einem Lichtmikroskop.
    Hinweis: Stellen Sie sicher die Zellen haben eingehalten und erreicht entsprechende Morphologie, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Die HEK-293T-Zellen sind in der Regel bereit zur Transfektion 18 – 24 h post-Beschichtung.
  3. Verdünnen Sie in einem sterilen 1,7 mL Microfuge Rohr 75 Picomoles der biotinylierte MiRNA in 200 µL der minimalen wesentlichen Medien. Übertragen Sie diese Mischung auf eine weitere 1,7 mL Microfuge Rohr enthaltenden Liposomen basierend Transfektion Reagenz (8 µL/Well) verdünnt in 200 µL der minimalen wesentlichen Medien. Mischen Sie gründlich, aber sanft, durch pipettieren und inkubieren Sie für 20-25 min bei Raumtemperatur zur Bildung der Transfektion komplexe ermöglichen.
  4. Entfernen Sie die alten Medien aus der Platte 6 gut Kultur durch sanfte pipettieren und ergänzen Sie jedes gut mit 1,6 mL frisch zubereitete komplette DMEM (ohne 1 x Stift-Strep Antibiotika).
  5. Fügen Sie die Transfektion komplexe (ab 1.3) tropfenweise auf die Zellen in der 6-Well-Platte mit einer gut kalibrierten Pipette. Schwenken Sie die Platte vorsichtig beim Hinzufügen der komplexe um ihre gleichmäßige Verteilung über die Platte zu gewährleisten.
    Hinweis: Dieser Schritt ist sehr wichtig für die Erreichung Hocheffizienz Transfektion und muss mit Sorgfalt und Geduld durchgeführt werden.
  6. Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 für mindestens 36 Stunden.

2. Vorbereitung des Streptavidin beschichteten magnetische Beads – ich

  1. Die Streptavidin magnetische Beads gründlich durch Vortexen aufzuwirbeln. Übertragen Sie 30 µL Wulst Suspension (je Probe) auf ein 2 mL Nuklease-freie Microfuge Rohr.
  2. Legen Sie das Rohr mit der Perle Federung auf die magnetische Wulst Trennzeichen stehen (im folgenden "Magnet") für 2 min. Entfernen Sie nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Perlen auf die Seite des Rohres in Kontakt mit den Magneten gezogen sind vorsichtig den Überstand mit einer Mikropipette.
  3. Die Perlen 100 µL Waschpuffer Perlen (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) hinzufügen. Entfernen Sie den Schlauch vom Magneten. Wirbel für 15 s bei Raumtemperatur, die Perlen zu waschen.
  4. Legen Sie die Röhrchen mit Perlen auf den Magneten für 2 min und sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 für eine Gesamtmenge von drei Wäschen. Entfernen Sie nach dem letzten Waschschritt das Rohr vom Magneten.
  6. 100 µL RNase-Lösung (0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl) zu befreien, um die Perlen hinzufügen, mischen Sie gut durch Vortexen für 15 s, und bei Raumtemperatur inkubieren, für 5 min. statt der Röhrchen mit Perlen auf den Magneten für 2 min und sorgfältig entfernen und entsorgen den überstand.
  7. Wiederholen Sie Schritt 2.6 für insgesamt drei Mal.
  8. Die Perlen, Wirbel 15 s Perle Wiederfreisetzung Lösung (0,5 M NaCl) hinzu und bei Raumtemperatur inkubieren Sie, 5 min. die resuspendierte Perlen auf den Magneten für 2 min, und entfernen Sie vorsichtig den überstand.
  9. Die Perlen fügen Sie 200 µL der Wulst blockiert Lösung (1 µg/µL BSA, 2 µg/µL Hefe tRNA hinzu). Mix von sanften Vortexen für 15 s bei Raumtemperatur. Bei 4 ° C für 16 Stunden (über Nacht) auf ein Multi-Tube Rotator inkubieren.

3. Vorbereitung der Zelle Lysates

  1. Ernte die transfizierten Zellen HEK-293T durch sanfte Kratzen mit einem sterilen Zelle Schaber in der laminaren Kapuze, dann jede Probe in ein steril 2 mL Microfuge Rohr übertragen.
  2. Pellet-geschabten Zellen durch Zentrifugation bei 1.500 X g für 5 min. Aufschwemmen das Pellet in 1 x sterile PBS (Phosphat-Puffer Kochsalzlösung), pH 7,2. Zentrifuge wieder bei 1.500 X g für 5 min um ein Pellet verbleibende Medien kostenlos zu erhalten. Sofort stürzen die Röhrchen mit Pellet in Eis.
  3. Bereiten Sie komplette Frischzellen Lyse Puffer (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH 7.5, 5mM DTT, 0,5 % IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x Protease-Hemmer).
    Hinweis: Eine Aktie der Zelle Lysis Puffer fehlt IGEPAL, Superase und Protease-Inhibitor-Cocktail kann im Voraus vorbereitet und bei Raumtemperatur gelagert. Bereiten Sie eine neue Charge von kompletten Zelle Lysis Puffer, indem die oben genannten Ergänzungen bei den empfohlenen Endkonzentrationen auf Lager Zelle Lysis Puffer und Speicherung auf Eis.
  4. Jede Probe in der Microfuge Röhre (d. h. jedes Microfuge Rohr Zellen aus einem Brunnen des 6-Well-Platte enthält) 260 µL eiskalte vollständige Zelle Lysis Puffer hinzu und Aufschwemmen der Zelle Pellet in eine homogene Suspension durch pipettieren.
  5. Lösen Sie die Zellen mit der Frost-Tau-Methode: die Rohre bei-80 ° C für 10 – 15 min inkubieren. Führen Sie die Zellen, die auf dem Eis Auftauen.
  6. Zentrifugieren Sie die daraus resultierenden Zelle lysate 16.000 x g für 5 min in einer gekühlten Benchtop-Zentrifuge bei 4 ° c eingestellt
  7. Übertragen Sie die gelöschte Zelle lysate zu einem sterilen 1,7 mL Microfuge Schlauch auf Eis. Entsorgen Sie das Pellet.
    Anmerkung: Der letzte Band der gelöscht lysate sollte ~ 240 – 250 µL.
  8. Eine Endkonzentration von 1M 5 M NaCl auf den geräumten lysate hinzu und pflegen Sie die Proben auf Eis.

4. Vorbereitung der magnetischen Beads Streptavidin-II

  1. Bereiten Sie frische komplette Pulldown-Waschpuffer (10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DVB-t, 1 M NaCl, 0,5 % IGEPAL, 60U/mL Superase und 1 X Proteaseinhibitor Cocktail)
    Hinweis: Ein Bestand von Pulldown-Waschpuffer fehlt IGEPAL, Superase und Protease-Inhibitor-Cocktail kann im Voraus vorbereitet und bei Raumtemperatur gelagert. Bereiten Sie eine neue Charge von kompletten Zelle Lysis Puffer, indem die oben genannten Ergänzungen bei den empfohlenen Endkonzentrationen auf Lager Zelle Lysis Puffer und Speicherung auf Eis.
  2. Legen Sie das Rohr mit das der vorbereiteten Perlen (aus Schritt 2,9) auf den Magneten für 2 min. vorsichtig entfernen und entsorgen den überstand.
  3. Die Perlen 150 µL des eiskalten komplette Pulldown-Waschpuffer hinzufügen. Wirbel für 15 s und 30-60 S. Ort die Rohre auf den Magneten für 2 min. vorsichtig entfernen und entsorgen den Überstand bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Wiederholen Sie Schritt 4.3 für insgesamt 3 Mal.
  5. Die Perlen in 300 µL kompletten Pulldown-Waschpuffer aufzuwirbeln.

(5) Pull-Down der Ziel-mRNA-MiRNA-komplexe

  1. 300 µL der Zelle lysate (aus Schritt 3,8) übertragen, die Microfuge Röhrchen mit 300 µL Perlen (aus Schritt 4.5).
  2. Inkubieren Sie die Mischung auf einem Nutating Mixer für 1 h bei Raumtemperatur.
  3. Legen Sie das Rohr auf den Magneten, denn 5 min. vorsichtig entfernen und entsorgen den überstand.
  4. Die Perlen 300 µL der eiskalte komplette Pulldown-Waschpuffer hinzufügen. Wirbel für 15 s bei Raumtemperatur und Ort das Rohr auf den Magneten für 5 min. vorsichtig entfernen und entsorgen den überstand.
  5. Wiederholen Sie Schritt 5.4 zwei weitere Male.
  6. Aufschwemmen Sie die Perlen in 100 µL Nuklease-freies Wasser und inkubieren Sie auf Eis.

6. total RNA-Extraktion, cDNA Synthese und qPCR

  1. Die resuspendierte Perlen (aus Schritt 5.6) total RNA extrahieren mit einer geeigneten Methode (siehe Tabelle der Materialien). Die extrahierte gesamte-RNS in 25 µL Nuklease-freies Wasser aufschwemmen. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und Qualität mit einem Spektralphotometer (Extinktion bei 260/280). Bereiten Sie eine arbeiten-Aktie von RNS zu 50 ng/µL.
  2. Führen Sie cDNA Synthese, in Triplicates, mit 50 ng von Gesamt-RNS (aus Schritt 6.1) mit einer entsprechenden cDNA Synthese kit (siehe Tabelle der Materialien) mit Oligo-dT-Primer in einem Endvolumen von 20 µL (Tabelle 1). Dann Last PCR Schläuche in das qPCR Instrument Temperaturzyklen gemäß den in Tabelle 2beschriebenen Bedingungen durchführen.
  3. Führen Sie qPCR auf die CDNA (aus Schritt 6.2) mit SYBR Green Chemistry (siehe Tabelle der Materialien):
    1. Führen Sie alle qPCR Reaktionen im Triplicates in eine 96 gut klar Bodenplatte unter sterilen Bedingungen.
    2. Aliquoten 9 µL des Reaktionsgemisches vom qPCR Master in jede Vertiefung der Platte mischen (siehe Tabelle 3). Dann fügen Sie 1 µL cDNA in jede Vertiefung zu einem Endvolumen von 10 µL. Dichtplatte die PCR mit hitzebeständigen PCR Platte Sealer und laden Sie in das qPCR-instrument
    3. Durchführen Sie Temperaturzyklen gemäß den in Tabelle 4beschriebenen Bedingungen.
    4. Der Ausdruck Ebenen (Ct-Werte) der Samples, die Ausdruck Steuerungsebenen die verschlüsselte zu normalisieren. Verwenden Sie diese Werte, um Falten Änderungen im Ausdruck berechnen.

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Results

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MiRNAs regulieren zelluläre Prozesse durch die Bindung an Ziel mRNAs. Daher sind identifizierende mRNA Ziele eine wichtige, MiRNA Funktion zu verstehen. Hier erarbeiten wir eine Methode zur Identifizierung von mRNA Ziel der zellulären MiRNA. Dieses Protokoll wird von Wani Et al. 35 mit der Änderung der Nutzung biotinylierte LNA-basierte MiRNA Mimik, Pulldown Ziel mRNA. Die Verwendung von LNA-basierte Oligonukleotid Fließbildern verbessert Spezifität Ziel B...

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Discussion

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Identifizierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs ist wichtig für das Verständnis ihrer regulatorischen Funktion. Mehreren Berechnungswerkzeuge werden eingesetzt, um Ziele auf der Grundlage Samen Reihenfolge Komplementarität und die Erhaltung der Ziel-Sequenzen19,20vorherzusagen. Obwohl diese Tools wertvoll sind, können sie hohe falsch positive und falsch negative generieren. Daher sind diese Vorhersagen gekoppelt mit experimentellen Methoden wie Immunopräzipi...

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine finanzielle und nicht finanzielle Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch die National Institutes of Health (NIH) Zuschüsse DA037779 (zu J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 und MD007586 (auf CD). Auch die RCMI Grant G12MD007586, Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, unterstützen die Arbeit war das Meharry translationale Research Center (MeTRC) CTSA gewähren (U54 RR026140 von NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 aus NIMHD/NIH und der Tennessee-Center for AIDS Forschung (P30 AI110527).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zelllinien- HEK293TZellen ATCCCRL-3216
Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
Trypsin-EDTA (0,25%) GIBCO/Thermofisher25200-056
Penicillin-Streptomycin-Lösung (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase AmbionAM2238
Opti-MEM Medium mit reduziertem SerumGIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 TransfektionsreagenzInvitrogen/ Thermofisher11668-019
Biotinyliertes has-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
Biotinyliertes RührmittelExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
Streptavidin Magnetische KügelchenPierce88816
Hefe tRNAInvitrogen/Thermofisher15401-011
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Kaliumchlorid (KCl)Lösung Sigma-Aldrich60142
Magnesiumchlorid (MgCl2)-LösungSigma-AldrichM1028
Natriumhydroxid (NaOH)Sigma-Aldrich795429
Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz (EDTA)-Lösung, 0,5 M, pH 8,0Sigma-AldrichE7889
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
Protease-Inhibitor-CocktailSigma-AldrichP8340
RNAse/DNAsefreies WasserGIBCO/Thermofisher10977-015
RNeasy ExtraktionskitQiagen74104
iScript-Select cDNA-SynthesekitBiorad170-8897
qPCR Primer Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR grünsupermix Biorad172-5120
DynaMag-Spin MagnetInvitrogen/Thermofisher12320D

References

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