Summary
نقدم هنا، بروتوكول لتطوير في فيفو سرطان نموذج باستخدام تكنولوجيا خلايا ورقة. نموذج من هذا القبيل يمكن أن تكون مفيدة جداً لتقييم علاجات السرطان.
Abstract
يمكن أن يكون في فيفو حيوان نموذجا يحاكي سرطان البشرية مختلف التطبيقات التي تقدم المعلومات السريرية الهامة. التقنيات المستخدمة حاليا لتطوير نماذج السرطان في فيفو على قيود كبيرة. ولذلك، في هذه الدراسة، ونحن نهدف إلى تنفيذ تكنولوجيا خلايا الورقة وضع نموذج سرطان في فيفو . سرطانه الخلية الكبدية (HCC) هو وضع بنجاح في الفئران عارية استخدام أوراق الخلية التي تم إنشاؤها من العقود الخلية خط الخلايا. الأوراق خلايا السرطان التي تتولد عن طريق الالتصاق داخل الخلايا وتشكيل بنية طبقية، يسيطر عليها المصفوفة خارج الخلية. وهذا يسمح لزرع ورقة HCC في الكبد وإنشاء نموذج الحيوانات الحاملة لاستئصال ورم في غضون شهر. وباﻹضافة إلى ذلك، يجري التحقيق في دور الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) في وضع هذا النموذج السرطان. تم إنشاؤها بالإضافة إلى خلية ورقة العقود، وخط آخر خلية اثنين أوراق: ورقة من الخلايا العقود ونخاع العظم MSCs (BMMSCs) وورقة من الخلايا العقود والحبل السري MSCs (أوكمسكس). الأوراق التي لديها مزيج من الخلايا العقود و MSCs أيضا قادرة على إنتاج من الحيوانات الحاملة للورم. ومع ذلك، إضافة MSCs يقلل من حجم الورم المشكلة، وهذا أثر سلبي على التنمية الورم يختلف حسب المصدر MSCs المستخدمة. وهذا يشير إلى أنه من الممكن استخدام ورقة خلية المصنوعة من بعض أنواع المخططات الثانوية ماجستير في إدارة الورم والتحكم.
Introduction
العقود هي سرطان الكبد المرتبط إلى حد كبير سوء تشخيص الأولية. سنوياً، ما يقرب من نصف مليون يتم تشخيص المرضى الجدد مع العقود، الذين يمثلون 85% من مرضى سرطان الكبد في جميع أنحاء العالم1. هيباتوكارسينوجينيسيس ليس مرضاً نموذج واحد؛ بدلاً من ذلك، هو عبارة عن مجموعة من الأمراض التي لها ميزات نسيجية مختلفة والتغيرات الوراثية والجينوم، إضافة إلى تباين نتائج تشخيصية1. ولذلك، تتمثل التحديات الرئيسية في وضع استراتيجية علاجية فعالة للعقود هي المعرفة المحدودة للبيولوجيا العقود وعدم وجود نموذج مناسب الحيوانات التجريبية التي يمكن أن تساعد على فهم هذا المرض معقدة. في فيفو حيوان نموذجا يحاكي سرطان البشرية أمر ضروري لتحديد الجينات المرشحة، وتحديد علامات التنبؤات/التنبؤية المتورطين في أحداث السرطان، وكذلك للتحقيق في العوامل المختلفة التي قد تؤثر على استجابات السرطان إلى العوامل العلاجية.
لا يزال في المختبر دراسات السرطان المرتبطة بالقيود الرئيسية. وهذا يرجع إلى أن الخلايا السرطانية تفقد العديد من السمات في فيفو عندما يحتفظ في الثقافة. التغييرات التي تحدث للخلايا في المختبر نتيجة من غياب فسيولوجيا الأنسجة كلها في أجواء السابقين فيفو . سرطان خلية إلى التفاعل (stromal، ومحصنة، المفرج، الظهارية، إلخ) داخل ورم المكروية يعكس إلى حد كبير في سرطان الخلية الخصائص2. يمكن أن يغير وورم المكروية سرطان الخلية التعبير الجيني/البروتين وخواص، بالإضافة إلى أنجيوجينيتيك وإمكانات المنتشر. كما أن النظام الثقافة (2-د) ثنائي الأبعاد في المختبر يفتقر إلى مصفوفة أنسجة مناسبة، هو أمر ضروري لتنظيم تطور الورم. وهكذا، بسبب هذه القيود، في فيفو نماذج ينبغي دائماً تستخدم في دعم النتائج الأولية لنماذج في المختبر . في هذه الدراسة، نستخدم خلية ورقة تقنية لتطوير في فيفو حيوان نموذج الذي يوضح العملية البيولوجية الكاملة التي تقوم عليها العقود.
أكثر من عقد من الزمان، إنشاء مختبر اوكانو في طريقة جديدة لهندسة الأنسجة استناداً إلى خلية ورقة تقنية3. ويستخدم هذا الأسلوب من بلاستيك ثقافة حرارية مراعية للسماح الخلية عكسها الالتصاق/مفرزة من السيطرة على hydrophobicity السطحية. يسمح هذا الأسلوب حصاد رقيقة من الخلايا المستزرعة في شكل (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد سليمة (صحيفة i.e.,cell)، مع مصفوفة خارج الخلية جيدا (ECM) والتفاعلات خلية بخلية. يتطلب الأسلوب خلية ورقة precoating أطباق الثقافة مع poly(N-isopropylacrylamide) بوليمر مراعية لدرجة حرارة (PIPA أنا)، مما متاح تجارياً وجاهزة للاستخدام. عند درجة حرارة أقل من 20 درجة مئوية، البوليمرات "وضوحها وأنا" أصبحت رطبة وتذوب في المحاليل، حيث أنه في درجة حرارة أعلى (37 درجة مئوية)، البوليمرات تصبح المجففة وتتحول ترسبات عكر. البوليمر تحتوي على سلاسل أميد ماء وسلاسل الجانب مسعور (مجموعات الأيزوبروبيل). في درجات حرارة عالية، هو تكثيف الحركة البراونية من جزيئات الماء، بينما عند درجة حرارة منخفضة، تجميع جزيئات المياه المحيطة بمجموعات الأيزوبروبيل انهيار هيكل رطب ومجموعات الأيزوبروبيل مسعور بسبب التفاعلات مسعور. ولذلك، السلسلة بأكملها من البوليمر المجاميع، ورواسب4.
في الدراسة المقدمة، ويستخدم هذا الأسلوب وضع نموذج حيوان العقود باستخدام ثلاث خلايا مختلفة أوراق. يتكون الورقة الأولى استخدمت العقود الخلية خط الخلايا فقط، بينما ورقتين الأخرى تتكون من مجموعة من العقود الخلية خط الخلايا و MSCs من مصدرين مختلفين: MSCs (BMMSCs) من نخاع العظام والحبل السري MSCs (أوكمسكس). MSCs الخلايا اللحمية غير-المكونة للدم التي قادرة على التفريق بين المشتقات إينتوسيل من سلالة الوسيطة، بما في ذلك adipocytes، أوستيوسيتيس، تشوندروسيتيس، وميوسيتيس5. نحن نوظف هذه الخلايا عند إنشاء ورقة خلية السرطان السبب الإبلاغ غير متناسقة على أثر MSCs على السرطان. قد اقترح أن MSCs يمكن أن تعمل منفصلة اثنين: "MSC1"، النمط الظاهري proinflammatory، و "MSC2"، النمط الظاهري كآبته6. MSCs عن حصيلة تشبه المستقبلات (TLRs). فتيلة TLR4 من MSCs يزيد على إفراز عوامل proinflammatory، بينما يزيد فتيلة TLR3 على إفراز العوامل المثبطة للمناعة6. وأفادت دراسة في المختبر من هذه تعمل اثنين أن ثقافة التعاون MSC1 مع خطوط خلايا السرطان يخفف نمو خلايا السرطان، بينما الثقافة المشارك MSC2 كان الأثر المعاكس7. وهذا تورط أن MSCs يمكن أن تكون مؤيدة السرطان أو السرطان، اعتماداً على النمط الظاهري. وهكذا، بالإضافة إلى تطوير النموذج الحيواني العقود باستخدام تكنولوجيا خلايا ورقة، أننا نريد لاستكشاف أثر زرع ماجستير في التنمية الورم، وعما إذا كان سيتم تعزيز استخدام هذه الخلايا أو الحد من تطوير هذا النموذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع البروتوكول الرعاية الحيوانية المبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجنة الأخلاقية بجامعة الملك سعود. العمليات الجراحية والتخدير والأدوية الأخرى المستخدمة في الحيوانات تقرها اللجنة الأخلاقية بجامعة الملك سعود. يتم تنفيذ جميع الأعمال التجريبية بأفراد مدربين تدريبا مناسباً.
1-خلية ورقة البناء
- معطف أطباق الثقافة (أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة 3.5 سم) مع المصل البقري الجنين غير مخفف (FBS) والتأكد من تغطية جميع سطح الطبق.
ملاحظة: هذه الخطوة هامة لمفرزة الورقة خلية نظراً لأنه يدعم نمو الخلايا في أحادي الطبقة ويمنع التراكم الخلية. - احتضان الأطباق عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% أول أكسيد الكربون الجوي2 و 95%.
- إزالة FBS الزائدة من الأطباق المغلفة والسماح للصحون لتجف في درجة حرارة الغرفة (RT) على الأقل 1 ح.
- إعداد تعليق خلية ثلاثة: 1 × 106 HepG2 الخلايا والخلايا 1 × 106 HepG2 مع بمسكس، والخلايا 1 × 106 HepG2 مع أوكمسكس (بنسبة 4:1 لكل من بمسكس وأوكمسكس).
- البذور بتعليق الخلية المناسبة لكل طبق المسمى.
- تعليق كافة الخلايا في دميم الثقافة المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% أول أكسيد الكربون الجوي2 و 95%.
2-خلية ورقة مفرزة
- في التقاء خلية 100%، تأخذ الأطباق خارج الحاضنة 37 درجة مئوية.
- احتضان الطبق ورقة خلية HepG2 ح 1 RT، في حين تفرخ HepG2/بممسك والاطباق ورقة خلية HepG2/أوكمسك لمدة 30-40 دقيقة عند 20 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% أول أكسيد الكربون الجوي2 و 95%.
ملاحظة: الخلية الورقة المقدمة من HepG2 فقط الهشة؛ خفض درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية أسباب الأضرار التي لحقت بهيكل الورقة.
3-أداء العملية الجراحية
ملاحظة: أثناء فترة الحضانة لمفرزة خلية ورقة، بدء الإجراء الحيوان.
-
إرشادات لإعداد منطقة الجراحة
- إجراء جميع العمليات الجراحية في منطقة منفصلة عقيمة داخل المختبر، مثل غطاء أو الاندفاق الصفحي مجلس الوزراء غرفة عمليات جراحية معقمة. التأكد من وجود جميع الأسطح من منطقة الجراحة غير المسامية ومختومة ودائم، وسانيتيزابل.
- ارتداء ألبسة واقية مناسبة، بما في ذلك يدعك، والقفازات، وفاسيماسكس، وأغطية الرأس والأحذية.
- أدوات استخدام العمليات الجراحية التي هي نظيفة ومعقمة (عن طريق التعقيم؛ الجذعية المشبعة تحت الضغط العالي) في البداية لعملية جراحية.
- تغيير القفازات بين الفئران.
-
إعداد الحيوان لجراحة
- استخدام الفئران عارية 8-12 أسبوع.
- إنشاء التخدير عن طريق الحقن للفئران.
- إعداد الحل التخدير والكيتامين-إكسيلازيني، خلط 2 مل الكيتامين، 1 مل من إكسيلازيني (بتركيز 20 ملغ/مل)، و 1 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي العقيمة (مثلاً، كلوريد الصوديوم 0.9 في المائة) في قنينة معقمة 10 مل مصل جمع ويهز جيدا قبل استخدام.
- لتطبيق التخدير، حقن 0.2 مل xylazine الكيتامين الحل كل 100 غم وزن الجسم في الفئران إينترابيريتونيلي.
ملاحظة: الجرعة الإجمالية للحل هو 100 ملليغرام/كغم الكيتامين و 10 مغ/كغ من إكسيلازيني.
- إزالة التراب/الحطام مرئية من موقع الجراحية.
- تحقق من عمق التخدير عن طريق اختبار منعكس سحب دواسة (الأقدام pad رشة على كلا القدمين الخلفيتين).
ملاحظة: إذا قرصه وسادة القدم يسبب استجابة، كرر بجرعة من 0.05 مل/100 غرام (حوالي كل 30 دقيقة)، ثم إعادة فحص عمق مخدر. - تطهير منطقة الجراحة مع فرك مرحلتين من البوفيدون-اليود/الايزوبروبانول.
- تغطية الفئران مع ثني عقيمة لتفادي تلوث الشق.
- حقن الفئران تحت الجلد مع البوبرينورفين (0.01-0.05 مغ/كغ)8 قبل إجراء الشق.
- استخدام مشرط معقم، جعل من 7 إلى 10-سم قطع بين جلود وعضلات الكامنة لفضح الكبد.
- فصل في عضلة البطن من الجلد مع حافة مسطحة الظهر دون مشرط.
- طعن بعناية لينيا ألبا استخدام مشرط وتمديد القص مقص حاد.
4-خلية ورقة الزرع
ملاحظة: يتم زرع الخلايا ورقة في الكبد.
- جمع الورقة خلية من طبق الثقافة.
- اضغط بلطف الطبق الثقافة على مقاعد البدلاء لفصل الورقة من سطحه.
- فصل الورقة خلية من السطح للطبق كشط حافة الورقة في نصف دائرة استخدام تلميح ماصة معقمة.
- إزالة متوسطة أكملها بلطف من طبق الثقافة.
- التأكد من الورقة سليمة دون أي ضرر؛ وبخلاف ذلك، فإنه لا يمكن أن تستخدم (الشكل 1).
ملاحظة: يمكن الكشف عن الأوراق الناتجة مباشرة عن العين.
- تحضير غشاء عقيمة (ورق الترشيح) لحصاد الورقة خلية من الطبق.
- أولاً، نقع الغشاء مع المحلول الملحي العادي. ثم إزالة الملوحة الزائدة مع وسادة القطن معقمة.
- ضع الغشاء الرطب على الورقة الخلية، مع تجنب التجاعيد وفقاعات الهواء بين الغشاء والورقة خلية.
- إضافة بضع قطرات من المحلول الملحي العادي عبر الغشاء والورقة خلية لجمع لهم أسهل.
ملاحظة: لتجنب كسر الورقة خلية، لا تستخدم المياه المالحة الباردة ورفع الغشاء والورقة خلية مع الملقط. - ترك الغشاء لبضع ثوان للتأكد من أن الورقة خلية متصل بشكل صحيح إلى الغشاء، ومن ثم جمع ذلك.
- يعد الكبد لزرع الخلايا ورقة.
- تأكد من أن سطح الكبد الجافة بلطف التنصت على مع وسادة القطن معقمة.
- استخدام الملقط العقيمة، ضع الغشاء مع الورقة خلية على فص واحد من الكبد في الفئران.
- إضافة بضع قطرات من المحلول الملحي المعقم وتطبيق ضغط لطيف على الغشاء فصل الورقة خلية منه.
- انتظر لمدة 5 دقائق قبل إزالة الغشاء بعناية.
ملاحظة: يتم ذلك بضمان الورقة خلية موصولة بشكل صحيح إلى الكبد. - وأخيراً، أغلق عضلات الكامنة والجلد شقوق مع خيوط النايلون 5-0.
- تطهير منطقة الجراحة مع بوفيدون.
ملاحظة: يبين الشكل 2 رسم تخطيطي لإجراء زرع خلية ورقة في الكبد في الفئران عارية.
5-بعد انتهاء عملية جراحية الرعاية
- فورا بعد الجراحة، بيت الفئران فردياً لتجنب أكل لحوم البشر أو الخنق، ورصد ذلك بانتظام (على الأقل مرة كل 15 دقيقة) حتى أنها واعية وحركيا كاملا.
- ثم تقييم الفئران يوميا لمد 5-14، على الأقل 5 د قد، ضمان عدم وجود أي مضاعفات. أثناء عملية التقييم اليومي، تأكد مما يلي.
- يتم إغلاق الجرح، وخيوط سليمة، دون أن تكون مفرطة ضيق.
- لا توجد علامات الإصابة في موقع شق، مثل الحرارة، المفرط تورم، أو صديدي تصريف.
- لا توجد علامات المرتبطة بالألم، مثل انخفاض استهلاك الأغذية والمياه، وفقدان الوزن، والجفاف، التخييم الجلد، أو التنفس السريع وفتح الفم. للتحكم المعتدل للألم الشديد بعد الجراحة، إذا وجدت، حقن الفئران تحت الجلد مع البوبرينورفين (0.01-0.05 مغ/كغ) كل ح 6-89 للحد أدنى من 48-72 ح بعد.
6-تحليل مجال زرع
- شهر واحد بعد زرع الأعضاء، سكارفيس الفئران وجمع المنطقة المزروعة لغذائها والتحليل المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توموريجينيسيتي أوراق الخلايا المزروعة في الفئران:
شهر واحد بعد زرع الأعضاء، وضعت كافة أوراق خلية زرع كبد الفئران للأورام (الشكل 3). وكان متوسط حجم الأورام المتقدمة من HepG2، HepG2/بممسك، وأوراق خلية HepG2/أوكمسك 4.5 سم، 4 سم، و 2.5 سم، على التوالي10.
التحليل النسيجي لانسجة الكبد:
توضع وتلطيخ ويوزين (H & E) من غير زرع الفئران أظهرت كبد مع خلايا الكبد مرتبة في اللوحات التي أناستوموسي مع بعضها البعض، والنواة جولة، مع نوكليولي بارز واحد أو اثنين. على النقيض من ذلك، ورم المقاطع التي تم جمعها أظهرت حواف قابلة للحياة الملتهبة ونخريه تحت الجلد خلايا الكبد، مع ملامح النووية غير النظامية ومسح الانحطاط (الشكل 4).
الرقم 1: تلفيق خلية ورقة استخدام طبق ثقافة مراعية لدرجة حرارة 3.5 سم. (أ) هذا الفريق يظهر ورقة خلايا تالفة غير الصالحة للزرع. (ب) هذا الفريق يظهر ورقة خلية سليمة، جاهزة للزرع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : خلية ورقة الزرع الداخلي في الفئران عارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : وضع الورم في الكبد في الفئران بعد شهر واحد من زرع الخلايا ورقة- الورم تم إنشاؤها من (A) HepG2 خلية ورقة (الحجم: 4.5 سم)، ورقة (ب) خلية HepG2 وبممسك (الحجم: 4 سم)، وورقة (ج) خلية HepG2 وأوكمسك (الحجم: 2.5 سم). الدوائر الزرقاء تظهر منطقة الورم. لقد تم تعديل هذا الرقم من أعمال منشورة سابقا10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : التحليل النسيجي للكبد في الفئران. ح & ه تلطيخ من الكبد في الفئران، وأربعة أسابيع بعد زرع الخلايا ورقة. (أ) عادي يظهر الفريق هذا الجرذ الكبد الخلايا. (ب) هذا الفريق يظهر مورفولوجية الكبد بعد زرع خلايا السرطان. السهم الأسود يشير إلى سرطان الكبد والأسهم الخضراء تشير إلى خلايا الكبد العادي، يشير السهم الأزرق إلى الخلايا الملتهبة، ويشير السهم البرتقالي إلى نخرية الخلايا العقود. تبين أشرطة حجم 20 X التكبير. لقد تم تعديل هذا الرقم من أعمال منشورة سابقا10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كمية واسعة من البحوث مكرس لتطوير كافية في فيفو الإكلينيكية حيوان نموذجا مشابهاً للسرطانات البشرية. في الوقت الراهن، تشمل النهج الرئيسية المستخدمة لإنشاء نماذج حيوانية سرطان الهندسة الوراثية وخلية زرع11. النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا أدوات جيدة لتحديد الهوية والتحقق من صحة الجينات المستهدفة، فضلا عن فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء التسمم الناجم عن المخدرات. ومع ذلك، يرتبط هذا النموذج مع بعض القيود؛ على سبيل المثال، تعديل الجين المعطى لا تؤدي دائماً إلى النمط الظاهري المتوقعة12. النهج الذي زرع خلية هو أكثر شيوعاً للحث على السرطان في الحيوانات، وأنه ينطوي على حقن تعليق خلية السرطان. حتى الآن، وهذا النهج بسيطة ومريحة قد سلبياته الخاصة. لإنشاء تعليق خلية، سيتم استخدام خطوة هضم الأنزيمي لحصاد الخلايا السرطانية. يؤدي هذا إلى فقدان بعض البروتينات الالتصاق، مما يقلل من كفاءة انجرافتمينت للخلايا المزروعة. ولذلك، لا يوجد ضمان أن تشكل الخلايا السرطانية زرع الأنسجة السرطانية، ناهيك عن صعوبة التحكم في حجم الورم المستحث. وبالإضافة إلى ذلك، أن هذا النهج قد عيب خطير آخر، هو التحول السريع للخلايا السرطانية المزروعة في الدورة الدموية أو انجرافتمينت الخلية إلى أجهزة غير المستهدفة13.
تم تطوير تكنولوجيا ورقة خلية جديدة للتغلب على هذه العيوب. سوزوكي et al. تم إنشاء 14 بنجاح في القولون والكبد والحيوانات الحاملة لورم البنكرياس باستخدام أسلوب زرع سرطان الخلية ورقة. عند مقارنة بالأورام التي تم إنشاؤها عن طريق أسلوب زرع خلايا السرطان، وهذه الأورام كانت أكبر حجماً وأكثر استقرارا. زرع الأنسجة ورم صغير في حيوان للحث على ورم يعتمد اعتماداً كبيرا على استخدام أسلوب زرع الأعضاء التي لا تتطلب خطوة هضم الأنزيمي. الإنزيمات proteolytic يسبب الضرر لمصفوفات خارج الخلية، مما يؤثر على التفاعل خلية بخلية. خلية ورقة تقنية ويتغلب على هذا الحد من استخدام أسلوب حصاد الغازية، مما يتيح جمع ورقة خلية سليمة أحادي الطبقة، جنبا إلى جنب مع ما يرتبط خارج الخلية مصفوفة وعوامل النمو15. خلية ورقة تقنية يسمح أيضا للمدى الطويل16،engraftment17. وهذا ذات قيمة كبيرة في الدراسات في فيفو ، حيث يجب أن تكون الخلايا قادرة على انجرافت في أنسجة المضيف لفترة كاملة من الأنسجة حياة17. وباﻹضافة إلى ذلك، مكنت هذه التقنية تطوير طريقة جديدة لهندسة الأنسجة، دون استخدام السقالات للتحلل3،15. حتى الآن، وهذا النهج لا يزال لديه عدد قليل من القيود. عند استخدام الأسلوب ورقة الخلية، قد ربما تصبح الجزء المركزي من الأنسجة المطعمة نخرية إذا كانت كبيرة جداً الاختلاس. على العكس من ذلك، قد تقل فرصة النجاح لزرع الأعضاء إذا الاختلاس صغير جداً. بالإضافة إلى ذلك، من أجل السيطرة على نمو الورم اللاحقة، زرع الأنسجة يجب أن يكون الحجم موحد عبر كل التجارب. حجم الأنسجة الأولى يقتصر على 2 مم3 نتيجة لاستحثاث نخر بسبب البيئة الفقيرة الأكسجين18.
في هذه الدراسة، أنشئ نموذج حيوان العقود بنجاح باستخدام زرع خلايا أوراق خالية من السقالة. ثلاثة أنواع من أوراق خلية تم زرعها في كبد الفئران: ورقة خلية للعقود الخلية خط الخلايا، خلية ورقة للعقود الخلية خط الخلايا وبمسكس، وورقة خلية للعقود الخلية خط الخلايا وأوكمسكس. وكان زرع كل خلية ثلاث أوراق كافية لحمل الأورام في الفئران المستفيدة. ومع ذلك، لوحظ أن إضافة MSCs إلى الورقة تقليل حجم الأورام المشكلة. يشير هذا إلى أن MSCs المستخدمة، لا سيما أوكمسكس، يكون لها تأثير سلبي على التنمية الورم. في الختام، سرطان الخلية ورقة زرع يوفر طريقة فعالة لإنشاء نموذج حيوان مع الأورام الصلبة. يمكن أن يؤدي وجود مثل هذه النماذج في فيفو المعلومات السريرية الهامة مع التطبيقات الكبيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، كما يتضح من تخفيض حجم الورم، أوكمسكس الحد من التنمية الورم والدعوة. يشير هذا إلى أنه يمكن استخدام بعض أنواع المخططات الثانوية ماجستير في اتباع نهج يستند إلى الخلية لعلاج السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر موظفي الجراحة التجريبية ومختبر الحيوان في كلية الطب، جامعة الملك سعود، على التعاون والدعم، خصوصا حسين المخيزيم وهشام العودة. الكتاب تود أيضا أن نعترف بفريق وسائط الإعلام في جامعة الملك سعود بن عبد العزيز لإعداد البصرية المادية لا سيما معاذ بن غنام وعبد الوهاب السلمي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river |
References
- Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
- Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
- Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
- Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017).
- Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
- Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
- Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
- Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
- Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
- Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).
