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Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

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DOI:

10.3791/57801

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6. Juni 2018

 ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Batch-Verarbeitung von Hefe-2-Hybrid-Bildschirme ermöglicht direkten Vergleich der Interaktion profile mehrere Köder Proteine mit einem hoch komplexen Satz von Fusionsproteinen Beute. Hier beschreiben wir verfeinerten Methoden, neue Reagenzien und ihre Verwendung für solche Bildschirme zu implementieren.

Zusammenfassung

Screening für Protein-Protein-Interaktionen mit der Hefe-2-Hybrid-Assay ist seit langem ein wirksames Instrument, aber seine Verwendung wurde weitgehend auf die Entdeckung der hohen Affinität Interaktoren, die in der Bibliothek der interagierenden Kandidaten hochangereichertes sind begrenzt. In einem traditionellen Format kann Hefe 2-Hybrid Assay zu viele Kolonien zu analysieren, wenn bei niedrigen Stringenz durchgeführt ergeben, wo geringe Affinität Interaktoren gefunden werden könnte. Darüber hinaus kann nicht ohne eine umfassende und vollständige Befragung derselben Bibliothek gegen verschiedene Köder Plasmide, eine vergleichende Analyse erreicht werden. Obwohl einige dieser Probleme behoben werden kann, angeordneten Beute Bibliotheken verwenden, können die Kosten und die erforderliche Infrastruktur für solche Bildschirme betreiben unerschwinglich sein. Als Alternative haben wir die Hefe 2-Hybrid Assay um gleichzeitig entdecken Sie Dutzende von Transienten angepasst und statische Protein-Interaktionen in einem einzigen Bildschirm mit Hilfe einer Strategie bezeichnet DEEPN (dynamische Bereicherung für Evaluation of Protein Networks), die enthält Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung und Berechnung, mit der die Entwicklung einer Population von Plasmiden folgen, die Interaktionspartnern zu kodieren. Hier beschreiben wir maßgeschneiderte Reagenzien und Protokolle, die einen DEEPN Bildschirm einfach und kostengünstig ausgeführt werden können.

Einleitung

Ein vollständiges Verständnis der biologischen Zellprozesse stützt sich auf die Suche nach der Protein-Interaktion-Netzwerke, die ihre molekularen Mechanismen zugrunde liegen. Ein Ansatz zur Protein-Interaktionen zu identifizieren ist die Hefe 2-Hybrid (Y2H) Assay, die Arbeiten durch einen funktionierenden Chimären Transkriptionsfaktor zusammenfügen, sobald zwei Protein Domänen von Interesse an einander1binden. Ein typische Y2H-Bildschirm erfolgt durch die Schaffung einer Bevölkerung von Hefe, die beide eine Bibliothek von Plasmiden Codierung interagierenden Proteine verschmolzen zu einem transcriptional Aktivator beherbergt (zB., "Beute" Schmelzverfahren Protein) und ein bestimmtes "Köder" Plasmid bestehend aus dem Protein von Interesse verschmolzen zu einem DNA-bindende Domäne (z.B. die Gal4 DNA-bindende Domäne, die an die Gal4-upstream aktivierende Sequenz bindet). Einer der Hauptvorteile des Y2H-Ansatzes ist, dass es relativ einfach ist und kostengünstig durchzuführen in einem typischen Labor für Routinearbeiten molekularen biologischen2 ausgestattet. Jedoch wenn traditionell durchgeführt, Proben ein Benutzer einzelne Kolonien, die bei der Auswahl für eine positive Y2H-Interaktion entstehen. Dies schränkt die Anzahl der Bibliothek "Beute"-Klone, die befragt werden können. Dieses Problem wird verstärkt, wenn die Fülle an eine bestimmte interagierenden Beute sehr hoch im Vergleich zu anderen, verringern die Chance Interaktion von niedrigen Fülle Beute Plasmide zu erkennen ist.

Eine Lösung für die Verwendung der Y2H-Prinzip in umfassende Abdeckung des Proteoms ist die Verwendung eines Matrix-formatierte Ansatzes, wobei ein Array mit bekannten individuelle Beute Plasmide Digital abgefragt werden kann. Ein solches Vorgehen erfordert jedoch eine Infrastruktur, die nicht ohne weiteres zugänglich oder kostengünstig an die einzelnen Ermittler ist, die bei der Festlegung der Interaktom einer kleinen Anzahl von Proteinen oder Domänen3interessiert sind. Darüber hinaus würde sehr komplexe Beute-Bibliotheken, die mehrere Fragmente von interagierenden Proteine kodieren können solche Matrix Arrays zu unpraktisch Größen vergrößern. Eine Alternative ist Assays mit komplexen Bibliotheken in Chargen und das Vorhandensein von interagierenden Klone mit massiv parallelen Hochdurchsatz-Sequenzierung4zu bewerten. Dies kann angewendet werden, um das Vorhandensein von Beute Plasmide assay, die in mehrere Kolonien mit einem typischen entstehen Y2H formatiert Ansatz in der Hefe Zellen Gehäuse interagierenden Pair von Fusionsproteinen dürfen auf einer Platte5,6wachsen. Diese allgemeine Idee kann akzentuiert werden, zur Steigerung der Abfrage der beiden mehrere Köder und Komponenten in der gleichen Zeit7,8zum Opfer.

Dennoch, viele Untersuchungen erfordern, dass ein einfacher noch mehr Aufwand auf nur wenige Protein "Köder" konzentriert und profitieren mehr von einer erschöpfenden und semi-quantitativen Abfrage einer einzigen komplexen Beute-Bibliothek. Wir haben entwickelt und validiert ein Konzept für die breit angelegte Protein Wechselwirkungsstudien mit einem Y2H-Prinzip in Batch Format4durchführen. Dies nutzt das Wachstumstempo von einem bestimmten Beute Plasmid als Proxy für die relative Stärke der Y2H Interaktion9. Tiefe Sequenzierung aller Plasmide innerhalb einer Population normales Wachstum ausgesetzt oder selektive Wachstumsbedingungen produziert eine vollständige Karte der Klone, die starke und schwache Y2H Interaktionen ergeben. Das Repertoire der interagierenden werden erhalten und direkt über mehrere Köder Plasmide verglichen. Die resultierende Workflow bezeichnet DEEPN (dynamische Bereicherung für Evaluation of Protein Networks) kann so zum differenziellen Interactomes aus den gleichen Beute Bibliotheken, Proteine, Vergleich zwischen ein Protein vs. anderen zu identifizieren identifizieren.

Hier zeigen wir DEEPN und Verbesserungen in die Labormethoden, die seine Verwendung zu erleichtern, die in Abbildung 1aufgeführt sind. Signifikante Verbesserungen umfassen:

Generation der Beute Hefe Bevölkerung. Eine der wichtigsten Voraussetzungen der DEEPN erzeugt Populationen von Hefe mit verschiedenen Köder Plasmide, die die gleiche Verteilung der Plasmid-Beute-Bibliotheken haben. Gleichwertige Grundlinie Populationen der Beute Plasmid Bibliothek sind essentiell für genaue Vergleiche zwischen den Interactomes von unterschiedlichen Ködern. Dies geschieht am besten, wenn ein Bibliothek-Plasmid sich bereits in einer Population von haploiden Hefe befindet und Umzug eines bestimmten Köder-Plasmid in dieser Population erreicht wird, indem die Paarung um einen diploiden zu produzieren. Hier bieten wir einen klaren Leitfaden wie man solche Populationen mit kommerziellen Bibliotheken in haploiden Hefe untergebracht. Obwohl wir Methoden, die eine hohe Anzahl von diploiden zu erzeugen gefunden, war die Paarung Gesamteffizienz des diese kommerzielle Bibliothek-haltigen Hefestämme gering. Daher haben wir eine neue Sorte, die Beute Bibliotheken aufnehmen kann, die weit mehr diploiden pro Paarung Reaktion ergibt.

New set Köder Plasmide. Viele aktuelle Plasmide, die "Köder" Schmelzverfahren Proteine enthalten des Proteins des Interesses und eine DNA-bindende Domäne Ausdrücken basieren auf 2µ, so dass sie ihre Kopienzahl verstärken. Diese Kopienzahl kann sehr variabel in der Bevölkerung und führen zu Schwankungen in der Y2H transcriptional Antwort. Dies könnte wiederum die Fähigkeit zu beurteilen, die Stärke einer bestimmten Protein Interaktion anhand der Antwort Wachstum von Zellen unter Auswahl verzerren. Dies kann teilweise Adresse sein, mit einem niedrigen Kopie Plasmid, von denen einige wie die im Handel erhältlichen pDEST3210zuvor beschrieben wurden. Wir konstruierten eine neue Köder-Plasmid (pTEF-GBD), das produziert Gal4 DNA-bindende Domäne Fusionsproteine innerhalb einer TRP1 Zentromer-basierte niedrigen Kopie Plasmid trägt die Kanr-Resistenz-Gen, die auch ermöglicht, Klonen von Köder Fragmente sowohl stromaufwärts und unterhalb des Gal4 DNA-bindende Domäne.

Neue High-Density Y2H fragmentbibliothek. Wir ein neues Plasmid, Haus Y2H Beute Bibliotheken gebaut und benutzte es, um eine hochkomplexe Y2H-Bibliothek nach dem Zufallsprinzip geschert Bruchstücke von genomischer DNA aus Saccharomyces Cerevisiaegemacht zu bauen. Sequenzanalyse zeigte, dass diese Bibliothek mehr als 1 Million verschiedene Elemente, die weitaus komplexer als die zuvor beschriebenen Hefe genomische Y2H Plasmid Bibliotheken11. Mit dieser neuen Bibliothek konnten wir zeigen, dass der DEEPN-Workflow robust genug ist, um komplexe Bibliotheken mit vielen unterschiedlichen Plasmide in einer Art und Weise aufzunehmen, die zuverlässig und reproduzierbar ist.

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Protokoll

1. Vorbereitung von Medien und Platten

Hinweis: Alle Platten minimal 2 Tage vor Beginn des Protokolls vorgenommen werden müssen. Die Medien können jederzeit vorgenommen werden. Die gepufferten Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker Adenin (bYPDA) muss jedoch am Tag gemacht werden, von dem es verwendet wird. Einige Medien erfolgt über eine Ergänzung-Mischung mit einem Niveau von Adenin, das größer als das, was in der Regel gewohnt ist. Die meisten minimal Medien Ergänzungen geben Sie 10 mg/L Adenin. Nahrungsergänzungsmittel mit der Bezeichnung "+ 40Ade" geben Sie eine Gesamtmenge von 40 mg/L Adenin.

  1. Bereiten Sie Glukose-Lösung (50 % w/V). Für 1 L, 500 g D-(+) auflösen-Glukose in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas. Stellen Sie die Lautstärke auf 1.000 mL mit einem Messzylinder und Filter durch einen 0,2 µm Sterilfilter in eine sterile 1.000 mL-Medien-Vorratsflasche.
  2. Bereiten Sie Hefeextrakt Pepton Traubenzucker (YPD) Platten. Für 1 L, 20 g Pepton und 10 g Hefeextrakt in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 960 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen Sie 15 g Agar-Agar hinzu. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 40 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  3. Bereiten Sie komplette synthetische minimalste Medien (CSM)-Trp-Platten. Für 1 L, 6,7 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 960 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen Sie 0,7 g - Trp-Dropout-Mix, 20 mg Methionin und 15 g Agar getroffen. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 40 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  4. CSM-Leu-Met Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder und füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 1,005 g - Leu-ausfallende Mischung und 15 g des Nährbodens getroffen. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  5. CSM-Leu-Trp Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 1,005 g - Trp-Leu + 40Ade ausfallende Mix, 240 mg von Adenin und 15 g Agar. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  6. CSM-Leu-Trp-seine Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 0,975 g - Trp-Leu-seine + 40Ade ausfallende Mix, 240 mg von Adenin und 15 g Agar. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  7. CSM-Leu-Trp-His-3AT Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 0,975 g - Trp-Leu-seine + 40Ade ausfallende Mix, 240 mg von Adenin und 15 g Agar. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. In 100 µL einer 1 M steril Aktie des 3-amino-1,2,4-Triazol (3AT) durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  8. LB-Kanr Platten vorbereiten. Für 1 L, 10 g Tryptone, 5 g Hefe auflösen extrahieren und 10 g NaCl in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 1.000 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen Sie 15 g Agar-Agar hinzu. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Fügen Sie 50 mg Kanamycin und durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  9. YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp und CSM-Leu-Trp-HSI Medien vorbereiten. Verwenden Sie das Verfahren oben für außer statt in einen Erlenmeyerkolben gießen, Gießen Sie in ein Medien-Vorratsflasche und der Agar weglassen-Platten.
  10. BYPDA (gepufferte YPDA) vorzubereiten. Nehmen Sie sterile YPD Medien und fügen Sie 200 mg/L Adenin in sterilem destilliertem Wasser hinzu. PH bis 3.7 mit HCl. Filter durch einen 0,2 µm Sterilfilter in eine sterile Flasche einstellen.
  11. Bereiten Sie Transformation Puffer: 2 M Sorbit, 1 M Lithium Acetat Dihydrat, 10 mM Tris pH 7.6, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM-Kalzium-Chlorid in destilliertem Wasser. In eine sterile Flasche durch einen Sterilfilter 0.2 µm filtern.
  12. Bereiten Sie PEG-Lösung: 70 % w/V Polyethylenglykol 3350 in destilliertem Wasser. Von Autoklaven sterilisieren.
  13. Bereiten Sie Wirbeln: 8 M Harnstoff, 4 % w/V SDS, 50 mM Tris, pH 6,8, 10 % V/V Glycerin, destilliert 0,02 % w/V Bromophenol blue in sterilen Wasser.
  14. STE (starke TE) vorbereiten: 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 in destilliertem Wasser. In eine sterile Flasche durch einen Sterilfilter 0.2 µm filtern.
  15. Vorbereitung Zymolase-Stammlösung: 10 mg/mL Zymolase 100 t 50 mM Kalium Phosphat Diabas-pH 7,5, 50 % V/V Glycerin Puffer in sterilem destilliertem Wasser (bei-20 ° C gelagert).

2. Klonen und die Überprüfung der Köder Plasmide

Hinweis: Bau des Gal4-DNA-bindende Domäne Plasmide. Derzeit gibt es eine Vielzahl von im Handel erhältlichen und akademisch verfügbare Y2H-Systeme. DEEPN kann viele davon aufnehmen, vorausgesetzt, dass der Köder Plasmid mit dem Ausdruck des Proteins des Interesses verschmolzen zu einem DNA-bindende Domäne in einem TRP1-Plasmid enthalten. Andere nachgeschaltete Anforderungen sind, die die Sequenz sofort stromaufwärts der Beute Bibliothek einfügen bekannt ist und, die eine positive Y2H-Interaktion kann erzielt werden, durch die Produktion von His3 ermöglichen in Medien fehlt Histidin zur Auswahl. Hier beschreiben wir Gebrauch von einer neuen Y2H Köder Plasmid (pTEF-GBD, Abbildung 2), jedoch können andere Y2H-Köder-Plasmide einschließlich pGBKT7 sowie verwendet werden. Für Konstruktion und Evaluation von Köder Plasmide beschreiben wir Verwendung von pTEF-GBD. Generell empfehlen wir Gensynthese, einen offenen Leserahmen zu produzieren, die hält sich an die Hefe Codon Vorspannung zu guter Ausdruck und Leichtigkeit mit dem Klonen zu gewährleisten. Sicherstellen Sie, dass das Klonen Schema den Köder ermöglicht zu sein in-Frame mit dem Gal4 DNA-bindende Domäne und beim Klonen in der 3'-Website ein Stopcodon die Köder-kodierende Region folgt.

  1. Vorbereiten des Plasmid-Vektors. Plasmid pTEF-GBD ermöglicht das Klonen ein Fragment, die Codierung des Proteins des Interesses entweder 5' oder 3' der Region Codierung die Gal4 DNA-bindende Domäne mit einer schnellen Montage-Methode. Für Einfügung an der 5' Website, 3 µg pTEF-GBD NarI mit EcoRI zu verdauen oder für Einfügung an der 3'-Website, zu verdauen, mit BamHI und XhoI für 2-4 h Elektrophorese Probe in 1 % DNA Agarose-gel mit 0,2 - 0,5 µg/mL Interkalation Bromid (EtBr) bei 100 V. Verbrauchsteuern Schnitt 5.630 bp TEF-GBD und reinigen mit den DNA-Gel Extraction Kit in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers und quantifizieren DNA durch Absorption bei 260 nm durch Spektralphotometer12.
    Hinweis: Generation der Köder-Codierung Einsätze. DNA-Fragmenten codieren Proteine oder PROTEINFRAGMENTE von Interesse können mit Gensynthese erhältlich und als uncloned Fragmente. Es wird empfohlen, dass Codons für Ausdruck in Saccharomyces Cerevisiae optimiert sind und online-Tools zur Optimierung der Codon sind in der Liste der Materialien enthalten.
  2. Für 5' Insertion, flankieren das DNA-Fragment Kodierung ein ATG-Start-Codon durch 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 "und 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3", beziehungsweise. Für 3' Insertion im Rahmen mit den Gal4 DNA-bindende Domäne, flankieren die Codierung Fragment von 5'-Ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'und 5'-Tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Verwenden Sie für Plasmid Bau die schnelle Montage-Methode gemäß Anweisungen des Herstellers für Klonen Fragmente in geschnittenen pTEF-GBD.
    1. Teller alle E. Coli auf LB-Kanr Teller umgewandelt und 16-20 h bei 37 ° c inkubieren Kolonien Gehäuse pTEF-GBD mit dem gewünschten Einsatz können durch PCR-Amplifikation mit der Oligonukleotide identifiziert werden: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' und 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' Einfügen und 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3 "und 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3 "für 3' einfügen. Diese Oligonukleotide können auch als Primer für die Sequenzierung des Einsatzes dienen.
    2. Zur Vorbereitung planen > 10 µg jedes pTEF-GBD-Derivat und pTEF-GBD allein um Material für die Sequenzierung und Hefe Transformationen.
    3. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: 3 min bei 98 ° C, gefolgt von 25 Zyklen von 30 s bei 98 ° C, 30 s bei 55 ° C und 2 min bei 72 ° C, gefolgt von 5 min bei 72 ° C mit einem Puffer mit 2,5 mM MgCl2 , U/100 0,5 µL DNA Polymerase und proprietäre Buffer.

(3) Ausdruck von Fusionsproteinen Gal4-DNA-bindende Domäne

  1. Zuständigen Hefe zu machen.
    1. Streifen aus PJ69-4A Hefe auf einen YPD-Teller mit einem sterilen hölzerne Applikator, Schaben 1 mm3 -80 ° c eingefroren Lager und rieb es sanft über die YPD-Platte. Die Platte verschieben Sie den hölzernen Applikator so dass jedem Durchgang in einen unberührten Teil der Medienoberfläche geht. Inkubieren Sie die YPD-Platte bei 30 ° C, 2 Tage lang oder bis die einzelnen Kolonien sichtbar werden. Machen Sie den gefrorenen Bestand an PJ69-4A Hefe durch Aussetzung Hefe in Wasser oder Wachstum Medien, Ergänzung mit DMSO auf 7 % und bei-80 ° c Lagern
    2. Eine einzige Kolonie in 5 mL Kultur der YPD in einem 20 x 150 mm-Kultur-Rohr mit einer sterilen hölzernen Applikator zu impfen und wachsen über Nacht bei 30 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min.
    3. 50 mL YPD in einem 250 mL sterile Erlenmeyerkolben mit 4 mL der Nacht Kultur der PJ69-4A Hefestamm zu impfen. Wachsen Sie in einem schütteln Inkubator bei 30 ° C, 200 u/min zu einer optischen Dichte (OD600) von ca. 1,2 durch Spektralphotometrie mit einer standard 1 cm Schichtdicke bestimmt. Wachstum braucht in der Regel 5-7 h.
    4. Isolieren Sie Hefe durch Sedimentation in einer 50 mL konische Rohr 4.696 x g für 5 min bei Raumtemperatur in einer Benchtop-Zentrifuge. Entsorgen Sie überstand von dumping in flüssigem Abfall. Mit einer Pipette, Aufschwemmen Sie das Pellet in 5 mL Transformation Puffer und Transfer zum 15 mL konische Rohr. Resediment überstand verwerfen, und die Hefe in 1 mL der letzte Band der Transformation Puffer mit einer 1000 µL Pipette aufzuwirbeln.
    5. Hefezellen für 60 min. bei 30 ° C unter Schütteln bei 200 u/min inkubieren und dann für 30-90 min auf Eis legen.
  2. Hefe-Plasmid-Transformation.
    1. Fügen Sie in 1,5 mL sterile Microcentrifuge Schlauch 1 µg Plasmid pTEF-GBD-basierte und 5 µL 10 mg/mL Lachs Spermien Träger DNA-Lösung. Auch ein Röhrchen mit nur Lachs Spermien Träger DNA negative Veränderung zur Kontrolle. Jedes Rohr 100 µL Zellsuspension eiskalte Hefe mit Pipette hinzufügen. Hinzufügen von 100 µL 70 % PEG-Lösung mit 1000 µL Pipette und Mischung sanft durch Streichen der Röhre 5 - 10 mal (nicht Wirbel zu tun).
    2. Bei 30 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min für 45 min inkubieren.
    3. Hitzeschock bei 42 ° C für 15 Minuten.
    4. Sediment in einem Microcentrifuge 845 X g für 3 min bei Raumtemperatur, pipette aus überstand verwerfen, Aufschwemmen Pellet in 150 µL steriles Wasser von oben und unten pipettieren und über die Oberfläche eines CSM-Trp-Platte verteilt.
    5. Legen Sie Platten rechts oben in 30 ° C Brutschrank und inkubieren Sie für 2-3 Tage, bis die Kolonien sichtbar sind. Platten können umgedreht werden zur Vermeidung von Kondensation auf der Plattenoberfläche nach der Inkubation bei 30 ° C für 6 bis 12 h.
    6. Nehmen Sie 2-3 Kolonien pro Transformation und Streifen als Patch auf einem CSM-Trp-Teller mit einem sterilen Zahnstocher. Für 24 h bei 30 ° c wachsen lassen
  3. Lysates für Protein-Expression zu machen.
    1. 3 mL CSM-Trp flüssiger Medien mit einer Spiel-Kopf-Größe von Hefe aus dem Patch zu impfen und wachsen über Nacht bei 30 ° C in einem 20 x 150 mm-Kultur-Rohr unter Schütteln bei 200 u/min. Machen Sie zwei Übernachtungen Kulturen pro Köder und leeren pTEF-GBD Vektor.
    2. 1 mL der YPD zu je 3 mL der CSM-Trp über Nacht Kultur hinzufügen. Für 1 h bei 30 ° C unter Schütteln bei 200 u/min wachsen. Überprüfen Sie OD der Zellen durch Spektralfotometer.
    3. Sediment eine entsprechende Anzahl von Zellen, Normalisierung nach der OD. Verwenden Sie sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit eine 5 min Spritztour auf 2.348 x g bei Raumtemperatur in einem Microcentrifuge. Verwenden Sie eine Pipette, um überstand verwerfen. Der Endbestand entspricht mindestens 2,1 OD.
      Hinweis: Bei der Berechnung der entsprechende Anzahl von Zellen kann es vorkommen, dass unterschiedliche Volumina aus jede Nacht Kultur, die minimale 2.1 OD zu erreichen erforderlich ist.
    4. Aufschwemmen Sie das Pellet in 450 µL 0,2 M NaOH durch pipettieren rauf und runter. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederausschleudern Sie Zellen für 2 min bei 2.348 x g bei Zimmertemperatur, und entsorgen Sie des Überstands mit Pipette.
    5. Aufschwemmen der Pellet mit 50 µL TWIRL Puffer durch pipettieren oben und unten vorsichtig Luftblasen nicht zu machen. Hitze-Probe für 5 min bei 70 ° C.
  4. Suchen Sie nach Proteinexpression durch SDS-PAGE.
    1. Verwenden Sie eine gradient Gel von 4-20 % auf eine Vielzahl von Molekulargewichten sorgen gelöst werden kann. Last Gegenwert (gleiche OD) der Proben in einem SDS-PAGE gel und achten Sie darauf, mindestens eine Probe mit der unveränderten pTEF-GBD Vektor13,14,15gehören.
    2. Übertragen Sie nach der elektrophoretischen Trennung Gel auf Nitrozellulose und Immunoblot mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörper Anti-Myc und ECL Angriffsermittlungslösung (Abbildung 3).

4. selbst Aktivierung Test

  1. Streifen aus der MATalpha Hefe aus dem-80 ° C entspricht der Belastung die Beute-Bibliothek von Interesse auf einen Teller YPD durch eine sterile hölzernen Applikator, Schaben eine kleine Menge der Hefe aus der Flasche und Streifen sie über die YPD-Platte Gehäuse. Inkubieren Sie die YPD-Platte bei 30 ° C, 2 Tage lang oder bis die einzelnen Kolonien sichtbar werden. Ein Paare einzelne Kolonien auf einen Teller YPD Patch und Inkubation über Nacht bei 30 ° C.
    Hinweis: Die neue Sorte entwickelte sich hier zu Haus Beute Bibliothek ist PLY5725, während einige kompatibel im Handel erhältlichen Y2H-Bibliotheken in Y187 untergebracht sind.
  2. Folgen Sie die Anweisungen unter 3.3.1 - 3.3.4, PLY5725 mit LEU2zu verwandeln-basierte Plasmid verwendet, um die gewünschte Beute Bibliothek Haus. Für Bibliotheken entwickelte sich hier die entsprechenden Plasmid ist pGal4AD (pPL6343). Platte auf CSM-Leu-Met Teller Hefe transformanten wiederherstellen. Entstehen Sie nach Kolonien, Streifen als Flecken auf einen Teller CSM-Leu-Met und 24 h bei 30 ° c inkubieren
  3. Befolgen Sie das Protokoll in 3.4 Ausdruck pPL6343 leerer Vektor mit anti-bestätigen-HA monoklonalen oder polyklonalen Antikörper und ECL-Erkennung-Lösung.
  4. Streifen, die jeweils die transformierte PJ69-4A-Hefe in einem Kreuzmuster mit PLY5725 baut auf eine YPD-Platte, die bestätigt wurde, um Protein in Protokoll Abschnitt 3.4 und 4.3 express und über Nacht bei 30 ° C inkubieren. Nehmen Sie 1 mm3 Zellen, wo die beiden Stämme sind zusammengewachsen und patch auf, separate CSM-Leu-Met, CSM-Trp und CSM-Trp-Leu-Platten und 24 h zu wachsen.
    Hinweis: Gewünschte diploiden wachsen auf den CSM-Trp-Leu-Platten. Wachstum auf CSM-Leu-Met und CSM-Trp-Platten dienen als Positivkontrolle für Hefe Wachstum.
  5. Wachsen Sie lassen in 1 mL der CSM-Trp-Leu Medien über Nacht bei 30 ° C. Sediment 500 µL Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 2.348 x g, 3 min bei Raumtemperatur in einem Microcentrifuge. Überstand mit Pipette zu verwerfen. Die Zellen in 1 mL sterilem Wasser aufschwemmen und Sedimentation und Wiederfreisetzung zu wiederholen. Überprüfen Sie die OD600 Zellen.
  6. Machen Sie eine Reihe von 01:10 serielle Verdünnungen von jedem Zellsuspension mit sterilem Wasser mit dem Ausgangspunkt die meisten konzentrierten Lösung von jeweils eine OD von 0,5. Spot 5 µL jeder Verdünnung auf einem CSM-Leu-Trp-Teller, CSM-Leu-Trp-seine Platte und ein CSM-Leu-Trp-seine + 3AT Platte. Bei 30 ° C inkubieren und untersuchen auf Wachstum täglich über 3 Tage (Abbildung 4).
    Hinweis: für die 01:10 serielle Verdünnung, pipette 10 µL des Rohres mit einem OD 0,5 in 90 µL Wasser und Mischen von pipettieren rauf und runter. Weiterhin 01:10 serielle Verdünnungen bis insgesamt sechs verschiedenen Konzentrationen zu erkennen gibt.

5. Erstellen Sie Hefe Populationen mit Köder und Beute-Bibliothek

Hinweis: Die Y187 Belastung, die kommerzielle Beute Bibliothek Plasmide Häuser nicht gut Paaren. Somit sind folgenden optimierte Bedingungen verpflichtet, Komplexität der Bibliothek zu wahren. Die PLY5725 belasten enthaltenden Y2H Beute Bibliotheken Kumpels besser und der gleichen Paarung Verfahren kann verwendet werden, bei dieser Sorte (Abbildung 5).

  1. 3 mL der Kulturen aller der PJ69-4A transformanten tragen die verschiedenen TRP1zu impfen-mit pTEF-GBD Köder Plasmid in CSM-Trp-Medien in einem Kultur-Rohr. Gehören Sie zwei getrennte Kulturen mit pTEF-GBD Vector Plasmid allein, als verfahrenskontrollen dienen. Inkubieren Sie Kulturen bei 30 ° C, 200 u/min für 6 h und dann in ein 25 mL der Kultur in einem sterilen Erlenmeyer-Kolben für Übernachtung Wachstum verdünnen.
  2. Tauen Sie ein Fläschchen gefroren (-80 ° C) die MATalpha Zellen, enthalten die LEU2-Ausführung "Beute" Bibliothek bei Raumtemperatur. 125 mL der CSM-Leu-Met Medien in eine sterile Erlenmeyerkolben mit der gesamten aufgetauten Durchstechflasche zu impfen. Alle Kulturen über Nacht bei 30 ° C mit schütteln bei 200 u/min zu wachsen.
    Hinweis: Die OD600 der Nacht Kulturen muss zwischen 1,0 bis 1,5 bevor Sie zu den nächsten Schritten fortfahren.
  3. Zentrifugieren Sie 21 OD Entsprechungen der einzelnen PJ69-4A-Transformant-Kulturen mit einem 5 min Spin bei 4.696 x g bei Raumtemperatur. Für jede 10 Paarung Reaktionen auf Wunsch Pellet 39 OD600 Entsprechungen der MATalpha Belastung tragen die Bibliothek Plasmide in separaten 50 mL konische Röhrchen.
    1. Zellen in 10 mL sterilem Wasser und neu pellet in neuen 50 mL konische Rohr 4.696 x g 5 min bei Raumtemperatur in einer Zentrifuge Benchtop aufzuwirbeln. Mit einer Pipette, Sie vorsichtig, den überstand ohne Unterbrechung die gebeizte Zellen zu entfernen.
    2. Aufschwemmen Sie Pellets PJ69-4A in 4 mL und PLY5725 Zellen in 10 mL bYPDA (pH 3,7).
  4. Set-up fügen Paarung Reaktionen, Sie 1 mL PJ69-4A Zellen, 1 mL der MATalpha Bibliothek-haltigen Zellen und 1 mL bYPDA pH 3,7 bis neue 50 mL konische Rohr verwandelt. Bei 30 ° C mit sanften orbital Agitation (100-130 u/min) für 90 min inkubieren.
    1. Zentrifugieren Sie Zellen für 5 min bei 4.696 x g, bei Raumtemperatur in einer Benchtop-Zentrifuge. Überstand mit Pipette entfernen und erneut das Pellet in 2 mL 1:1 bYPDA:YPD. Platte auf einen 100 mm YPD Teller alle 2 mL mit Pipette und inkubieren Sie bei 30 ° C für ca. 20 h.
  5. Ernte-Zellen von den YPD-Platten mit einer Zelle Schaber, um die Zellen in 2-3 mL der CSM-Leu-Trp Medien zu verdrängen. Pipette verdrängt Zellen in ein 50 mL konische Rohr. Spülen Sie die Platten 4-5 Mal mit 2-3 mL CSM-Leu-Trp Medien von oben, die die Medien mit einer 1000 µL pipette pipettieren und sanft Auswerfen der Medien über die Plattenoberfläche YPD.
    1. Zentrifugieren Sie Zellen für 5 min bei 4.696 x g bei Raumtemperatur in einer Benchtop-Zentrifuge. Überstand mit Pipette zu verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 40 mL der CSM-Leu-Trp Medien durch pipettieren rauf und runter (Do nicht Wirbel).
  6. Zur Schätzung der Anzahl der diploiden Zellen gebildet, verdünnen Sie 4 µL der diploiden Mischung in 200 µL und 2000 µL CSM-Trp-Leu Medien. Platte 200 µL jeder Verdünnung auf einen Teller CSM-Leu-Trp.
    Hinweis: Die beiden Platten stellen eine 1: 10.000 und 1: 100.000 fache Verdünnung des Bestandes an diploiden geerntet und nachgiebig einem erwarteten ~ 9.000-27.000 Kolonien auf der Verdünnung 1: 10.000 nach Inkubation bei 30 ° C für 36-40 h Check Platten nach Schritt 5.7. Eine Mindestanzahl von 200 Kolonien auf der Verdünnung 1: 10.000 ist erforderlich, um zum Schritt 5.8
  7. Sofort nehmen Sie den Rest von je 40 mL der Zelle Wiederfreisetzung und impfen Sie eine 1.000 mL Erlenmeyerkolben, 500 mL von CSM-Leu-Trp Medien enthält. Nehmen Sie eine anfängliche OD600. Inkubieren Sie diese Flaschen bei 30 ° C mit schütteln bei 180 u/min bis zum Erreichen der Sättigung (~2.0 OD/mL). Dies dauert in der Regel ca. 36-40 h. Monitor Wachstum um 24 Uhr dann wieder bei 36 h OD600.
  8. Mit einer Pipette 20 mL Aliquote aller gesättigten 500 mL von Kulturen und Innoculate 2.000 mL Erlenmeyerkolben, ein mit 750 mL von CSM-Leu-Trp-Medien und die zweite mit 750 mL CSM-Leu-Trp-sein mit der niedrigsten 3AT entfernen, Hintergrund (vorher bestimmt in Abschnitt 4.5) beseitigt. Mischen Sie die neuen Kulturen (770 mL) gut durch Umschwenken und nehmen Sie eine erste OD600.
  9. Inkubieren Sie Kulturen bei 30 ° C unter Schütteln bei 180 u/min bis zum Erreichen der Sättigung, die in der Regel tritt innerhalb von 24 h für die nicht ausgewählten CSM-Leu-Trp-Kultur und kann über 70 h für Kulturen unter Auswahl für Y2H-Interaktionen.
  10. Wenn Kulturen Sättigung (OD ~ 2.0) erreicht haben, entfernen Sie die Zellen mit einem 5 min Spin bei 4.696 x g bei Raumtemperatur 11 mL Pipette, Sediment zu, verwerfen Sie überstand, Pipette, und bei-20 ° C frieren Sie ein oder fahren Sie auf die DNA-Extraktion. Die ausgewählten und nicht ausgewählten Proben werden sowohl für die Tiefe Sequenzierung verwendet werden.

(6) Probenvorbereitung für DEEPN Deep Sequencing

  1. DNA-Extraktion.
    1. Verwenden Sie eine Pipette, um Zelle Pellets aus Protokoll Abschnitt 5.7 in 500 µL Puffer sTE und Transfer zu einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch aufzuwirbeln. Fügen Sie 3 µL Betamercaptoethanol und 10 µL des Zymolase bestand. Gut mischen und im Inkubator für 24-36 h 37 ° C inkubieren.
    2. Extrahieren Sie die Probe zwei Mal mit 500 µL Phenol/Chloroform/Isoamyl Alkohol während der Verwendung ein Dunstabzugshaube16.
    3. Fügen Sie 7 µL 4 M NaCl, 900 µL eiskalt 100 % Ethanol (ETOH), Mix durch Umkehrung und entweder frieren-20 ° C oder Sediment DNA durch Spinnen 21.130 x g für 10 min bei Raumtemperatur in einem Microcentrifuge weiter.
    4. Überstand mit Pipette zu verwerfen. Waschen Sie die Pellets dreimal mit 900 µL 70 % ETOH.
    5. Sediment pellet 21.130 x g für 2 min und Rest ETOH-Waschanlagen mit Pipette zu entfernen. Trockene Pellets für 7 min bei 42 ° C.
    6. Aufschwemmen Pellet in 120 µL 0.1 x sTE im Wasserbad 37 ° C für 90 min, flick die Röhren alle 30 min. zu mischen.
    7. Pipette 60 µL der extrahierten DNA in eine sterile 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 120 µL sTE, 3,5 µL RNase A Lager, Flick zu mischen und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
    8. Ethanol-Niederschlag wie bereits in Abschnitt 6.1.3 - 6.1.5, getan, sondern verwenden 7 µL 5 M Ammoniumacetat statt 4 M NaCl.
    9. Aufschwemmen RNase A-behandelte DNA in 55 µL 0.1 x sTE im Wasserbad 37 ° C für 90 min, flick die Rohre zu mischen alle 30 min. Quantify DNA durch Absorption bei 260 nm auf einem Spektrophotometer.
  2. Fügt ein PCR cDNA.
    1. Führen Sie zwei, 50 µL PCR-Reaktionen pro DNA-Probe. Jede Reaktion enthält 25 Pmol jedes vorwärts und rückwärts Grundierung passend die Beute-Bibliothek-Plasmid (siehe Material). Reaktionen auch enthalten 25 µL der High-Fidelity-2 X PCR Master Mix, 5 µg DNA-Probe, und Wasser bis zu 50 µL. Amplify Reaktionen für 25 Zyklen mit Verlängerung von 3 min bei 72 ° C, einer Temperung Temperatur von 55 ° C für 30 s und bei 98 ° C für 10 S. vorauszugehen Denaturierung Radfahren durch eine 30 s Denaturierung bei 98 ° C und folgen mit einer 5 min Inkubation bei 72 ° C.
    2. Analysieren Sie 4 µL jeder PCR-Reaktion von 1 % DNA-Agarose-Gelelektrophorese mit DNA-Agarose-gel mit 0,2 - 0,5 µg/mL EtBr17. Visualisieren Sie DNA-Probe durch UV durchleuchtbaren. Beispiele zeigen, dass ein Abstrich der DNA etwa 1-3 kb, wo bandenmuster für Proben gefunden werden kann, wo war eine Y2H-Interaktion (Abbildung 6) ausgewählt.
    3. Doppelte PCR Proben zu kombinieren und mit dem PCR-Reinigung-Kit in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers zu reinigen und zu quantifizieren DNA durch Absorption bei 260 nm auf einem Spektrophotometer.

(7) deep sequencing

Hinweis: Probenvorbereitung und Sequenzierung auf eine Tiefe Sequenzierung-Plattform ist in der Regel in kommerziellen und akademischen DNA-Sequenzierung Kern Einrichtungen erhältlich.

  1. Scher 600 ng PCR-Produktes mit einem Hochleistungs-Ultra-sonikator, die Fragmente von einer durchschnittlichen Länge von ~ 300 bp.
  2. Generieren Sie indizierte Sequenzierung Bibliotheken mit ein vorbereitungssatz für tiefe Sequenzierung, die Linker Codierung Barcodes, Websites, Grundieren hinzufügt und erfassen Sie Sequenzen asymmetrisch an den Enden der DNA-Fragmente zu.
  3. Durchführen Sie Bibliothek-Zubereitung nach Herstellerangaben. Pool indiziert Bibliotheken und Sequenz als lange gepaart Ende liest auf einer tiefen Sequenzierung Plattform (z. B. 2 x 150 bp PE gelesen). Die gewünschte Anzahl der Lesevorgänge für jede Probe gezielt liegt zwischen 10 und 40 Millionen, mit mehr liest, für den nicht ausgewählten Populationen, die in der Regel komplexer sind gewünscht. Es wird empfohlen, mindestens 20 Millionen oder mehr liest für die nicht ausgewählten Populationen.

8. Bioinformatic Verarbeitung und Prüfung

  1. Prozess DNA Sequenzierung Daten in Form von Fastq mit einer Reihe von Stand-Alone-Software, die Programme gebaut, um die Karte (1) Reihenfolge gelesen, dass Dateien in einem universellen SAM-Format () (2) quantifizieren gen Bereicherung zwischen Datensätzen () (3) führen Sie statistische Analyse der Daten in Auftrag, welcher Kandidat Gene Rang sind positiv für Y2H Interaktion () 4) bieten Informationen, was positive Y2H Region(en) und welche translationale Rahmen der Beute cDNA pro gen-Fragmente ergeben Wechselwirkungen bestehen, und (5) Werkzeuge, nicht nur die 5' sondern auch die 3'-Ende der interagierenden Fragmente ermöglicht ihren Wiederaufbau und Überprüfung in einem traditionellen Y2H-Format zu rekonstruieren. Betrieb dieser Programme ist in der begleitenden Studie detailliert.

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Ergebnisse

Die Y2H-Assay ist weit verbreitet für die Suche nach Protein: Protein-Interaktionen und mehrere Anpassungen und Systeme entwickelt worden. Zum größten Teil sind die gleichen Überlegungen, die helfen, Erfolg mit diesen früheren Ansätzen für DEEPN wichtig. Beispiele für wichtige Benchmarks: Ausdruck der DNA-bindende Domäne Fusionsproteine, gewährleisten einem niedrigen Hintergrund der unechten seine + Wachstum in der diploiden, enthält den Köder mit einer leeren Beute Plasmid, eine hohe Eff...

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Diskussion

Hier bieten wir Ihnen eine Anleitung für Y2H-Assays im Batch mit optimierten Methoden durchführen. Es gibt ein paar wichtige Schritte im Verfahren um sicherzustellen, dass die Bevölkerung von Hefe, die Auswahl unterstellt würde Vertreter der Start-Bibliothek ist, genug der Ausgangspunkt Hefe Bevölkerung dient zur Auswahl um Variabilität zu begrenzen zu unterziehen . Diese Benchmarks sind relativ leicht zu erreichen, neben der Anpassung der Methoden und Materialien für einen traditionellen Y2H-Assay, wodurch dieser Ansatz...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben

Danksagungen

Wir danken dem Mitarbeiter im Institut für Humangenetik für NGS Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung. Wir danken für ihre Expertise bei der Vorbereitung genomische Bibliothek Fragmente für die Y2H-Plasmid-Bibliothek hier Einat Snir. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health unterstützt: NIH R21 EB021870-01A1 und durch NSF Research Project Grant: 1517110.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Illumina HiSeq 4000IlluminaTiefensequenzierungsplattform
Monoklonale Anti-HA-AntikörperBiolegend901514Primärer Antikörper zum Nachweis der Expression von HA in pGal4AD Konstrukte
Polyklonale Anti-Myc-AntikörperQED Biosciences Inc18826Primärer Antikörper zum Nachweis der Expression von MYC in pTEF-GBD Konstrukte
NarINew England BioLabsR0191S
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
BamHI-HFNew England BioLabsR3236S
XhoINew England BioLabsR0146S
Polyethylene Glycol 3350, PulverJ.T. BakerU2211-08
Lachs Sperma DNATrevigen, Inc verkauft von Fisher Scientific50-948-286Träger-DNA für die Hefeumwandlung Abschnitt 3.2.1.
Kanamycin-Monosulfat-ForschungsprodukteInternationalK22000
LE AgaroseGeneMateE-3120-500zur Herstellung von DNA-Agarose-Gelen
Natriumchlorid-ForschungsprodukteInternationalS23025
TryptonForschungsprodukte InternationalT60060
D-SorbitForschungsprodukte InternationalS23080
Lithiumacetat-DihydratMP Biomedicals155256
CalciumchloridThermoFisherC79
EDTA NatriumsalzForschungsprodukte InternationalE57020
HefeextraktpulverForschungsprodukte InternationalY20020
Hefestickstoffbasis (Ammoniumsulfat) ohne AminosäurenForschung Produkte InternationalY20040
CSM-Trp-Leu+40ADEFormediumDCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADEFormediumDCS1169
CSM-Leu-MetFormediumDCS0549
Inc4520-922
L-MethioninFormediumDOC0168
AdenineResearch Products InternationalA11500
D-(+)-GlucoseResearch Products InternationalG32045
Bacto AgarBD214010zur Herstellung von Medienplatten in Abschnitt 1
PeptonResearch Products InternationalP20240
3-Amino-1,2,4 TriazolSigmaA8056
2- Mercaptoehanol (BME)Sigma-AldrichM6250
Zymolyase 100TUSBiologicalZ1004
Kaliumphosphat zweibasischSigmaP8281
Phenol:Chloroform:IAAAmbionAM9732
AmmoniumacetatSigma-Aldrich238074
EthanolDecon Laboratories, INC2716
RNAse AThermoFisherEN0531
Harnstoff-ForschungsprodukteInternationalU20200
SDSForschungsprodukte InternationalL22010
GlycerinSigma AldrichG5516
Tris-HClGibco15506-017
BromphenolblauAmresco449
Gibson Assembly Cloning KitNew England BiolabsE5510SSchnelle Assemblierungsmethode zur Klonierung von Plasmiden in Abschnitt 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541SWird zur Amplifikation von Produkten für die Gibson-Assemblierung in Abschnitt 2.3 sowie zur Probenvorbereitung für die DEEPN-Tiefensequenzierung in Abschnitt 6.2.1
verwendet EthidiumbromidAmresco0492-5G
QIAquick PCR-AufreinigungskitQiagen28104Wird für die Aufreinigung von PCR-Produkten in Abschnitt 6.2.3
verwendet Qiaquick DNA-Gel-ExtraktionskitQiagen28704Wird für die Aufreinigung von verdautem pTEF-GBD in Abschnitt 2.1
verwendet KAPA Hyper Prep KitKAPA BiosystemsKK8500Vorbereitungskit für die Tiefensequenzierung
Codon-Optimierunghttp://www.jcat.de
Codon-Optimierunghttps://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocksIntegrated DNA TechnologiesDNA-Fragmente, die für die Klonierung in Abschnitt 2.2
verwendet werden Strings, die für die Klonierung in Abschnitt 2.2 verwendet werden
GenCatch Plasmid DNA mini-prep KitEPOCH Life SciencesWird zur Aufbereitung von DNA-Mengen in Abschnitt 2.3 verwendet
Covaris E220CovarisHochleistungs-Ultraschallgerät in Sektion 7
Oligonucelotid 5' - CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'		Integrated DNA Technologies oder Thermofisherfür die PCR-Amplifikation und Sequenzierung 5'-Insert pTEF-GBD während der Plasmidbildung
Oligo-Nucelotid 5'-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3'		Integrated DNA Technologies oder Thermofisherfür die PCR-Amplifikation und Sequenzierung 5'-Insert pTEF-GBD während der Plasmidbildung
Oligo-Nucelotid 5'-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3'		Integrated DNA Technologies oder Thermofisherfür die PCR-Amplifikation und Sequenzierung 3'-Insert pTEF-GBD während der Plasmidbildung
Oligonucelotid 5'-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3"		Integrierte DNA-Technologien oder Thermofisherfür die PCR-Amplifikation und Sequenzierung 3'-Insert pTEF-GBD während der Plasmidaufbau-Oligonukleotid-Oligonukleotid-5
'-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3'		Integrated DNA Technologies oder Thermofisher5' Pimer zur Insert-Amplifikation von pGAL4AD
Oligonucelotid 5'-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3"		Integrated DNA Technologies oder Thermofisher3' Pimer zur Insert-Amplifikation von pGAL4AD
Oligonucelotid 5'-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3"		Integrated DNA Technologies oder Thermofisher5' Pimer zur Insert-Amplifikation von pGADT7-Oligonucelotid
5' - TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3'		Integrated DNA Technologies oder Thermofisher3' Pimer zur Insert-Amplifikation von pGADT7
PJ69-4A MatA-Hefestammhttp://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries und ein Wirtsstamm, der für die hocheffiziente Zwei-Hybrid-Selektion in Hefe entwickelt wurde. GENETIK 1996 144:1425-1436MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBDDr. Robert Piper LabGal4-DNA binding doimain expression
plasmid pGal4AD (pPL6343)Dr. Robert Piper LabGal4-activation domain expression plasmid
100 mm PetrischalenKord-Vallmark verkauft von VWR2900
125 mL PYREX ErlenmeyerkolbenFisher ScientificS63270
250 mL PYREX ErlenmeyerkolbenFisher ScientificS63271
1.000 mL PYREX ErlenmeyerkolbenFisherScientific S63274
2.000 mL PYREX ErlenmeyerkolbenFisher ScientificS63275
20 X 150 mm Einweg-KulturröhrchenThermofisher14-961-33
PipettenhilfeDrummond4-000-100
5 mL Serologische PipetteDenvilleP7127
10 mL Serologische PipetteDenvilleP7128
25 mL Serologische PipetteDenvilleP7129
1.000 mL PYREX Griffin BeakerFisher Scientific02-540P
1.000 mL PYREX Aufbewahrungsflasche für wiederverwendbare MedienFisher Scientific06-414-1D
1.000 mL MesszylinderFisher Scientific08-572-6G
SpectraMax 190Molekulare Gerätezur Messung der optischen Dichte von Zellen
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000Spektralphotometer zur Quantifizierung der DNA-Menge
Electronic UV TransilluminatorUltra LumMEB 20zur Visualisierung der DNA in einem Ethidiumbromid-Agarose-Gel
P1000 Gilson PIPETMANFisherScientific F123602G
P200 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123601G
P20 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123600G
P10 Gilson PIPETMANFisher ScientificF144802G
1250 &Mikro; L Pipettenspitzen mit niedriger RetentionGeneMateP-1236-1250
200 µ LLow RetentionspipettenspitzenVWR10017-044
10 µ L XL Pipettenspitzen mit niedriger RetentionVWR10017-042
50 mL konisches RöhrchenVWR490001-627
15 mL konisches RöhrchenVWR490001-621
KüvettenschaberDenville ScientificTC9310
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenUSA Scientific1615-5500
HClFluka Analytical318949-1L
NaOHJ.T. Baker5674-02
HolzapplikatorenSolon Care55900
Eppendorf Mikrozentrifuge 5424Fisher Scientific05-400-005Mikrozentrifuge
Sorvall ST16RThermo Fisher Scientific75004381Tischzentrifuge
Amersham ECL Kaninchen IgG, HRP-linked whole Ab (vom Esel)GE GesundheitswesenNA934-1MLSekundärer Antikörper
Amersham ECL Maus IgG, HRP-linked whole Ab (von Schafen)GE HealthcareNA931-1MLSekundärer Antikörper
SuperSignal West Pico ChemilumineszenzsubstratThermo Fisher Scientific34080ECL-Nachweislösung
Isotemp InkubatorThermo Fisher ScientificInkubator
Mutitron 2INFORS HTSchüttelinkubator
Isotemp Digitalgesteuertes Wasserbad Modell 205Fisher ScientificWasserbad
Y2H Maus cDNA-Bibliothek in Y187 (Pfannengewebe)Clontechkommerziell erhältliche cDNA-Bibliothek
Y2H Maus cDNA-Bibliothek in Y187 (Mausgehirn)Clontech630488kommerziell erhältliche cDNA-Bibliothek
pGADT7 AD VektorClontech630442kommerziell erhältlicher AD-Vektor mit vielen cDNA-Bibliotheken
pGBKT7 DNA-BD-VektorClontech630443kommerziell erhältlicher DNA-BD-Vektor
Biolase DNA-PolymeraseBiolineBIO-21042DNA-Polymerase für Abschnitt 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal CyclerBioExpressP-6050-60 PCR-Gerät
TempAssure 0,5 mL PCR-RöhrchenUSA Scientific1405-8100
CSM-Trp-Met Bio 101, Thermofisher-DNA-Fragmente 630482 :

Referenzen

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

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