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Methodenartikel

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

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DOI:

10.3791/57796

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3. Juli 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt bestimmte Methoden um biochemische Menge Waschmittel solubilisiert TRPV1 für spektroskopische Analyse zu erhalten. Die kombinierte Protokolle bieten Biochemische und biophysikalische Werkzeuge, die angepasst werden können, um die strukturelle und funktionelle Studien für Säugetier-Ionenkanäle in einer Membran-kontrollierten Umgebung zu erleichtern.

Zusammenfassung

Polymodal Ionenkanäle transduzieren mehrere Reize unterschiedlicher Art in allosterische Änderungen; Diese dynamische Konformationen sind schwierig zu bestimmen und nach wie vor weitgehend unbekannt. Mit den jüngsten Fortschritten in einzelne Partikel Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM) Licht auf die strukturellen Merkmale der Agonist Bindungsstellen und Aktivierungsmechanismus mehrere Ionenkanäle ist das Bühnenbild für dynamische Tiefenanalyse der ihre Anspritzung Mechanismen mit spektroskopischen Methoden. Spektroskopische Techniken wie Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz (EPR) und doppelte Elektron-Elektron-Resonanz (Hirsch) wurden vor allem auf das Studium der prokaryotischen Ionenkanäle beschränkt, die in großen Mengen gereinigt werden können. Die Voraussetzung für große Mengen von funktionalen und stabilen Membranproteinen hat das Studium der Säugetier-Ionenkanäle, die durch diese Ansätze behindert. EPR und Hirsch bieten viele Vorteile, einschließlich der Bestimmung der Struktur und dynamischen Veränderungen der mobilen Protein Regionen, wenn auch mit geringer Auflösung, der durch Röntgen-Kristallographie oder Cryo-EM zu schwierig sein könnte, und Überwachung, reversible Anspritzung Übergang (d.h., geschlossen, offen, sensibilisiert und desensibilisiert). Hier bieten wir Protokolle für den Erhalt der Milligramm funktionale Waschmittel solubilisiert Transienten Rezeptor potenzielle kation Unterfamilie V Kanalmitglied 1 (TRPV1), die EPR und Hirsche Spektroskopie bezeichnet werden kann.

Einleitung

Mit den jüngsten Fortschritten in der Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) wurden Säugetier-Ion Kanalstrukturen zu einem außergewöhnlichen Preis gewonnen. Insbesondere haben strukturelle Studien Polymodal Ionenkanäle, wie z. B. die Transienten Rezeptor potential Vanilloid 1 (TRPV1), weitere Verständnis für seine Aktivierung Mechanismen1,2,3, zur Verfügung gestellt 4 , 5. dynamischer Informationen über Ionenkanäle in einer Membran-Umgebung eingebettet ist jedoch erforderlich, ihre Polymodal gating und Medikament-Bindung Mechanismen zu verstehen.

Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz (EPR) und doppelte Elektron-Elektron Resonanz (Hirsch) Spectroscopies haben einige der am meisten definitive mechanistische Modelle für Ionen-Kanäle6,7,8,9 , zur Verfügung gestellt , 10 , 11 , 12 , 13. diese Ansätze wurden hauptsächlich beschränkt sich auf die Prüfung der prokaryotischen und Archeal Ion Kanäle, liefern eine große Menge an Waschmittel-gereinigte Proteine als bei Bakterien überexprimiert. Mit der Entwicklung der Eukaryoten Membran Proteine Produktion in Insekt und Säugerzellen für funktionelle und strukturelle Charakterisierung14,15,16ist es jetzt möglich, biochemische zu erhalten Mengen von Waschmittel-gereinigte Proteine für spektroskopische Untersuchungen.

Die EPR und Hirsche Signale ergeben sich aus ein Paramagneticspin Etikett (SL) (d.h. Methanethiosulfonate), ein Single-Cystein Rückstand in das Protein. Die Spin-Etiketten Berichten drei Arten von Strukturinformationen: Bewegung, Erreichbarkeiten und Entfernungen. Diese Informationen ermöglichen es, festzustellen, ob Rückstände innerhalb des Proteins liegen oder der Membran oder wässrigen Umgebung in die Apo und Liganden-gebundenen Staaten13,17,18,19ausgesetzt sind. Im Rahmen einer hochauflösenden Struktur (wenn vorhanden) bieten die EPR und Hirsch-Daten eine Auflistung von Einschränkungen für die Ableitung von dynamischer Models in ihrer natürlichen Umgebung während der Überwachung reversible gating Übergang (d.h., geschlossen, offen, sensibilisiert und desensibilisiert). Darüber hinaus konnte flexibele Regionen, die möglicherweise schwierig zu bestimmen, durch Röntgen-Kristallographie oder Cryo-EM abgerufen werden, mithilfe dieser ökologischen Datensätze zum Sekundärstrukturen sowie Lage innerhalb der Protein-20zuweisen. Cryo-EM Strukturen erhalten in Lipid-Nanodiscs zur Verfügung gestellt, wertvolle Informationen über die Anspritzung von Ionen-Kanäle3,21,22,23,24, 25; Spektroskopische Methoden könnte jedoch dynamischen Informationen von Konformationsänderungen Staaten (z.B. thermische Veränderungen) bieten, die möglicherweise schwer zu bestimmen, mit Cryo-EM.

Viele Schwierigkeiten müssen überwunden werden, um die EPR und Hirsch, einschließlich Mangel an Proteinfunktion, wenn Sie alle Cystein Rückstände (besonders reichlich in Säugetieren Kanälen), eiweißarme Ausbeute, Protein Instabilität während der Reinigung und nach Spin labeling entfernen umzusetzen , und Proteinaggregation in Spülmittel oder Liposomen. Hier haben wir Protokolle dieser kritischen Barrieren zu überwinden und haben informierten sich Rehe und EPR Spektren für ein Säugetier sensorischer Rezeptor ausgelegt. Hierbei ist es, Methoden zu beschreiben, denn der Ausdruck, Reinigung, Kennzeichnung und Wiederherstellung einer funktionellen minimal Cystein-weniger Ratte TRPV1 (eTRPV1) für spektroskopische Analysen zu konstruieren. Diese Methode eignet sich für diese Membranproteine, die halten ihre Funktion trotz der Entfernung von Cystein Rückstände oder Cystein bildet Disulfid-Bindungen enthalten. Diese Sammlung von Protokollen könnte für die spektroskopische Analyse von anderen Säugetieren Ionenkanälen angepasst werden.

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Protokoll

1. TRPV1 Mutagenese

Hinweis: Eine minimale TRPV1-Konstrukt für spektroskopische Analyse26 entstand aus dem Full-Length Cystein-weniger Kanal TRPV127 mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methode (Abbildung 1). Dieses Cystein-weniger minimalste TRPV1 Konstrukt (bezeichnet als eTRPV1 im folgenden) besteht aus Rückständen 110-603 und 627-764. eTRPV1 wurde geklont in pMO (ein pcDNA3.1-basierte Vektor) für Funktionsanalyse und in einem rekombinanten Spender Vektor28 mit 8 x-Histidin-Maltose-bindendes Protein (MBP)-Tabak Ätzen Virus (TEV) zum Ausdruck und Reinigung (Abbildung 2A). eTRPV1 Single–-Cystein, die durch Mutation entstehende Variationen mit Site-verwiesene Mutagenese erzeugt wurden. Vektor und Kanal-Sequenzen in angegeben sind die ergänzende Datei 1: Ergänzungsmethoden.

  1. Mutagenese-Primer mit online-Tools29zu entwerfen.
  2. Mischen Sie in einer 0,2-mL-Tube: 5 μl 10 x Reaktion Puffer, 1 μl dNTP-Mix (100 mM), 1 μl 10 μM vorwärts und rückwärts Oligonukleotide, 1 μL von 100 ng/μl eTRPV1 Schablone DNA26, 1,5 μL von DMSO, 1 μL der Mutagenese Enzym , und 38,5 μL deionisiertes Wasser. Drehen Sie die Mischung vor dem Einlegen der Rohre in den Thermocycler.
  3. Führen Sie PCR Mutagenese.
    1. Führen Sie (a) Denaturierung bei 95 ° C für 2 min, (b) Denaturierung bei 95 ° C für 20 s, (c) Glühen bei 60 ° C für 10 s und (d) Dehnung bei 68 ° C für 4 min (30 s pro 1 kb). Wiederholen Sie die Schritte b bis d für 18 Zyklen, dann Dehnung bei 68 ° C für 5 min durchführen, und die Reaktion bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung zu erhalten.
  4. Fügen Sie 2 μL der Dpnich Enzym Reaktion; mischen und dann bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
  5. Führen Sie die transformation
    1. E. Coli kompetente Zellen auf Eis Auftauen.
    2. Eine vorgekühlte 14mL steriles Röhrchen fügen Sie 75 μl kompetente Zellen und 10 μL der Dpn-behandelten PCR Mischung hinzu. Mischen Sie vorsichtig.
    3. Inkubieren Reaktion auf Eis für 30 min. pflegen das Rohr bei 42 ° C für 45 s und dann sofort auf Eis für 2 min. Platte die Mischung auf Luria Brühe (LB)-Agarplatte mit Carbenicillin (0,2 mg/mL). Die Platte über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    4. Mindestens drei einzelne Kolonien von der Platte zu ernten und jeweils in 4 mL LB mit Carbenicillin (0,2 mg/mL) mit einem 14-mL steriles Röhrchen zu impfen. Kulturen über Nacht bei 37 ° C inkubieren und bei 250 u/min schütteln.
    5. Spin-down über Nacht Kulturen bei 8.000 x g für 10 min und nach den Anweisungen der im Handel erhältlichen Mini-Vorbereitung Kits DNA extrahieren.
    6. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Single-Cystein Mutanten durch standard automatisierter DNA-Sequenzierung (siehe Tabelle der Materialien).

(2) funktionelle Analyse von eTRPV1 und Single-Cystein Mutanten

  1. HEK293 Zellen Linie Transfektion 30
    1. Kultur HEK293 Zellen in 6 - well-Platten in 2 mL hohe Glukose Medium (DMEM) pro Bohrloch (37 ° C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit). Bereiten Sie HEK293 Zellen vor, die 70 \u2012 80 % Zusammenfluss.
    2. Bereiten Sie die Transfektion Mischung in zwei separate 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.
      1. Fügen Sie für Reaktion A 0,5 µg eTRPV1 oder Cystein Mutant-haltigen pMO zu 250 µL minimal wesentliche Medium (z. B. Opti-MEM hinzu). Fügen Sie für Reaktion B 3 µL Transfection Reagens zu 250 µL minimal wesentliche Medium hinzu. Jede Reaktion für 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
      2. Mischen Sie Reaktionen A und B mit einer 1-mL-Pipette. Die Mischung für 45 min bei RT inkubieren
    3. Entfernen Sie 500 µL Nährmedien aus dem Zusammenfluss von 70-80 % gut und fügen Sie 500 µL des Reaktionsgemisches hinzu. Platten über Nacht für Ca2 + imaging (37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit) zu speichern.
  2. Ca2 + imaging in HEK293 Zellen 30
    1. Reinigen Sie 12 mm Durchmesser Glasdeckgläser mit Ethanol und Wasser zu, und legen Sie sie in einer 24-Well-Platte.
    2. 75 µL Poly-l-Lysin in der Mitte der einzelnen Deckglas hinzuzufügen und die Platte für 45 min (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2) zu speichern.
    3. Entfernen Sie die überschüssige Poly-l-Lysin und waschen Deckgläsern dreimal mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gebliebene entfernen.
    4. Sobald die Deckgläsern fertig sind, fahren Sie mit Zellen aus dem 6-Well-Platte zu lösen.
    5. Entfernen Sie den Datenträger und fügen Sie 500 µL PBS warm (37 ° C) waschen.
    6. Entfernen Sie PBS zu, fügen Sie 500 µL von Trypsin und 1 min inkubieren.
    7. Hinzufügen von 500 µL warm Nährmedien (37 ° C) die Verdauung Reaktion zu stoppen und mit der Pipette mischen; vermeiden Sie Luftblasen. Passen Sie ggf. Die Zellkonzentration Verdünnung dieser Wiederfreisetzung mit mehr Kultur Medien.
    8. Seed 250 µL von transfizierten HEK293 Zellen (70 % Zusammenfluss) plus 250 µL Nährmedien (500 µL Endvolumen pro Well) auf die vorbehandelten Deckgläsern und lassen (zur Befestigung) niederzulassen für 1-2 h im Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit).
    9. In der Zwischenzeit bereiten Sie eine Laden-Lösung durch Zugabe von 0,02 % Pluronic Säure und 1 µM Fluo-4-AM ein Ringer Puffer. Mischen Sie die Lösung gut.
    10. Entfernen Sie die HEK293-Kultur-Medien aus dem Brunnen und fügen Sie 500 µL der Laden-Lösung hinzu. Inkubieren Sie Zellen für 1 h (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2). Waschen Sie die Fluo-4-geladenen Zellen zweimal mit warmen Ringer Puffer.
    11. Legen Sie ein Deckglas mit geladenen Zellen in einer Petrischale 10 mm in einen Mikroskoptisch (mit einem 10-fach Ziel; 494 nm Anregung und 506 nm Emission) um intrazelluläre Ca2 + Messungen durchzuführen.
    12. Messen von Veränderungen im Fluoreszenzintensität nach jeweiligen Liganden (z.B. 10 μM Capsaicin) Vorrichtung mit handelsüblicher Software (siehe Tabelle der Materialien).
  3. mRNA und Xenopus Laevis Eizellen Vorbereitung 30
    1. Linearisieren eTRPV1 und Single-Cystein Mutanten-haltigen pMO mit Pmeich für 1 h bei 37 ° C. Reinigen Sie nach den Anweisungen der im Handel erhältlichen Reinigung Kits DNA.
    2. Linearisiert und DNA zu synthetisieren, angeschnittene Ärmel RNAs mit einem kommerziell erhältlichen Kit kompatibel mit T7-RNA-Polymerase gereinigt.
    3. Angeschnittene Ärmel RNAs nach handelsüblichen Reinigung Kits zu reinigen. Die RNA-Menge durch Messung der Absorption bei 260 nm Wellenlänge zu quantifizieren.
    4. Transfer 5 \u2012 10 mL laevis Eizellen (im Handel erhältlich) in ein 50 mL konische Röhrchen mit 20 mL ND96-Lösung (96 mM NaCl, KCl, 5 mM HEPES, 2 mM 1 mM MgCl2; pH 7.4) mit 1 mg/mL Kollagenase und Nutate für 50 min bei RT
    5. Spülen Sie die Eizellen in ND96, bis die Lösung klar ist; Fügen Sie frische Kollagenase und schütteln für 30 min bei RT untersuchen die Eizellen unter dem Stereo-Mikroskop und die Verdauung zu stoppen, wenn die follikuläre Außenschicht (glänzende Schicht mit roten Blutgefäße) fehlt in den meisten Eizellen (90 %). Spülen Sie Eizellen in ND96, bis die Lösung klar ist.
    6. Das Polystyrol Röhrchen bleiben Transfer Eizellen zu einem Polystyrol 50-mL-Schlauch mit ND96 plus 1 mM CaCl2 und schütteln für 1 h unter verdaut Eizellen.
    7. Waschen Sie Eizellen mit ND96 plus 1 mM CaCl2 und Ergänzung Lösung mit 50 µg/mL von Gentamicin und 50 µg/mL Tetracyclin.
      Hinweis: Schützen Sie Tetracyclin-haltigen Lösungen vor Lichteinwirkung.
    8. Wählen Sie große Eizellen ohne beschädigte Membranen und eine klare Trennung zwischen dem Tier und pflanzliche Polen anzeigen. Lassen Sie Eizellen erholen für 4 h vor der Mikroinjektion bei 16 ° C.
    9. Glaspipetten verwenden (O.D: 1,11 mm I.D.: 0,5 und Länge 8,8 cm), 1-5 ng der mRNA von eTRPV1 und Single-Cystein Mutanten in Eizellen mit einem Nanoliter-Injektor-System (46 nL/s) und ein Stereo-Mikroskop (2 X Vergrößerung) zu injizieren. Speichern von Eizellen bei 16 ° C im ND96 ergänzt mit CaCl2 und Antibiotika (Gentamycin/Tetracyclin 1 X).
    10. Messen Sie nach 72 h makroskopischen Strom mit einem zwei-Elektroden-Voltage-Clamp (TEVC) Erwerb System31.
    11. Ziehen Sie Borosilikatglas Pipetten (0,3 MΩ) und füllen sie mit 3 M KCl.
    12. Legen Sie die Eizelle in der Aufnahme-Kammer mit einer transferpipette und Durchspülen der Bad-Lösung (120 mM NaCl, KCl, MgCl2, 1 mM EGTA und 10 mM HEPES Lösung 2 mM 2 mM; pH 7,4) bei niedriger Drehzahl.
    13. Tauchen Sie beide Elektroden in der Bad-Lösung ihre Pipette Offsets anpassen. Schieben Sie die Pipette Elektroden (Borosilikatglas Pipetten; O.D: 1,5 mm, I.D.: 1.10 und Länge 10 cm) in der Eizelle bis eine kleine Einbuchtung unter dem Stereo-Mikroskop (2 X Vergrößerung), sowie eine Änderung des Membranpotentials beobachtet wird.
    14. Die Verstärker Einstellungen ändern, um die Aufnahme-Modus und Maßnahme makroskopischer Strömungen während der Anwendung einer Spannung-Clamp-Rampe von-80 bis + 80 mV für 1 S. laden die Perfusion System mit der Lösung verwendet Schritt 2.3.12 bei pH 7.4 (als Kontrolle) und bei pH 5, eTRPV1 Aktivität zu überprüfen.

3. Erzeugung von rekombinanten Bacmid und Baculovirus für Protein-Expression

  1. Bacmid
    1. Transformieren von 100 μl kompetente Zellen DH10Bac E. Coli mit 7,5 ng des rekombinanten Spender Vektors mit eTRPV1 und/oder Einzel-Cystein Mutanten.
    2. Fügen Sie 900 μl SOC-Medien (20 mg/mL Tryptone, 5 mg/mL Hefe-Extrakt, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4und 20 mM Glukose) und ca. 6-7 h bei 37 ° C und 225 u/min inkubieren.
    3. Samen 100 µL direkt aus der Mischung und von Verdünnungsreihen (1/10 und 1/100), in LB-Agar-Platten mit 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 50 μg/mL Kanamycin, Gentamicin μg/mL und 10 μg/mL Tetracyclin. Inkubieren Sie die Platten mindestens 48 h bei 37 ° c
    4. Wählen Sie weiße Kolonien, die 2 mm im Durchmesser, da Blaue Kolonien nicht über den Einsatz von Interesse. Verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop, um sicherzustellen, dass weiße Kolonien blauen Flecken nicht enthalten.
    5. Mindestens drei einzelne Kolonien zu ernten und in einer 14-mL steriles Röhrchen mit 4 mL LB Medien ergänzt mit 7 μg/mL Gentamicin, 10 μg/mL Tetracyclin und 50 μg/mL Kanamycin überführen. Inkubieren Sie Zellen über Nacht (~ 16 h) bei 37 ° C und 250 u/min.
    6. Nehmen Sie 1,5 mL der Nacht Kulturen und isolieren rekombinante Bacmid DNA (siehe die zusätzliche Datei 1 für ausführliches Protokoll ein). Speichern Sie die Bacmid bei 4 ° C für bis zu zwei Monate.
      Hinweis: Bereiten Sie die Glycerin-Bestände von DH10Bac E. Coli , Bacmid DNA enthält. Nehmen Sie 300 μL der Kultur und 200 μL des Glycerins mit 50 % (letzte Glycerin Konzentration von 20 %). Die aliquoten bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern.
    7. Überprüfen Sie das Vorhandensein von eTRPV1 in der rekombinanten Bacmid mittels PCR (siehe ergänzende Datei 1 für ausführliches Protokoll).
  2. Baculovirus
    Hinweis: Bei diesem Vorgang transfizieren Sie Sf9 Insektenzellen in einem 6-Well-Format. Alle Beträge und Mengen werden auf einer Basis pro gut gegeben. Vermeiden Sie die Verwendung von Antibiotika.
    1. Platte 1 x 106 Sf9 Zellen in 2 mL Insekt Zelle Medien. Lassen Sie Zellen für mindestens 45 Minuten befestigen.
    2. Verdünnen Sie 1 μg rekombinantes Bacmid DNA in 100 μl Insekt Zelle Medien. Mischen Sie vorsichtig.
    3. Verdünnen Sie 6 μL Transfection Reagens (TR) in 100 μl Insekt Zelle Medien. Mischen Sie vorsichtig.
    4. Kombinieren Sie die DNA und TR-Lösungen (Schritte von 3.2.2 und 3.2.3, beziehungsweise). Vorsichtig mischen und 30 min bei RT inkubieren
    5. Die DNA/TR-Mischung 0,8 mL Insekt Zelle Medien hinzufügen; Mischen Sie vorsichtig.
    6. Entfernen Sie das Insekt Zelle Medium aus den Sf9 Zellen und einmal mit 1 mL frisches Medium waschen.
    7. Das Waschen-Medium zu entfernen und fügen Sie DNS/TR Mischung (3.2.2 \u2012 3.2.5) zu den Zellen. Inkubieren Sie Zellen bei 27 ° C für 5 h (ohne Agitation).
    8. Entfernen Sie die Transfektion Mischung zu und ersetzen Sie mit 2 mL Insekt Zelle Medien mit 0,5 % fetalen bovine Serum (FBS). Fünf Tage inkubieren Sie Zellen bei 27 ° C.
      Vorsicht: Verhindern Sie Verdunstung der Zelle Medien durch füllen die leeren Brunnen mit Medien und für die 6-Well-Platte mit zwei Schichten von Paraffin Film.
    9. Übertragen Sie den Zellkulturmedien in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen. Den ersten Durchgang (P1) von viralen Material zu isolieren, indem Sie dreht das Rohr auf 8.000 x g für 15 min bei 4 ° c Den überstand auf eine saubere 15 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und sofort bei 4 ° c Lagern
      Hinweis: Schützen Sie das Virus vor Belichtung durch das Rohr mit Alufolie abdecken.
    10. Für die zweite Generation (P2) des viralen bestand, legte einen 25-mL SUSPENSIONSKULTUR Insekt Zelle Medien 1 x 106 Sf9 Zellen/ml, enthält 2 % FBS in einem 125-mL-Flasche (PLANEM Boden und entlüftet). Die 25 mL Kultur 25 μL des P1-Virus hinzugefügt.
    11. Inkubieren Sie die Kultur bei 27 ° C für 72 h.
    12. Um den P2 virale bestand zu ernten, die Kultur auf eine neue 50-mL-Tube übertragen und bei 8.000 x g für 15 min bei 4 ° c zentrifugiert
    13. Den überstand auf eine neue 50-mL-Tube übertragen und sofort bei 4 ° c Lagern
      Hinweis: Schützen Sie das Virus vor Belichtung durch das Rohr mit Alufolie abdecken. Führen Sie eine kleine Experiment, um die P2-Virus/Sf9-Verhältnis für optimale TRPV1 Ausdruck titrieren (siehe ergänzende Datei 1 für ein detailliertes Protokoll, Abschnitt 4 mit dem Titel "Kleine Experiment für P2-Virus".)
    14. Für groß angelegte Proteinexpression setzen eine 1-L Sf9 Aussetzung Zellkultur bei 2 x 106 Zellen/mL in Insekten Zelle Medien ergänzt mit 0,5 % FBS in ein 2,8-L-Borosilikat-Glas-Flasche.
    15. Die 1-L-Kultur 1 mL der P2 Virus bestand hinzu und bei 27 ° C für 72 h inkubieren.
      Hinweis: Am dritten Tag sollte Zelldichte bei etwa 1,5 bis 2,5 x 106 Zellen/mL sein.

4. eTRPV1 und Single-Cystein Mutant Reinigung

  1. Membranen Isolierung28
    1. Ernte die 1-L Insekt Aussetzung Zellkultur von Spinnen bei 4.500 x g, 4 ° C für 20 min. die Zelle Pellet (es wird voraussichtlich ca. 6-9 g) wiegen.
    2. Aufschwemmen der Zelle Pellets in 25 mL eiskaltes Puffer A (36,5 mM Saccharose, 2 mM tris(2-carboxyethyl) Phosphin (DÄMMUND) und 50 mM Tris; pH 7,4) in Anwesenheit von Protease-Inhibitoren (1 mM Phenylmethyl Sulfonyl Fluorid (PMSF), 3 μg/mL Leupeptin, 3 μg/mL Aprotinin und 1 μg/mL Pepstatin). Disaggregieren Sie Zelle Klumpen um eine homogene Suspension zu erhalten und bei 4 ° C für 20 min drehen.
    3. Brechen Sie die Zellen mit einer manuellen (Dounce Gewebe Grinder) oder eine Hochdruck-Homogenisator. Entfernen Sie die zellenrückstand durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 20 min bei 4 ° C.
      Hinweis: Halten Sie die lysierten Zellen und Rohre auf dem Eis während des gesamten Prozesses.
    4. Sammeln Sie überstand und Zentrifuge bei 100.000 x g für 30 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Membran-Pellets in einem Gesamtvolumen von 20 mL eiskaltes Puffer B (150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 2 mM DÄMMUND, 50 mM HEPES; pH 7,4), ergänzt mit Protease-Inhibitoren (wie in Schritt 4.1.2).
    5. Aliquoten 20 mL Membran Aussetzung in 50-mL-Tuben und Schockfrosten in flüssigem Stickstoff. Proben bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern.
  2. Protein-Reinigung26,28
    1. Tauen Sie die Membran Aliquote auf Eis auf und 3 mL n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) pro Rohr (200 mM lieferbar). Drehen Sie das Rohr für 2 h bei 4 ° C.
    2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 100.000 x g für 30 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den überstand zu und 1 mL sauberen feuchten Amylose Harz. Drehen Sie die Mischung für 2 h bei 4 ° C. Die Protein/Amylose-Mischung in Schwerkraft fließen Chromatographiesäulen zu laden.
      Vorsicht: Lassen Sie sich nicht das Harz während der Wäsche zu trocknen.
    3. Waschen Sie das proteingebundene Amylose-Harz mit 10mal das bettvolumen eiskalte Puffer c (150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL Asolectin, 0,5 mM DÄMMUND; pH 7,4). Waschen Sie mit 10 bettvolumen eiskalte Puffer d (150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL Asolectin, pH 7.4).
      Hinweis: Vor dem Waschen, Entgasen Sie Puffer D ohne Spülmittel oder Lipide, Spülung mit Stickstoff. Fügen Sie nach der Entgasung DDM und Asolectin hinzu.
    4. ETRPV1 Protein mit 0,5 mL Fraktionen eluieren, bis zu 5 mL, eiskalte entgast Puffer D, ergänzt mit 20 mM Maltose. Führen Sie nach Möglichkeit die Waschungen und Elution bei 4 ° C.
    5. Quantifizieren Sie die Protein-Menge durch Messung der Absorption bei 280 nm Wellenlänge.
      Hinweis: Dieses Protokoll ergibt 0,5 bis 1,0 mg Eiweiß pro Liter Kultur. Proteinausbeute könnte für jedes eTRPV1 Single-Cystein Mutant variieren. Für die EPR und Hirsche Experimente, wachsen 4 \u2012 6 L Kultur.

5. eTRPV1 Single-Cystein Mutant Site-Directed Spin Labeling

  1. ETRPV1-haltige Fraktionen mit einer zentrifugalen Filteranlage zu konzentrieren (cutoff = 100 kDa) bis zu 2 \u2012 2,5 mg/mL für die Kennzeichnung (Zyklen von 7.000 x g für 2 min bei 4 ° C).
  2. Das konzentrierte Protein ein 10-divisibel molaren Überschuss (3 Mal, alle 30 min.) an (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) Methyl-Methanethiosulfonate (MTSSL)-Spin-Label aus einer 100-mM-Vorratslösung in DMSO hinzufügen (eTRPV1 Monomer: MTSSL in 01:10 Molverhältnis) 17. halten Sie die Reaktion im Dunkeln bei RT für 1 h 30 min, gefolgt von Übernachtung Inkubation bei 4 ° C.
    Hinweis: In diesem Schritt konnte MBP entfernt werden durch Zugabe von TEV Protease während der Nacht Spin labeling Inkubation.
  3. Last Spin-markierten eTRPV1 auf eine Größe Ausgrenzung Chromatographiesäule equilibriert im Puffer E (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM DDM; pH 7,4), gesteuert durch ein schnelles Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System. Brüche mit eTRPV1 Tetramer zu sammeln.
    Hinweis: Enthalten Sie keine 10 % Glycerin in diesem Schritt, da es die Rekonstitution Effizienz reduziert.
  4. Quantifizieren Sie die Protein-Menge durch Messung der Absorption bei 280 nm Wellenlänge.
  5. Bewerten Sie die Reinheit der Probe mit einem SDS-PAGE-Gel (Gel fleckenfreie, 4 \u2012 20 %). Die Probe ist nun bereit für Spektroskopische Messungen in Lösung und/oder Proteoliposomes.

6. eTRPV1 Spin-Label Single Cystein Mutant Rekonstitution

  1. Trocknen Sie 10 mg Asolectin mit einem drehverdampfer unter Vakuum (≤100 Mbar) für 1 h bei 40 ° C. Asolectin Liposomen, fügen Sie 1 mL Puffer F (200 mM NaCl, 5 mM MOPS; pH 7,4) und beschallen die Mischung für 15 Minuten oder bis die Probe homogen ist.
  2. Destabilisieren Sie die Liposomen zu, indem Sie eine Endkonzentration von 2 mM DDM hinzufügen und 30 min bei RT inkubieren
  3. Beschriftete Protein bei 2 mg/mL zu konzentrieren und die Liposomen mit ein Protein/Lipid-Verhältnis 1:5 (Masse: Masse) hinzufügen.
    Vorsicht: Es ist wichtig, dass die vorgenannten proteinkonzentrationen da Spin labeling Effizienz sinkt bei niedrigen Konzentrationen und bei hohen, die das Protein herbeiführen könnte.
  4. Fügen Sie Puffer F zum Anpassen der Protein/Liposomen-Mischung zur DDM critical Micelle Konzentration (CMC) und Inkubation über Nacht bei 4 ° C unter schonenden rühren hinzu.
  5. Doppelte Volumen der Protein/Liposomen Mischung mit Puffer F und Reinigungsmittel entfernen, indem nacheinander drei Aliquote von unpolaren Adsorbens styroporkügelchen (30 mg, 50 mg und 80 mg) auf 1-h-Intervallen mit sanften Agitation bei RT
  6. Laden Sie die Mischung auf ein Spaltenfilter (Schwerkraft fließen Chromatographiesäule) entfernen die Perlen und die Proteoliposomes Mischung auf einer Ultrazentrifuge Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 100.000 x g für 1 h bei 4 ° C. Überstand verwerfen und das Pellet in 30 μl Puffer F. Aufschwemmen
    Hinweis: Beispiele sind bereit für spektroskopische Analyse und Injektion in Xenopus Eizellen. Wenn die Proben am gleichen Tag verwendet werden können, Schockfrosten sie in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus Eizelle Elektrophysiologie26,32
    1. Injizieren 50 nL von verschiedenen Verdünnungen von Spin-Label Proteoliposomes in Xenopus Eizellen wie in Abschnitt 2.2 beschrieben.
    2. Durchführen Sie TEVC Messungen nach 12 h Injektion, wie im Abschnitt 2.3.10 beschrieben.
  8. Fahren Sie mit spektroskopischen Messungen und Analysen (Abschnitt 7).

(7) Hirsche und EPR-Spectroscopies

  1. Doppelte Elektron-Elektron (Hirsch)-Resonanz-Spektroskopie.
    1. Messungen Sie Hirsch-in einem gepulsten EPR-Spektrometer mit Q-Band Frequenz (34 GHz) arbeitet und ausgestattet mit einem 10-W-Verstärker mit der Totzeit kostenlos vier-Pulsfolge bei 83° mit vom Hersteller gelieferte Software33.
    2. 50 µM Reinigungsmittel gereinigt eTRPV1 Spin-Label Cystein Mutanten in Puffer E (Schritt 5.5) mit 30 % (V/V) Glycerin für Cryo-Schutz zu ergänzen.
    3. Laden Sie die Probe in einer versiegelten Quarz Kapillarrohr und Spin an der Unterseite des Rohres durch kurze Lowspeed Zentrifugation (100 X g).
    4. Legen Sie das Kapillarrohr in flüssigem Stickstoff zum Einfrieren der Probenmaterials. Die Proben können an dieser Stelle bei-80 ° C für späteren Messung gespeichert werden.
    5. Legen Sie die Probe direkt in der Mikrowelle Resonator und lassen Sie es neu bei-83 ° für 10 \u2012 equilibrate 20 min.
    6. Messen die Probe mit einem vier-Puls Hirsch Standardprotokoll, mw1 (π/2) – τ1 – (π) mw1 – τ1 – (π) mw2 – τ2 – (π) mw1 – τ2 – Echo34. Die Pulslängen für mw1 (π/2) und (π) mw1 sind 10 bis 20 ns, beziehungsweise, und 40 ns für mw2 (π). Der Frequenzabstand auf 63 MHz festgelegt.
      Hinweis: Primäre Hirsch Verfall Daten können mit einer selbstgebauten Software (z. B. in Matlab) analysiert werden, die eine Summe von Gaußsche Verteilungen zu beschreiben, die Abstände zwischen Spin Etiketten19,35annimmt.
  2. Dauerstrich-(CW) EPR-Spektroskopie
    1. Durchführen Sie CW EPR-Experimente bei RT auf ein X-Band (9,6 GHz)-Spektrometer mit der Herstellersoftware.
    2. Starten Sie das Instrument durch den Wasserkühler, die Konsole und die Magnet-Stromversorgung einschalten. Schließen Sie die Software an das Gerät an, stellen Sie das Gerät im Einklang und warten Sie mindestens 30 min für das Instrument zum Aufwärmen.
    3. 20 µL der Probe aus Schritt 5.5 in einer 25 µL Glas Kapillarrohr mit Kapillarwirkung laden und am Ende des Rohrs mit Dichtmasse abdichten.
    4. Laden Sie das Kapillarrohr in der Mikrowelle Hohlraum und kritisch paar den Resonator, entweder manuell oder automatisch mit der Auto-Tune-Funktion der Software.
    5. Sammeln Sie die ersten derivativen Spektren Standardinstrument Bedingungen: 100 kHz-Mikrowelle-Modulation, 1,6 G Magnetfeld Modulation und 10 mW Mikrowellenleistung.
    6. Korrigieren Sie für die Auswertung und Präsentation die Spektren vor dem Hintergrund und dividiert die Spektren durch den Spitze-Spitze-Wert der das doppelte Integral zu normalisieren.
    7. Bestimmen Sie die Spin-Label Mobilität durch die Messung der inversen der Zentrallinie Breite der ersten Derivative Absorptionsspektren (ΔHo-1)36.

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Ergebnisse

Funktionelle Charakterisierung des minimalen Cystein-weniger TRPV1 konstruieren (eTRPV1) und Single-Cystein Mutanten

Der erste Schritt zur spektroskopischen Untersuchungen ist Ingenieur und Cystein-weniger Protein Konstrukte (Abbildung 2A), die sind funktionell und biochemische Mengen an Proteinen zu charakterisieren. eTRPV1 ist funktional wie von Ca2 + Bildgebung und TEVC (

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Diskussion

Aktuelle Technologien für Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Membranproteine machten es möglich, ausreichende Mengen an Protein für spektroskopische Untersuchungen14,15,16,42zu erhalten. Hier haben wir diese Technologien, um auszudrücken, zu reinigen, rekonstruieren und spektroskopische Analysen in TRPV1 angepasst.

Unter den kritischen Schritten in das Protokoll ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir sind sehr dankbar, Dr. H. Mchaourab für den Zugriff auf die EPR und Hirsche Spektrometer und Dr. T. Rosenbaum für die Bereitstellung der Full-Length Cystein-weniger TRPV1 Plasmid.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenese KitAgilent Technologies210519-5
2-Propanol (Isopropanol)Fisher ScientificA416
Albumin Rinderserum (BSA)GoldBio.comA-420-10
AmyloseharzNEBE8021L
AprotininGoldBio.comA-655-25
Asolectin aus SojabohnenSigma11145
Bac-to-Bac Baculovirus-ExpressionssystemInvitrogen Life Technologies10359016
Biobeads SM-2 Adsorbentien Bio-Rad152-3920
Pipetten aus Borosilikatglas (3,5'') (Eizelleninjektion)Drummond Scientific3-000-203 G/X
Pipetten aus Borosilikatglas (Oozytenaufnahmen)Sutter InstrumentB150-110-10HP
CaCl2 2H2OFisher ScientificC79
Carbenicillin (Dinatrium)GoldBio.comC-103-5
Cellfectin ReagenzInvitrogen, Life Technologies10362-010
cellSens,Olympus
ChloroformFisher ScientificC606SK
Kollagenase Typ 1Worthington-BiochemLS004196
CritisealVWR18000-299
D-(+)-GlukoseSigma G8270
D-(+)-Maltose-MonohydratFisher ScientificBP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranosid)AnatraceD310S
Medium mit hohem Glukosegehalt (Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium)SigmaD0572 
Einweg-PD-10-EntsalzungssäulenGE Healthcare45-000-148
EGTAFisher ScientificO2783
Fötales RinderserumInvitrogen Life Technologies10082-147
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep KitEpoch Life Science, Inc2160250
GenCatch PCR CleanupKit Epoch Life Science, Inc2360050
Gentamicin SulfatLonza17-518Z
Glaskapillare (25 &; Mikro; l)VWR53432-761
Glaskolben 2800 mLPyrex USA4423-2XL
GlycerinFisher BioReagentsBP229
HEK293S GnTl-ATCCCRL-3022
HEPESSigma H4034
IPTG (Isopropyl-Thio-B-Galactosid)GoldBio.com I2481C25
KanamycinsulfatFisher ScientificBP906-5
KClFisher ChemicalP217
LB Brühe, MillerFisher BioReagenzienBP1426
Leupeptin-HemisulfatGoldBio.comL-010-5
Lipofectamine 2000Invitrogen Life Technologies11668-019
MgCl2 6H2OFisher ScientificBP214
MgSO4 7H2OFisher ScientificBP213
mMESSAGE mMACHINE T7 KitAmbionAM1344
MOPSFisher BioReagenzienBP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl MethanethiosulfonatToronto Research Chemicals, IncO873900
NaClFisher ChemicalS271
Opti-MEMLife Technologies31985-062
Pepstatin AGoldBio.comP-020-5
Pluronsäure F-127 (20%)PromoKine   CA707-59004
PMSFGoldBio.comP4170
Poly-L-Lysin-LösungSigma-AldrichP4707
Rneasy Mini KitQiagen74104
Versiegelte KapillareVitroComSonderbestellung
SF-900 II SFM (Insektenzellmedium)Gibco, Life Technologies10902-088
Sf9 Zellen (SFM-angepasst)Invitrogen Life Technologies11496-015
Polarer Lipidextrakt aus SojabohnenAvanti Polar Lipids, Inc541602C
SaccharoseFisher ScientificS25590
Superose 6 Erhöhung 10/300 GLGE Healthcare29091596
TCEP HClGoldBio.comTCEP1
TetracyclinhydrochloridFisher ScientificBP912-100
Tris-BaseFisher BioReagentsBP152
TryptonDifco0123-01
X-GalGoldBio.comXenopus Eizellen
NascoLM00935M
XL1 - Blue Competent CellsAgilent Technologies, Inc200249
ExtraktDifco0127-01-7
Econo-Pack ChromatographiesäuleBio-Rad7321010
Mini-PROTEAN TGX Färbefreie FertiggeleBio-Rad17000436
pFastBac1 ExpressionsvektorInvitrogen Life Technologies10360-014
DH10Bac Kompetente ZellenInvitrogen Life Technologies10361-012
Critiseal Dichtstoff für KapillarrohreLeica Microsystems02-676-20
ABI Modell 3130XL Genetische AnalysatorenAngewandte Biosysteme4359571
TransferpipetteFishebrand13-711-9AM
Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
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Referenzen

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