Methodenartikel

Schnelle, skalierbare Montage und Beladung von bioaktiven Proteinen und Immunstimulantien in diversen synthetischen darin über Flash-Nanoprecipitation

DOI:

10.3791/57793

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11. August 2018

 ,  , 
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Nanomaterialien bieten vielseitige Mechanismen der kontrollierten therapeutischen Lieferung für Grundlagenforschung und Translationale Anwendungen, aber oft ihre Herstellung erfordert Fachwissen, das in den meisten biomedizinischen Labors nicht verfügbar ist. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für die skalierbare Fertigung und therapeutische laden diverse selbstgebaute darin, die Verwendung von Flash-Nanoprecipitation.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanomaterialien präsentieren eine breite Palette von Optionen, um die kontrollierte Lieferung von Einzel- und kombinierte Molekulare Nutzlasten für therapeutische und imaging Anwendungen anzupassen. Diese erhöhte Spezifität kann signifikante klinische Implikationen, darunter geringere Nebenwirkungen und niedrigere Dosierungen mit höhere Potenz haben. Darüber hinaus können die Ausrichtung in Situ und kontrollierten Modulation von bestimmten Zelle Teilmengen verbessern in Vitro und in Vivo Untersuchungen der grundlegenden biologischen Phänomene und Sonde Zellfunktion. Leider das nötige Expertenwissen in der Nanotechnologie, Chemie und Technik oft verbieten Labors ohne Erfahrung in diesen Bereichen Herstellung und Anpassung von Nanomaterialien als Werkzeuge für ihre Untersuchungen oder Fahrzeuge für ihre therapeutische Strategien. Hier bieten wir Protokolle für die Synthese und skalierbare Montage eines vielseitigen ungiftig Block-Copolymer Systems zur oberflächlichen Bildung zugänglich und Laden von nanoskaligen Fahrzeuge für biomedizinische Anwendungen. Flash-Nanoprecipitation präsentiert sich als eine Methode zur schnellen Herstellung von vielfältigen darin aus Poly(ethylene glycol) -Bl-Poly (Propylen Sulfide) Copolymere. Diese Protokolle können Laboratorien mit einer breiten Palette von Kompetenzen und Ressourcen, um einfach und reproduzierbar fertigen fortschrittliche Nanocarrier-Delivery-Systeme für ihre Anwendungen. Planung und Bau von automatisierten Instrument, das eine High-Speed-Spritzenpumpe zur Erleichterung der Flash-Nanoprecipitation beschäftigt und um bessere Kontrolle über die Homogenität zu ermöglichen, Größe, Morphologie und Beladung des Polymersome darin ist beschrieben.

Einleitung

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Darin zu ermöglichen, für die kontrollierte Lieferung kleiner und makromolekularen Ladung, einschließlich aktive Einheiten, wenn nicht gekapselt, wäre entweder hoch abbaubar und/oder auch hydrophobe für Administration, in Vivo. Die Nanocarrier Morphologien regelmäßig fabriziert bieten Polymeren Vesikel analog zu Liposomen (auch Polymersomes genannt) die Möglichkeit, hydrophile und hydrophobe Cargo1,2gleichzeitig zu laden. Trotz ihrer vielversprechenden Vorteile sind Polymersomes immer noch selten in der klinischen Anwendung zurückzuführen, zum Teil auf mehrere wichtige Herausforderungen in ihren Fertigungsprozessen. Für den klinischen Einsatz Polymersome Formulierungen in großen, sterilen und konsistente Chargen vorgenommen werden müssen.

Eine Reihe von Techniken kann verwendet werden, um Form Polymersomes aus einer Diblock Copolymers, wie zum Beispiel Poly(ethylene glycol) -Block-Poly (Propylen Sulfide) (PEG -Bl- PPS), enthalten Lösungsmittel Dispersion3, Dünnschicht Rehydratation1 , 4, Mikrofluidik 5,6und direkte Hydratation7. Solvent Dispersion beinhaltet langen Inkubationszeiten in Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln, die einige bioaktiven Nutzlasten, wie Proteine denaturieren können. Dünnschicht-Rehydratation bietet keine Kontrolle über die Polydispersität von der gebildeten Polymersomes, häufig erfordert kostspielige und zeitraubende Extrusion Techniken, um akzeptable Monodispersity zu erreichen. Darüber hinaus sind sowohl die Mikroflüssigkeiten als auch die direkte Hydratation schwer zu skalieren für größere Produktionsmengen. Von den verschiedenen Nanocarrier Herstellungsmethoden bietet Flash-Nanoprecipitation (FNP) die Möglichkeit, umfassende und reproduzierbare Rezepturen8,9,10machen. Während FNP bisher für die Formulierung von Solid-Core Nanopartikel vorbehalten war, unser Labor hat vor kurzem erweitert den Einsatz von FNP sollen die konsequente Bildung von vielfältigen PEG -Bl- PPS Nanostruktur Morphologien11, 12, davon Polymersomes11 und Bicontinuous nanokugeln12. Wir fanden, dass FNP bilden Monodisperse Formulierungen von Polymersomes ohne die Notwendigkeit für Extrusion, was zu überlegen Polydispersität Index-Werte im Vergleich zu nicht extrudiert Polymersomes gebildet von Dünnschicht Rehydratation und Lösungsmittel dispersion 11. Bicontinuous nanokugeln mit ihrem großen hydrophoben Domänen konnten nicht von Dünnschicht Rehydratation, trotz bilden unter einer Reihe von Lösungsmittel Bedingungen mit FNP12gebildet werden.

Hier bieten wir eine ausführliche Beschreibung für die Synthese der PEG -Bl- PPS Diblock Copolymers verwendet in Polymersome-Formation, der engen Impingement Düsen (CIJ) Mischer verwendet für FNP, die FNP Protokoll selbst, und die Implementierung eines automatisierten Systems reduzieren Sie Benutzer Variabilität. Enthält Informationen darüber, wie das System ausreichend um Endotoxin-freie Formulierungen für den Einsatz in Vivound repräsentative Daten über die Charakterisierung von Polymersomes gebildet von FNP produzieren zu sterilisieren. Mit diesen Informationen werden die Leser mit Interesse an der Verwendung von Polymersomes für in Vitro und in Vivo -Arbeit in der Lage, ihre eigenen steril, Monodisperse Formulierungen zu fabrizieren. Leser mit Erfahrung in Nanocarrier Formulierungen und mit Polymer-Synthese-Expertise werden in der Lage, schnell eigene Polymersysteme mit FNP als eine mögliche Alternative zu ihren aktuellen Formulierung Techniken zu testen. Darüber hinaus können die hier beschriebenen Protokolle als Lehrmittel für die Formulierung von darin in Nanotechnologie Laborübungen verwendet werden.

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Protokoll

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(1) Synthese von Poly(ethylene glycol) -Block-Poly (Propylen Sulfide)-Thiol

  1. Methoxy-Poly(ethylene glycol)-Mesylat zu synthetisieren (Mn: 750) (MeO-PEG17-Ms, ich).
    1. Lösen Sie 10 g von MeO-PEG17-OH in 200 mL 100 % Toluol in einem 3-Hals Rundboden-Kolben (RBF) unter magnetische rühren bei 600 u/min.
    2. 3-Hals-RBF an einem Dean-Stark-Apparat selbst befestigt mit einem Kondensator anschließen, halten Sie das gesamte System unter Schutzgas, Stickstoff oder Argon.
    3. Platz 3-Hals-RBF in einem Ölbad, Hitze auf 165 ° C unter Rühren bei 600 Umdrehungen pro Minute.
    4. Entfernen Sie Spur Wasser und 100 mL Toluol mit azeotrope Destillation.
    5. Entfernen Sie die 3-Hals-RBF aus Öl, lösen Sie die Dean-Stark-Apparat unter Beibehaltung Inertgas Bedingungen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    6. MeO-PEG17-OH-Lösung unter Rühren bei 600 u/min 5,6 mL 100 % Triethylamin (3 molare EQ) und 300 mL wasserfreiem 100 % Toluol hinzufügen.
    7. Verschieben Sie der 3-Hals-RBF in ein Eisbad, erhalten Sie rühren bei 600 u/min und Inertgas Bedingungen zu.
    8. Verdünnen Sie 3,1 mL 100 %-Methanesulfonyl-Chlorid (3 molare EQ) in 30 mL 100 % Toluol, 3-Hals-RBF über eine Zusatz-Trichter unter Rühren bei 600 u/min fügen Sie langsam hinzu.
    9. Rühren Sie über Nacht bei 600 u/min bei Raumtemperatur unter inerten Bedingungen.
    10. Filter-Lösung durch einen Büchner-Trichter mit Kieselgur verpackt (siehe Tabelle der Materialien), Salze zu entfernen.
    11. Entfernen Sie Toluol über einen drehverdampfer mit dem Wasserbad, eingestellt auf 40 ° C, Drehung um 120 u/min und soll zwischen 50-100 Millibar Druck.
    12. Neu Produkt in 200 mL 100 % Dichlormethan (DCM) auflösen, und Filtern Sie durch einen Büchner-Trichter, vollgepackt mit Kieselgur (siehe Tabelle der Materialien).
    13. Entfernen Sie DCM über einen drehverdampfer mit dem Wasserbad auf 40 ° C, Drehung um 120 u/min und soll zwischen 450-600 Millibar Druck gesetzt.
    14. Sparsam wieder auflösen Produkt 100 % DCM und langsam Produkt durch tropfenweise (über Pasteurpipette) hinzufügen auf 500 mL eiskaltes 100 % Diethylether ausgefällt. Rühren bei 300 u/min beizubehalten.
    15. Dekantieren oder abzusaugen um Diethylether aus ausgefällten Produkt, MeO-PEG17entfernen - Mesylat, und Speicher im Vakuum Exsikkator vollständig trocknen über Nacht.
    16. Produkt sofort verwenden oder speichern unter Schutzgas bei-20 ° C für mehrere Monate.
  2. Methoxy-Poly(ethylene glycol) Thioacetate (MeO-PEG17-TA, II) zu synthetisieren.
    1. Lösen Sie 5 g von MeO-PEG17-Ms (I) in 200 mL 100 % wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) in einem 3-Hals-RBF, rühren bei 600 u/min bei Raumtemperatur unter Schutzgas.
    2. Fügen Sie 2,5 g 100 % Kaliumcarbonat (3 molare EQ hinzu), rühren Lösung.
      Hinweis: Kaliumcarbonat wird in Lösung nicht vollständig auflösen.
    3. Verdünnen Sie 1,3 mL 100 % Thioacetic Säure (3 molare EQ) in 100 mL 100 % wasserfreiem DMF und Lösung über eine Zusatz-Trichter tropfenweise hinzufügen.
      Hinweis: Thioacetic Säure hat eine starke, unangenehme Geruch. Vorsicht ist geboten, um alle verschmutzte Objekte innerhalb der chemischen Dunstabzugshaube über Nacht vor der Entsorgung bzw. Reinigung zu halten.
    4. Rühren Sie kräftig (u/min 600 oder größer) über Nacht bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Salzbildung stören kann leicht das rühren von dieser Lösung. Vorsicht ist geboten, weiterhin unter ständigem Rühren über Nacht.
    5. Filter-Lösung durch einen Büchner-Trichter mit Kieselgur verpackt (siehe Tabelle der Materialien).
    6. Entfernen Sie DMF über einen drehverdampfer mit dem Wasserbad auf 60 ° C, Drehung um 120 u/min und soll zwischen 5-15 Millibar Druck gesetzt.
    7. Produkt in 100 mL 100 % Tetrahydrofuran (THF) auflösen und Hinzufügen einer Spalte verpackt mit neutralem Aluminiumoxid, rot/Orange farbigen Verunreinigungen zu entfernen.
    8. Entfernen Sie THF über einen drehverdampfer mit dem Wasserbad auf 40 ° C, Drehung um 120 u/min und soll zwischen 200-300 Millibar Druck gesetzt.
    9. Sparsam wieder lösen Sie Produkt 100 % DCM auf. Wenn ein Salz Niederschlag bildet, Filter-Lösung durch 6 μm Pore Größe Filterpapier mit einem Trichter Buchner.
    10. Beschleunigen Sie langsam Produkt indem Sie 500 mL eiskaltes 100 % Diethylether, bei 300 u/min rühren tropfenweise über Pasteurpipette hinzufügen. Diethylether müssen möglicherweise mehrere Stunden weiter bis-20 ° C in eine explosionsgeschützte Tiefkühltruhe gekühlt werden, wenn Niederschlag nicht abstürzen ist aus der Lösung bei 4 ° C.
    11. Dekantieren oder abzusaugen um Diethylether aus ausgefällten Produkt, MeO-PEG17-Thioacetate zu entfernen. Bewahren Sie Produkt über Nacht auf, in einem Vakuum-Exsikkator, und anschließend unter Schutzgas bei-20 ° C.
  3. Synthetisieren Diblock Copolymers Poly(ethylene glycol) -Block -Poly(propylene sulfide)-Thiol (PEG17-Bl- PPS35-SH, III).
    1. Auflösen von MeO-PEG17-TA (II) in 10 mL 100 % wasserfreiem DMF in einem Schlenk-Kolben unter Argon, unter ständigem Rühren bei 400 u/min im Wasserbad Raumtemperatur.
    2. Fügen Sie 1.1 molare Eq von Natrium метоксида (0,5 M Lösung in Methanol), ermöglichen bei 400 u/min für 5 Minuten rühren hinzu.
    3. 35 molare Eq von 100 % Propylen Sulfide, schnell, Projektmappe hinzufügen. Bei 400 u/min für 10 Minuten rühren lassen.
    4. Fügen Sie 10 molaren Eq von 100 % Eisessig, 5 Minuten bei 400 u/min rühren lassen.
    5. Entfernen Sie DMF über einen drehverdampfer mit dem Wasserbad auf 60 ° C, Drehung um 120 u/min und soll zwischen 5-15 Millibar Druck gesetzt.
    6. Neu lösen Sie Produkt sparsam in 100 % DCM auf, überstürzen Sie sich in 80 mL 100 % Methanol, aufgeteilt zwischen zwei 50 mL konische Zentrifuge Röhren.
    7. Zentrifuge konischen Rohren bei 7500 X g für 5 Minuten bei 4 ° C. Aspirieren Sie auswärts überstand.
    8. Shop-Produkt, PEG17-Bl- PPS35-SH, Übernachtung in einem Vakuum Exsikkator gestellt und anschließend unter Schutzgas bei-20 ° C.

(2) montieren Sie PEG -Bl -PPS darin über Hand-Powered Flash Nanoprecipitation

  1. (Optional) Sterilisieren des geschlossenen Impingement Düsen (CIJ) Mischers.
    1. Innerhalb einer biologischen Sicherheitsschrank (BSC) Tauchen Sie Mixer mit allen Teilen, die über Nacht innerhalb von 0,1 M NaOH zerlegt.
    2. Neueinbau CIJ Mixer und Durchströmung Endotoxin-freies Wasser mit Luer-Lock Spritzen.
    3. Testen Sie den pH-Wert des Wassers, und Wasser durch bis pH-Register als neutral fließen weiterhin.
  2. Auflösen von PEG17-Bl- PPS35-SH Polymer und hydrophoben Fracht in THF (Impingement Lösung 1).
    1. Wiegen Sie 20 mg von PEG17-Bl- PPS35-SH in einem 1,5 mL-Tube.
    2. Hinzufügen von hydrophoben Farbstoffe (z. B.DiI, ICG), Medikamente (z.B.Rapamycin) oder andere Ladung.
      Hinweis: Cargo kann trocken oder im Wasser mischbar Lösungsmittel, vorzugsweise THF gelöst werden. Wenn Ladung in THF oder DMF unlöslich ist, kann ein anderes Wasser mischbar Lösungsmittel aber sparsam verwendet werden, da das Polymer löslich sein unwahrscheinlich ist. Die Menge der Ladung, die geladen werden kann ist abhängig von der Ladung Eigenschaften selbst (z. B. das Molekulargewicht, Hydrophobie, sterische Überlegungen), und auf einer Schachtel-durchschachtel Grundlage11,12untersucht werden sollten.
    3. Hinzufügen von 500 µL 100 % THF Polymer und Fracht, Strudel kräftig zu lösen.
  3. Hydrophile Fracht in wässrigen Puffer (Impingement Lösung 2) auflösen. Hierzu lösen Sie hydrophilen Fracht um im Polymer Vesikel in 500 µL einer wässrigen Puffer (z. B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, reines Wasser, etc.) geladen werden, je nach Bedarf.
  4. Puffer zu Reservoir hinzufügen.
    1. Eine entsprechend dimensionierte Reservoir (z. B. ein 20 mL Glasflasche Funkeln) 2,5 mL einer wässrigen Puffer Wahl (z. B. 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) hinzufügen. Platzieren Sie Reservoir unter CIJ Armatur, derart, dass der Abfluss aus dem Mischer direkt das Reservoir gelangt.
  5. Laden Sie Impingement Lösungen in Kunststoff separate 1 mL Einwegspritzen.
  6. Beeinträchtigen Sie Lösungen gegen einander, gleichzeitig bilden Nanostrukturen und laden Sie sie mit der Nutzlast.
    1. Luer-Lock-Adapter an der Spitze des Mischers CIJ stecken Sie Spritzen.
    2. Drücken Sie in einer einzigen, glatte und schnelle Bewegung beide Spritzen gleichzeitig und mit gleicher Kraft.
      Hinweis: Wenn Sie mehrere sequenzielle Impingements durchführen, zuerst sammeln Sie Abfluss in einen leeren Behälter.
    3. (Optional) Führen Sie mehrere Einklem-. Split im Entstehen begriffenen Nanostruktur Lösung zwischen zwei Spritzen, und wiederholen Sie die Schritte 2.6.1-2.6.2 bis zu 4 mal mehr.
    4. Sammeln Sie Abfluss im wässrigen Puffer gefüllten Reservoir in 2.4.1 vorbereitet zu und unter Rühren Sie sanft mischen sicherzustellen.
  7. Entfernen Sie entladen Fracht und organische Lösungsmittel.
    1. (Option 1) Dialyse Nanocarrier Formulierung in der gleichen wässrigen Puffer für Impingement verwendet und in das Reservoir mit Schlauch von einer entsprechenden MW cutoff für mindestens 24 Stunden mit mindestens 2 Puffer Veränderungen. Dies kann bei Raumtemperatur erfolgen.
      Hinweis: Darin werden durch Schläuche mit einem MW-Cutoff einbehalten < 100.000 kDa und kann möglicherweise durch höhere Cutoffs auch beibehalten werden. Diese Option behält Sterilität, wenn in einem BSC mit sterilem Puffer durchgeführt.
    2. (Option 2) Formulierung durch eine Größe Ausgrenzung oder Entsalzung/Puffer Austausch Spalte (z. B. Sepharose 6 b) mit 1 X PBS als wässrige Puffer zu filtern.
      Hinweis: Diese Option führt Sterilität wenn eine BSC mit einer Spalte durchgeführt, die gründlich sterilisiert worden.
    3. (Option 3) Entfernen Sie die flüchtiges organisches Lösemittel mit Vakuum Trocknung über Nacht.
    4. (Option 4) Formulierung mit einer tangentialen Fluss Filtersystem mit einem 50-100 kDa Filter bei 20-60 mL/min Durchfluss für 15 Minuten bis 1 Stunde, je nach Molekulargewicht der unvergossene Ladung entfernt gereinigt zu filtern (größere Ladung dauert länger).
  8. (Optional) Die Nanocarrier Formulierung zu konzentrieren.
    1. (Option 1) Mit einem Dreh-Konzentrator-System zu konzentrieren (z. B. Spin Spalte mit MW cutoff > 100.000), als vom Hersteller beschrieben.
      Hinweis: Darin möglicherweise müssen Sie zwischen den Spins Nukleinsäuretablette werden und erfordern eine Anzahl von Spins, bis die gewünschte Lautstärke zu konzentrieren. Spin-Konzentration kann Sterilität der Nanocarrier Formulierungen reduzieren.
    2. (Option 2) Lautstärke mit Vakuum Austrocknung.
      Hinweis: Volumenänderung ist schwer zu kontrollieren unter diesen Bedingungen, und muss darauf geachtet werden, Osmolarität vor und nach der Konzentration aufrechtzuerhalten.
  9. Speichern Sie darin bei 4 ° C für Wochen bis Monate. Vor dem Gebrauch nach Lagerung, kurz Wirbel Nanocarrier Formulierungen.

(3) charakterisieren Sie Nanocarrier Formulierungen

  1. Messen, laden Effizienz
    1. Wenn Ladung fluoreszierende oder bei einer bestimmten Wellenlänge außerhalb 260-450 nm stark absorbiert, Messen Sie Fluoreszenz/Absorption mit einem Fluorimeter/Spektralphotometer.
      Hinweis: PEG -Bl- PPS absorbiert stark von 260-310 nm und Polymersome Formulierungen absorbieren von 310-450 nm, die Quantifizierung der Fracht erschweren kann, die bei einer ähnlichen Wellenlänge absorbiert.
    2. Wenn Ladung im Bereich von 260-450 nm absorbiert und hydrophil ist, stören PEG -Bl- PPS Nanostrukturen durch Zugabe von 25 μL der Formulierung auf ein gleiches Volumen von 1 % H2O2 oder 1 % Triton x-100 und anschließend zu trennen und zu unterscheiden Ladung von Polymer-Absorption durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Spalte "Größe Ausgrenzung" kompatibel mit wässrigen puffert (z. B. eine Sepharose-6 b-Säule) 11.
    3. Wenn Ladung im Bereich von 260-450 nm absorbiert und löslich in THF oder DMF ist, lyophilize die Formulierung von 100 μL in Kunststoffhülse 1,5 mL bei-80 ° C über Nacht einfrieren. Dann legen Sie das Rohr in einen Glasbehälter Vakuum und auf ein Gefriertrockner. Lassen Sie rund um die Uhr für Lyophilisation auftreten und anschließend wieder in 50 μL des DMF oder THF vor der Trennung und Nachweis über HPLC auflösen.
  2. Maßnahme Nanocarrier Größe und Morphologie
    1. Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung (DLS)11 oder Nanopartikel tracking Analyse13 , um Nanocarrier Größe zu messen.
      Hinweis: Darin gebildet von PEG17-Bl- PPS35-SH werden voraussichtlich haben einen Durchmesser zwischen 100-200 nm, mit einer Polydispersität index < 0,3.
    2. Bestimmen Sie Nanocarrier Morphologie mit kryogenen Transmission Electron Microscopy (CryoTEM)14.
      Hinweis: Darin gebildet von PEG17-Bl- PPS35-SH sollen Polymer Vesikel (Polymersomes) mit einem deutlich erkennbaren Polymeren Membran und weitgehend Kugelform.
  3. (Optional) Test-Formulierungen für endotoxin
    1. (Option 1) Verwenden Sie eine zellbasierte Assays auf das Vorhandensein von Endotoxin, z. B. RAW Blue Zellen oder HEK blau TLR4 (siehe Tabelle der Materialien), wie vom Hersteller in entweder eine quantitative oder qualitative Assay für Lipopolysacchariden (LPS)13 beschrieben .
    2. (Option 2) Verwenden Sie eine Limulus Amebocyte Lysate (LAL)15 Assay Kit, wie vom Hersteller beschrieben.

4. Herstellung von High-Speed-Spritzenpumpe für FNP

  1. Custom-Instrument Komponenten zu fertigen.
    Hinweis: 3D Modelle für die Bearbeitung aller benutzerdefinierten Teile werden in ergänzenden Materialien bereitgestellt.
    1. Maschine vielschichtigen Instrument-Chassis von ¾" Acrylplatten und montieren (siehe Ergänzende Dateien 1 bis 5).
      Hinweis: Acryl hat schlechten chemische Beständigkeit. Wenn das Gerät mit rauen Lösungsmittel verwendet werden, die Basis von einem Metall Maschine als geeignet für die Anwendung.
    2. 3D print Teile mit bedruckt mit Polylactid (PLA) Kunststoff.
      1. Drucken Sie die Spritze Vertreibung (SE) 2 teilige Apparat: SE-Teil 1 - hinten FNP Block hält Wagen (Abbildung 5F, graue Teil; Ergänzende Datei 6) und SE-Teil 2 - Front Vertreibung Führer (Abbildung 5F, schwarze Teil; Ergänzende Datei 7). Siehe zusätzliche Datei 2 für Schaltpläne.
      2. Drucken Sie die Infrarot-Sensor Klammern (Abbildung 5I, schwarz-boxen; Ergänzende Dateien 8 und 9).
      3. (Optional) Drucken Sie die dual Spritze Kolben Klammer.
  2. Befestigen Sie Instrument Chassis Schichten zusammen mit Sechskantschrauben M5 und fügen Sie Gummifüße auf der Unterseite hinzu.
  3. Konfigurieren Sie einen Einplatinen-Computer mit dem Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) Operating System (basierend auf Linux Debian).
    Hinweis: Software für den Betrieb des Gerätes ist auf Anfrage erhältlich. Instruments Software-Quellcode auf Anfrage erhältlich. Laden Sie nach Erhalt der ZIP-Datei alle Abhängigkeiten, die in der README-Datei angegeben. Diese Software beinhaltet eine einfache grafische Benutzeroberfläche, die Kontrolle über die Bedienung des Geräts, einschließlich laufen Grundparameter (Motordrehzahl, Richtung, etc.) ermöglicht. Benutzer werden ermutigt, auf den vorhandenen Quellcode zu erweitern und maßgeschneidert für individuelle Programmmodule in ihre eigenen Experimente verwenden. Alle Software wurde mit Python 2.7.12. geschrieben und ist derzeit nicht kompatibel mit Python 3. RPi, PicoBorgRev, Kivy und Multiprocessing-Module genutzt werden. Die README-Datei enthält detaillierte Informationen über die Software-Verteilung-Lizenz.
  4. Installieren Sie ein 24 V gebürsteten DC Motor (Abb. 5A) und Präzision Folie (4,5"(114,3 mm) Hub; 1,27 mm Schraube führen) (Abbildung 5).
    Hinweis: Die 24 V DC-Motor verwendet, hier hat ein u/Minmax, ichmaxund Volllast Drehmoment von 4.252 u/min, 4.83 A, und ~0.2 N * m, beziehungsweise.
    1. (Optional) Ort Polsterung unterhalb des Motors, um Vibrationen während des Betriebs zu dämpfen.
      Hinweis: Es wird empfohlen, dass eine 2-3 mm dicken Gummiauflage geschnitten wird, um die Motorkutsche Dimensionen der Gerätebasis zu passen.
    2. Die Präzision-Folie, um die Gerätebasis zu montieren.
      1. Entfernen Sie vorübergehend die Gewindestange.
      2. Montieren Sie Folie mit zwei #8-32 flache Maschinenschrauben.
    3. Mount Gleichstrommotor zur Präzision Folie über Schraube Strahl Kupplung (1-1/4" Länge) mit 6/16" und 1/4" Durchmesser bohrt.
      Hinweis: Abhängig von der Dicke des Acryl verwendet, um das Instrument Tragschichten Maschine können Unterlegscheiben erforderlich sein, die motor und Präzision Folie Wellen zu ebnen.
  5. Vertreibung-Plattform aus Metallplatten und L-förmigen Ecke Hosenträger (Abbildung 5) montieren. Montieren von unedlen Metallen Plattform zu gleitenden Plattform (verbunden mit Gewindestange) #6-32 Schrauben. Sehen Sie Präzision Folie Schaltplan vom Hersteller vorgesehenen Details bezüglich der Montage-Einschränkungen.
  6. Montieren Sie die Spritze Vertreibung System-Setup.
    1. Befestigen Sie die Linearbewegung Stehlagern (Montage-Plattformen + Linearbewegung Lager) auf M8 verchromtem Edelstahl-Schiene (die parallelen Stahlschienen können ohne weiteres in Abbildung 5eingehalten werden).
    2. Thread Schienen durch lineare Welle/Führungshalter und Schienen zu sperren. Verwenden Sie drei Guides pro Schiene. Mount SE Teile 1 und 2 auf Kissen Blöcke mit Maschinenschrauben M4.
    3. Verbinden Sie SE Teile 1 und 2 mit M8 Sechskantschrauben locker. Konfigurieren Sie den Abstand zwischen SE-Teil 1 und 2 mit spiralförmige Druckfedern für jede Schraube, die gesichert werden zwischen zwei nach innen gerichtete Nylon-Buchsen (siehe Abbildung 5F). Montieren Sie diese Buchsen auf der Außenseite des SE-Teil 1 und SE-Teil 2.
  7. Draht-Schaltung (siehe Abbildung 6 für die Kern-Schaltplan)
    1. Verbinden den motor Controller an die I2C/SDA, 3,3 V und GND pins auf dem single-Board-Computer.
    2. Verbinden Sie DC motor Anschlüsse mit der m- und M + Blöcke von den motor-Controller-Board. Schließen Sie die 24 V, 2,5 A Power Supply (Abb. 5 b) an die V + und GND Blöcke von der Motorsteuerung (der Controller ist eingehüllt in eine einfache Elektronik-Box in das endgültige Design, siehe Abbildung 5 H).
    3. 3V3 und 5V Pins des motor-Control-Board an die jeweiligen Pins auf dem single-Board-Computer anschließen. SDA und SCL Pins von der Motorsteuerung bzw. an Pin 3 und 5 von der single-Board Computer anschließen.
      Hinweis: Befehle werden an den DC-Motor aus den single-Board Computer mittels einer Motorsteuerung ausgegeben. Motordrehzahl wird durch die Regelung der Spannung über den Motorklemmen über Pulsweitenmodulation gesteuert. In diesem Setup, der maximale Strom, der durch die 24 V DC-Motor (Volllast-Stromstärke: 4.83 A) beschränkt sich auf 2,5 A durch die 24 V-Versorgung. Es wird empfohlen, dass motorkreis durch eine normal geschlossen (NC) not-aus (Abbildung 5J) verdrahtet ist. Dabei bietet die Möglichkeit, motorkreis für eine grundlegende Notabschaltung Betrieb stören.
    4. Verbinden Sie vorne und hinten Infrarot-Näherungsschalter (digitale Abstandssensoren, Abbildung 5I) mit RPi GPIO-Pins 24 und 23, beziehungsweise.
      1. Strecke Sensor Kabel durch Leerrohre in die Gerätebasis.
        Hinweis: Die IR-Sensoren sind berührungslose Pause-Strahl-Bewegungsmelder mit einem Erfassungsbereich von 2 bis 10 cm.
      2. 4.7.4.2 rasten Sie die drahtgebundenen IR-Sensoren 3D-gedruckten Infrarotsensor Hosenträger (Abbildung 5I, schwarze Kästchen ein) und auf die Gerätebasis montieren. Wenn korrekt in die Klammer gesetzt, sollte das Sensor-Gesicht nach außen aus der 14 x 7 mm rechteckige Öffnung der Stütze ragen.
        Hinweis: Diese Sensor-Klammern vorübergehend montiert werden mittels Velcro oder Klebstoff (temporäre Montage eignet sich entsprechend anpassen und optimieren IR Sensor Platzierung). Alternativ, dauerhaft durch kleine Bohrungen in die Gerätebasis und Sicherung der Klammern mit M2-Schrauben montieren.
    5. Verbinden Sie eine 7" Touchscreen LCD-Display mit 5V, GND, und anzuzeigen Sie serielle Schnittstelle (DSI) Stifte von der single-Board-Computer. Die 7" RPi und LCD-display Baugruppe ist in Abbildung 5dargestellt.

(5) fabrizieren Sie Polymersomes über FNP mit maßgeschneiderten High-Speed-Spritzenpumpe

  1. (Option 1) Verwenden Sie Auto-run-Modus.
    1. Wählen Sie Auto Run aus dem Hauptmenü. Das System fordert Benutzer der Motor automatisch die Spritze Vertreibung Plattform an den Anfang der Präzision Folie positionieren. Sicherstellen Sie, dass der Pfad vor und hinter der Metallplatte klar, bevor Sie fortfahren ist.
    2. 1 mL Kunststoffspritzen wie beschrieben in Abschnitt 2.5 und Mount Spritzen auf Luer-Anschluss-Buchsen des Mischers CIJ zu laden. CIJ Mixer (mit Spritzen angebracht) in die rechteckige Öffnung des hinteren Vertreibung Schlittens laden (siehe Abb. 5E).
    3. Legen Sie die gewünschte Motordrehzahl (Einheiten: u/min) mithilfe des Schiebereglers in der GUI (siehe Hinweis unten für wichtige Überlegungen). Die optimale Motordrehzahl hängt die Pumpe und das Setup aber muss einen Durchfluss von mindestens 1 mL/s für die CIJ Mixer Kanal Abmessungen hier zur Verfügung gestellten sicherstellen.
      Hinweis: Beachten Sie Folgendes bei der Einstellung der Durchflussmenge. In der vertikalen Handbetriebene FNP-Konfiguration Reaktanden ausgeschlossen werden die Spritzen mit einer Rate von ~ 1 mL/s, aber kann sehr variabel wenn Hand angetrieben. Dies ist einfach die Durchflussmenge durch den Spritzenkörper, die durch die Geschwindigkeit kontrolliert wird an dem der Benutzer den Spritzenkolben Fortschritte. Beachten Sie, dass die Rate von 1 mL/s nicht unter Bezugnahme auf die Ausfahrt Fördermenge aus dem kleineren Durchmesser Düse. Bei den oben angegebenen Kanal Abmessungen, ~ 1 mL/s sollte beibehalten werden, um eine geeignete Reynold Zahl für turbulente mischen10zu gewährleisten. Unterschiedliche Durchflussmengen können verwendet werden, solange der Kanal Durchmesser entsprechend angepasst wird, um eine Reynold-Zahl zu erhalten, die turbulente Bedingungen unterstützt. Die Spritzenkolben fortgeschritten sind durch eine senkrecht Metallplatte, die bewegt sich entlang einer Präzisions-Aluminium-Folie 24 V Gleichstrommotor gebürstet gekoppelt. In dieser Konfiguration wird die maximale Fass-Durchflussmenge beeinflusst durch eine Reihe von Faktoren, einschließlich (1) die maximale Motordrehzahl (4.252 u/min) und die Schraube Führung der Präzision Folie (1,27 mm), die gekoppelt ist mit dem Motor Welle (2) das Drehmoment des Motors (~0.2 N * m voll-l OAD Drehmoment), das ist notwendig, um Widerstand zu fließen (3) Gegendruck Beiträge von Fluid Einstieg in und Ausstieg aus der CIJ-Mischer und (4) die Stärke der verwendeten Spritzen überwinden (Benutzer sollten darauf achten, die einwirkenden Kräfte auf die Spritzen, und verwenden Spritzen von entsprechende Stärke). Zu Punkt (2), bei einer Erhöhung der Strömung ist Rate genügend Drehmoment erforderlich, um zu vermeiden, abwürgen des Motors unter Beibehaltung der stetigen Vertreibung unter zunehmendem Gegendruck. Faß Flussraten – um den Lauf-Fluss zu veranschaulichen bewerten, dass die oben genannten System erreichen können, betrachten wir den Fall wo FNP mit Reaktanden in zwei 1-ml-Spritzen geladen ausgeführt wird. Um eine 1 mL/s Durchfluss zu erreichen muss Rate durch den Lauf des Motors die Metallplatte die Entfernung definiert durch die Kolben-Länge (~ 68 mm für eine typische 1 mL Spritze) in einer Sekunde voraus. Sofern die 1,27 mm Schraube Führung der Präzision Folie, daraus folgt, dass ein DC-Motor mit 4.252 u/min in der Lage, die Weiterentwicklung der Plattform bis zu ~ 90 mm/s (71 u/s * 1,27 mm/u). Dies entspricht einer Fass-Durchflussmenge von ~1.3 mL/s, 1 mL/s-zielrate übersteigt.
    4. Überprüfen Sie vor dem Ausführen des Instruments, das System dafür, dass den Pfad der die Plattform ist frei von Hindernissen, und dass die vorderen und hinteren IR Nähe Detektoren sind frei von Hindernissen (IR-Sensoren sind die kleinen Black Boxes in der Nähe der Präzision-Folie Klemmen; siehe Abbildung 5I). Auch dafür sorgen, dass Kapillare Schläuche Austritt aus der CIJ Mischer in einen geeigneten Auffangbehälter geleitet wird (z. B.: Glas, Becher, etc.).
    5. Drücken Sie um Reaktionspartner von Spritzen und in den Mischer CIJ zu vertreiben, den Run -Button in der Softwareschnittstelle.
  2. (Option 2) Verwendung manueller Modus. Beziehen sich auf die Auto-Run-Modus Anweisungen oben und beachten Sie die folgende Änderung 5.1.5 Schritt: Drücken Sie die Vorwärts-Taste gedrückt kontinuierlich durch den Abschluss des Laufs (d. h. die Plattform in Reaktion auf eine Presseveranstaltung und der Motor Fortschritte in Reaktion auf ein Ereignis bei loslassen stoppt).
  3. (Option 3) Verwenden Sie manuelle Positionierung Modus Plattform; in diesem Modus können Benutzer die Plattform positionieren durch Betrieb des Motors bei niedriger Drehzahl (20 % Leistung) als Reaktion auf die vorwärts und rückwärts Tasten auf die Software-Schnittstelle.

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Ergebnisse

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Hier haben wir ein einfaches Protokoll für die Formulierung von darin in der Lage, hydrophile und hydrophobe Fracht zu laden, die sicher für in Vivo Maus und nicht-menschlichen Primaten Verwaltung11,13präsentiert. Wir haben ebenfalls ein detailliertes Protokoll für die Synthese des Polymers in unsere repräsentative Ergebnisse, zusammen mit einer Beschreibung für die Herstellung von custom-Instrument für die mechanisch ges...

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Diskussion

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Detaillierte Anweisungen für die schnelle Herstellung von Polymersomes mit PEG17-Bl- PPS35-SH als Diblock Copolymers. Vesikuläre Polymersomes sind die primären aggregierte Morphologie bei diesem Verhältnis von PEG hydrophile und hydrophobe PPS Block Molekulargewicht montiert. Wenn mehrere Male ausgewirkt, sie haben einen Durchmesser und Polydispersität, die Polymersomes, nachdem er durch eine 200 nm Membran extrudiert entspricht gebildet über Dünnschicht-Hydratation. Dieses Protoko...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Wir anerkennen, dass Mitarbeiter und Instrumentierung von der strukturellen Biologie-Anlage an der Northwestern University zu unterstützen. Die Unterstützung von R.H. Lurie umfassende Cancer Center der Northwestern University und der Northwestern University strukturelle Biologie Einrichtungen wird anerkannt. Gatan K2 direkte Elektron Detektors wurde mit Mitteln der Chicago biomedizinische Konsortium mit Unterstützung der Searle-Fonds auf der Chicago Community Trust erworben. Wir danken auch folgenden Einrichtungen an der Northwestern University: Keck interdisziplinäre Oberfläche wissenschaftlichen Einrichtung, die strukturelle Biologie-Anlage der biologischen Imaging Facility, das Center for Advanced Molekulare Bildgebung und die analytische Bionanotechnologie Ausrüstung Kern. Diese Forschung wurde von der National Science Foundation Grant 1453576, der nationale Institute der Gesundheit Direktor neue Innovator Award 1DP2HL132390-01, das Zentrum für Regenerative Nanomedizin Catalyst Award und 2014 McCormick Catalyst Award unterstützt. SDA wurde teilweise von NIH predoctoral Biotechnologie Ausbildung Grant T32GM008449 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB EditionCanaKitUPC 682710991511
Linearlagerplattform (klein) - 8 mm DurchmesserAdafruit1179
Linear Motion 8 mm Welle, 330 mm Länge, verchromt, einsatzgehärtet, metrischVXBkit11868
Linearschienen-Wellenführung/-halterung - 8 mm DurchmesserAdafruit1182
Präzisionsschlitten mit manueller Position 4,5" Hub, 15 lb TragfähigkeitMcMaster-Carr5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse GleichstrommotorIron HorseMTPM-P10-1JK43
Offizielle Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD-DisplayRaspberry PiB0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Erweiterte Motorsteuerung für Raspberry PiPiBorgBURN-0011
Pololu Träger mit scharfem GP2Y0D810Z0F Digitaler Abstandssensor 10cmPololu1134
Ruland PSR16-5-4-A Stellschraube Strahlkupplung, poliertes Aluminium, Zoll, 5/16" Bohrung A Durchmesser, 1/4" Bohrung B Durchmesser, 1" OD, 1-1/4" Länge, 44 lb-in NenndrehmomentRulandPSR16-5-4-A
PolyethylenglykolmonomethyletherSigma Aldrich202495
MethansulfonylchloridSigma Aldrich471259
ToluolSigma Aldrich179418
Toluol, wasserfreiesSigma Aldrich244511
TriethylaminSigma AldrichT0886
Celite 545 (Kieselgur)Sigma Aldrich419931
DichlormethanSigma Aldrich
DiethyletherSigma Aldrich296082
N,N-Dimethylformamid, wasserfreiesSigma Aldrich227056
KaliumcarbonatSigma Aldrich791776
ThioessigsäureSigma AldrichT30805
TetrahydrofuranSigma Aldrich360589
Aluminium Oxid, neutral, aktiviert, Brockmann ISigma Aldrich199974
Natriummethoxidlösung, 0,5 M in MethanolSigma Aldrich403067
PropylensulfidSigma AldrichP53209
EssigsäureSigma AldrichA6283
MethanolSigma Aldrich320390
Natronlauge 1,0 NSigma AldrichS2770
Endotoxinfreies WasserGE Healthcare Life SciencesSH30529.01
Papier-pH-StreifenFisher Scientific13-640-508
Endotoxinfrei Dulbecco's PBSSigma AldrichTMS-012
Szintillationsfläschchen aus BorosilikatglasFisher Scientific03-337-4
1 mL VollkunststoffspritzeThermo ScientificS75101
Sepharose CL-6BSigma AldrichCL6B200
Säule für FlüssigkeitschromatographieSigma AldrichC4169
CIJ-Mischer, HDPECustom
Triton X-100Sigma AldrichX100
WasserstoffperoxidlösungSigma Aldrich216763
HEK-Blue hTLR4InvivoGenhkb-htlr4
RAW-Blue ZellenInvivoGenraw-sp
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1
PYROGENT Gelgerinnsel LAL AssaysLonzaN183-125
320269

Referenzen

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