Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान सेल शीट प्रौद्योगिकी का उपयोग कर vivo कैंसर मॉडल में विकसित करने के लिए । इस तरह के एक मॉडल विरोधी चिकित्सकीय के मूल्यांकन के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है ।
Abstract
में एक vivo पशु मॉडल है कि मानव कैंसर की नकल विभिंन अनुप्रयोगों है कि महत्वपूर्ण नैदानिक जानकारी देने हो सकता है । वर्तमान में vivo कैंसर मॉडल के विकास के लिए तकनीक का इस्तेमाल काफी सीमाएं हैं । इसलिए, इस अध्ययन में, हम सेल शीट प्रौद्योगिकी को लागू करने के लिए vivo कैंसर मॉडल में एक विकसित करने का लक्ष्य है । Hepatocellular कार्सिनोमा (HCC) सफलतापूर्वक HCC सेल लाइन कोशिकाओं से बनाए गए सेल शीट का उपयोग कर नग्न चूहों में विकसित की है । कैंसर कोशिका चादरें intracellular आसंजन और एक स्तरीकृत संरचना, extracellular मैट्रिक्स द्वारा नियंत्रित के गठन के माध्यम से उत्पंन कर रहे हैं । यह जिगर में HCC शीट प्रत्यारोपण के लिए अनुमति देता है और एक महीने के भीतर एक ट्यूमर-असर पशु मॉडल के निर्माण । इसके अलावा इस कैंसर मॉडल के विकास में mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) की भूमिका की जांच की जाती है । HCC सेल लाइन शीट के अलावा, एक और दो सेल शीट बनाए जाते हैं: HCC कोशिकाओं और अस्थि मज्जा MSCs (BMMSCs) और HCC कोशिकाओं और गर्भनाल MSCs (UCMSCs) के एक पत्रक के एक पत्रक । चादरें कि दोनों HCC कोशिकाओं और MSCs का एक संयोजन है भी एक ट्यूमर असर जानवर के उत्पादन में सक्षम हैं । हालांकि, MSCs के अलावा गठन ट्यूमर के आकार को कम कर देता है, और ट्यूमर के विकास पर इस प्रतिकूल प्रभाव प्रयुक्त ' MSCs स्रोत पर निर्भर करता है । यह इंगित करता है कि एक सेल शीट कुछ एमएससी उपप्रकार के बने ट्यूमर प्रबंधन और नियंत्रण में उपयोग किया जा सकता है ।
Introduction
HCC काफी एक गरीब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है कि जिगर की एक प्राथमिक कैंसर है । प्रतिवर्ष, लगभग डेढ़ लाख नए रोगियों HCC के साथ का निदान कर रहे हैं, जिगर कैंसर रोगियों के ८५% दुनिया भर में1का प्रतिनिधित्व । Hepatocarcinogenesis एक भी रूप रोग नहीं है; बल्कि, यह विभिंन histopathological सुविधाओं और आनुवंशिक और जीनोमिक परिवर्तनशीलता है कि रोगों का एक संग्रह है, विभिंन शकुन परिणामों के अलावा1। इसलिए, HCC के लिए एक प्रभावी चिकित्सीय रणनीति के विकास में मुख्य चुनौतियों HCC जीव विज्ञान और एक उपयुक्त प्रयोगात्मक पशु मॉडल है कि इस जटिल बीमारी को समझने में मदद कर सकते हैं की कमी की सीमित ज्ञान कर रहे हैं । एक vivo पशु मॉडल है कि नकल करता है मानव कैंसर उंमीदवार जीन का चयन करने और शकुन/पूर्वानुमान कैंसर प्रेरण में फंसा मार्करों की पहचान करने के लिए आवश्यक है, साथ ही विभिंन कारकों है कि कैंसर प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते है की जांच के लिए चिकित्सकीय एजेंटों के लिए ।
इन विट्रो में कैंसर अध्ययन अब भी प्रमुख सीमाओं से जुड़े हैं. यह तथ्य यह है कि कैंसर की कोशिकाओं vivo में उनके कई खो सुविधाओं के कारण है जब संस्कृति में बनाए रखा । इन विट्रो में कोशिकाओं को होने वाले परिवर्तन एक पूर्व vivo सेटिंग में पूरे ऊतक फिजियोलॉजी के अभाव से परिणाम. कैंसर सेल के लिए सेल संपर्क (stromal, प्रतिरक्षा, vasculature, उपकला, आदि) ट्यूमर microenvironment के भीतर कैंसर कोशिका विशेषताओं2पर बहुत दर्शाता है । ट्यूमर microenvironment कैंसर सेल जीन बदल सकता है/प्रोटीन अभिव्यक्ति और phenotypic विशेषताओं, angiogenetic और मेटास्टेटिक क्षमता के अलावा । दो आयामी (2-डी) इन विट्रो संस्कृति प्रणाली में भी एक उपयुक्त ऊतक मैट्रिक्स का अभाव है, जो ट्यूमर प्रगति को विनियमित करने के लिए आवश्यक है. इस प्रकार, इन सीमाओं के कारण, vivo मॉडल में हमेशा के प्रारंभिक निष्कर्षों का समर्थन करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए इन विट्रो मॉडल. इस अध्ययन में, हम सेल शीट प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए एक vivo पशु मॉडल है कि elucidates पूर्ण जैविक प्रक्रिया अंतर्निहित HCC विकसित करने के लिए ।
एक दशक से अधिक पहले, Okano प्रयोगशाला सेल शीट प्रौद्योगिकी3पर आधारित ऊतक इंजीनियरिंग की एक उपंयास विधि की स्थापना की । यह तकनीक सतह hydrophobicity को नियंत्रित करके प्रतिवर्ती कोशिका आसंजन/टुकड़ी को अनुमति देने के लिए एक थर्मामीटर-उत्तरदायी संस्कृति प्लास्टिक का इस्तेमाल करता है । यह विधि एक बरकरार त्रि-आयामी (3-डी) प्रारूप (यानी, सेल शीट) में एक सुनियोजित कोशिकाओं की कोमल कटाई की अनुमति देता है, एक अच्छी तरह से रखा extracellular मैट्रिक्स (ECM) और सेल से सेल बातचीत के साथ । सेल शीट तकनीक एक तापमान उत्तरदायी बहुलक पाली (एन isopropylacrylamide) (PIPA Am) है, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और उपयोग के लिए तैयार है के साथ संस्कृति व्यंजन की कोटिंग की आवश्यकता है । 20 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान पर, PIPA बहुलक हाइड्रेटेड हो जाते हैं और जलीय समाधान में घुल जाते हैं, जबकि, उच्च तापमान (३७ डिग्री सेल्सियस) पर, पॉलिमर निर्जलित हो जाता है और पंकिल हाला में परिणत हो जाता है । बहुलक जंजीरों और hydrophobic पक्ष श्रृंखला (isopropyl समूहों) के बीच हाइड्रोफिलिक शामिल हैं । उच्च तापमान पर, जल अणुओं की Brownian आंदोलन तेज है, जबकि, एक कम तापमान पर, हाइड्रेटेड संरचना टूटने के isopropyl समूहों के आसपास के पानी के अणुओं और hydrophobic isopropyl कुल के समूहों hydrophobic बातचीत के कारण । इसलिए, बहुलक समुच्चय और हाला4की पूरी श्रृंखला ।
प्रस्तुत अध्ययन में, इस तकनीक को तीन अलग सेल शीट का उपयोग कर एक HCC पशु मॉडल विकसित करने के लिए कार्यरत है । अस्थि मज्जा MSCs (BMMSCs) और नाल नाल MSCs (UCMSCs): पहले कार्यरत पत्रक केवल HCC सेल लाइन कोशिकाओं के होते हैं, जबकि अन्य दो चादरें HCC सेल लाइन कोशिकाओं और दो अलग स्रोतों से MSCs का एक संयोजन से मिलकर बनता है । MSCs गैर टेम stromal कोशिकाओं है कि mesenchymal वंश के intocell डेरिवेटिव, adipocytes, osteocytes, chondrocytes, और myocytes5सहित विभेद करने में सक्षम हैं । कारण है कि हम इन कोशिकाओं को रोजगार जब कैंसर के सेल शीट बनाने के कैंसर पर MSCs के प्रभाव पर असंगत रिपोर्टिंग है । यह सुझाव दिया गया है कि MSCs दो विशिष्ट phenotypes हो सकता है: "MSC1", एक भड़काऊ phenotype, और "MSC2", एक immunosuppressive phenotype6. MSCs एक्सप्रेस टोल रिसेप्टर्स की तरह (TLRs) । MSCs के TLR4 भड़काना भड़काऊ कारकों के अपने स्राव बढ़ जाती है, जबकि TLR3 भड़काना immunosuppressive कारकों6के अपने स्राव बढ़ जाती है । इन विट्रो में एक इन दोनों phenotypes के अध्ययन की रिपोर्ट है कि एक सह कैंसर कोशिका लाइनों के साथ MSC1 की संस्कृति तनु कैंसर कोशिका विकास, जबकि MSC2 सह संस्कृति विपरीत प्रभाव7था । यह फंसाती है कि MSCs या तो प्रो कैंसर या विरोधी, उनके phenotype के आधार पर किया जा सकता है । इस प्रकार, सेल शीट प्रौद्योगिकी का उपयोग कर HCC पशु मॉडल को विकसित करने के अलावा, हम ट्यूमर के विकास पर एमएससी प्रत्यारोपण के प्रभाव का पता लगाने के लिए चाहते हैं, और क्या इन कोशिकाओं का उपयोग बढ़ाने या इस मॉडल के विकास को कम करेगा ।
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Protocol
प्रोटोकॉल राजा सऊद विश्वविद्यालय के एथिकल कमेटी के पशु देखभाल दिशानिर्देश के बाद । सर्जिकल प्रक्रियाओं, निश्चेतक, और अंय जानवरों पर इस्तेमाल किया दवाओं राजा सऊद विश्वविद्यालय के एथिकल कमेटी द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं । सभी प्रयोगात्मक कार्य उचित प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया जाता है ।
1. सेल शीट निर्माण
- कोट संस्कृति व्यंजन (३.५-सेमी तापमान प्रतिक्रियाशील संस्कृति व्यंजन) पतला भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ और पकवान की सभी सतह को कवर करने के लिए सुनिश्चित करते हैं ।
नोट: यह चरण कक्ष पत्रक की टुकड़ी के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह किसी monolayer में कक्षों की वृद्धि का समर्थन करता है और कक्ष एकत्रीकरण को रोकता है । - 5% सह2 और ९५% हवा युक्त एक humidified वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए व्यंजन मशीन ।
- लेपित व्यंजन से अतिरिक्त FBS निकालें और व्यंजन कमरे के तापमान पर शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं (आरटी) कम से 1 एच के लिए ।
- तीन सेल सस्पेंशन तैयार करें: 1 x 106 HepG2 कोशिकाओं, BMMSCs के साथ 1 x 106 HepG2 कोशिकाओं, और UCMSCs के साथ 1 x 106 HepG2 कोशिकाओं (BMMSCs और UCMSCs दोनों के लिए 4:1 के अनुपात में) ।
- प्रत्येक लेबल डिश के लिए उपयुक्त सेल सस्पेंशन बीज ।
- DMEM संस्कृति माध्यम में सभी कोशिकाओं को निलंबित 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक ।
- एक humidified 5% सह2 और ९५% हवा युक्त वातावरण में ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
2. कक्ष शीट टुकड़ी
- १००% सेल संगम पर, पकवान ३७ डिग्री सेल्सियस से बाहर ले लो ।
- आरटी में 1 एच के लिए HepG2 सेल शीट पकवान, जबकि HepG2/BMMSC और HepG2/UCMSC के लिए सेल शीट व्यंजन मशीन 20 ° c पर 30-40 मिनट के लिए 5% कं2 और ९५% हवा युक्त वातावरण में ।
नोट: केवल HepG2 से बने कक्ष पत्रक नाजुक है; 20 डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम करने से चादर की संरचना के लिए नुकसान का कारण बनता है ।
3. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का प्रदर्शन
नोट: सेल शीट टुकड़ी के लिए मशीन समय के दौरान, पशु प्रक्रिया शुरू करते हैं ।
-
शल्य चिकित्सा क्षेत्र की तैयारी के लिए निर्देश
- एक डाकू, लामिना प्रवाह कैबिनेट, या एक अपूतित सर्जरी कक्ष के रूप में प्रयोगशाला के भीतर एक बाँझ अलग क्षेत्र में सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का संचालन । सुनिश्चित करें कि सर्जरी के क्षेत्र के सभी सतहों गैर असुरक्षित, सील, टिकाऊ, और साफ कर रहे हैं ।
- सफ़ाई, दस्ताने, facemasks, और सिर और जूता कवर सहित उचित सुरक्षात्मक गियर पहनें ।
- शल्य चिकित्सा उपकरण है कि साफ कर रहे है का प्रयोग करें (autoclavingके माध्यम से ; उच्च दबाव में संतृप्त स्टेम) सर्जरी की शुरुआत में ।
- चूहों के बीच दस्ताने बदलें ।
-
सर्जरी के लिए पशु की तैयारी
- 8-12 सप्ताह पुराने न्यूड चूहों का प्रयोग करें ।
- चूहों के लिए इंजेक्शन संज्ञाहरण बनाएँ ।
- संज्ञाहरण समाधान तैयार करने के लिए, ketamine-xylazine, मिश्रण 2 ketamine के मिलीलीटर, xylazine के 1 मिलीलीटर (20 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर), और बाँझ शारीरिक खारा के 1 मिलीलीटर (जैसे, ०.९% सोडियम क्लोराइड) एक बाँझ 10 मिलीलीटर सीरम संग्रह शीशी में और अच्छी तरह से हिला से पहले उपयोग.
- संज्ञाहरण लागू करने के लिए, चूहे intraperitoneally के शरीर के वजन के १०० ग्राम प्रति ketamine-xylazine समाधान के ०.२ मिलीलीटर सुई ।
नोट: समाधान की कुल खुराक है १०० मिलीग्राम/ketamine और xylazine के 10 मिलीग्राम/किलो ।
- शल्य साइट से दिखाई गंदगी/
- पैडल वापसी पलटा परीक्षण (दोनों हिंद पैर पर पैर पैड चुटकी) द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें ।
नोट: अगर पैर पैड चुटकी एक प्रतिक्रिया का कारण बनता है, ०.०५ मिलीलीटर की एक खुराक पर दोहराने/100 g (लगभग हर 30 मिनट), तो फिर संवेदनाहारी गहराई की जांच करें । - povidone-आयोडीन/isopropanol द्वारा एक दो चरण सफ़ाई के साथ सर्जरी क्षेत्र को संक्रमित ।
- चीरा के संक्रमण से बचने के लिए एक बाँझ कपड़ा के साथ चूहे को कवर.
- buprenorphine के साथ चमड़े के नीचे सुई (०.०१-०.०५ मिलीग्राम/किलोग्राम)8 पहले चीरा बनाने के लिए ।
- एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करना, एक 7 करने के लिए 10 सेमी की खाल और अंतर्निहित मांसपेशियों के बीच कटौती करने के लिए जिगर को बेनकाब.
- पेट की मांसपेशी को स्केलपेल के सपाट बैक एज के साथ त्वचा से अलग कर लें ।
- ध्यान से एक स्केलपेल का उपयोग कर लीनिया अल्बा छुरा और तेज कैंची के साथ कटौती का विस्तार ।
4. सेल शीट प्रत्यारोपण
नोट: सेल शीट प्रत्यारोपण जिगर पर किया जाता है ।
- कल्चरल डिश से सेल शीट लीजिए ।
- धीरे से अपनी सतह से चादर अलग करने के लिए बेंच पर संस्कृति पकवान नल ।
- एक आधा चक्र में चादर के किनारे स्क्रैप एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करके डिश की सतह से सेल शीट अलग.
- धीरे संस्कृति पकवान से पूरे माध्यम को हटा दें ।
- सुनिश्चित करें कि पत्रक किसी भी क्षति के बिना बरकरार है; अंयथा, इसका उपयोग नहीं किया जा सकता (चित्र 1) ।
नोट: परिणामस्वरूप चादरें सीधे आंख से पता लगाया जा सकता है ।
- पकवान से सेल शीट फसल के लिए एक बाँझ झिल्ली (फिल्टर कागज) तैयार करते हैं ।
- सबसे पहले, झिल्ली को सामान्य खारा से भिगो दें । फिर, एक बाँझ सूती पैड के साथ अतिरिक्त खारा निकालें ।
- कक्ष शीट पर गीली झिल्ली प्लेस, जबकि क्रीज और झिल्ली और सेल शीट के बीच हवा के बुलबुले से परहेज ।
- झिल्ली और सेल शीट पर सामांय खारा की कुछ बूंदें जोड़ें उंहें आसान इकट्ठा ।
नोट: कोशिका पत्रक को तोड़ने से बचने के लिए, कोल्ड खारा का उपयोग न करें और संदंश के साथ झिल्ली और कोशिका पत्रक को उठा लें . - यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिका पत्रक को झिल्ली से ठीक से संलग्न किया जाए, और फिर उसे इकट्ठा करने के लिए झिल्ली को कुछ सेकंड के लिए छोड़ दें.
- सेल शीट प्रत्यारोपण के लिए जिगर तैयार करते हैं ।
- सुनिश्चित करें कि जिगर की सतह धीरे से यह एक बाँझ सूती पैड के साथ दोहन से शुष्क है ।
- बाँझ संदंश का उपयोग करना, चूहे के जिगर की एक पालि पर कोशिका पत्रक के साथ झिल्ली जगह.
- बाँझ खारा की कुछ बूँदें जोड़ें और यह से सेल शीट अलग करने के लिए झिल्ली के लिए एक कोमल दबाव लागू होते हैं ।
- ध्यान से झिल्ली हटाने से पहले 5 मिनट के लिए रुको ।
नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है सेल शीट ठीक से जिगर से जुड़ा हुआ है । - अंत में, 5-0 नायलॉन टांके के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों और त्वचा चीरा बंद करें ।
- povidone-आयोडीन के साथ सर्जरी क्षेत्र को संक्रमित ।
नोट: चित्रा 2 एक नंगा चूहा के जिगर पर सेल शीट प्रत्यारोपण प्रक्रिया के एक चित्र से पता चलता है ।
5. सर्जरी के बाद देखभाल
- सर्जरी के तुरंत बाद, एक चूहे के घर व्यक्तिगत रूप से नरभक्षी या घुटन से बचने के लिए, और यह नियमित रूप से निगरानी (हर 15 मिनट) जब तक यह होश में है और पूरी तरह से ambulant ।
- फिर, 5-14 d के लिए दैनिक चूहों का आकलन करें, कम से 5 d पोस्ट-ऑपरेटिव, यह सुनिश्चित करने के लिए कि वहाँ कोई जटिलताओं हैं. दैनिक मूल्यांकन के दौरान, निंनलिखित के बारे में सुनिश्चित करें ।
- घाव बंद हो जाता है, और टांके बरकरार हैं, बिना जरूरत से ज्यादा तंग किया जा रहा है ।
- चीरा साइट में संक्रमण के कोई संकेत नहीं हैं, जैसे गर्मी, अत्यधिक सूजन, या पीप निर्वहन ।
- इस तरह के भोजन और पानी की खपत में कमी, वजन घटाने, निर्जलीकरण, त्वचा टेंट, या तेजी से और खुले मुंह सांस लेने के रूप में दर्द से जुड़े कोई संकेत नहीं हैं । गंभीर के बाद सर्जरी के दर्द को नियंत्रित करने के लिए, यदि कोई हो, buprenorphine के साथ चमड़े के नीचे सुई (०.०१-०.०५ मिलीग्राम/किग्रा) हर 6-8 एच9 की एक ंयूनतम के लिए ४८-७२ h पश्चात ।
6. प्रत्यारोपण क्षेत्र का विश्लेषण
- रोपाई के एक माह बाद ही चूहा scarifice और ऊतकवैज्ञानिक व immunohistochemical विश्लेषण के लिए रोपाई क्षेत्र में इकट्ठा हो जाता है ।
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Representative Results
चूहों में प्रत्यारोपित कोशिका पत्रकों की Tumorigenicity:
प्रत्यारोपण के बाद एक महीने, चूहों के जिगर में सभी प्रत्यारोपित सेल शीट्स ट्यूमर (चित्रा 3) विकसित किया है । HepG2, HepG2/BMMSC, और HepG2/UCMSC सेल शीट से विकसित ट्यूमर का औसत आकार ४.५ सेमी, 4 सेमी, और २.५ सेमी, क्रमशः10थे ।
जिगर के ऊतकों के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण:
Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) गैर प्रत्यारोपण चूहों के दाग प्लेटों में व्यवस्था की हेपैटोसाइट्स के साथ जिगर दिखाया है कि एक दूसरे के साथ anastomose, और नाभिक दौर थे, एक या दो प्रमुख nucleoli के साथ । इसके विपरीत, ट्यूमर वर्गों एकत्र व्यावहारिक सूजन और गल चमड़े के नीचे हेपैटोसाइट्स के किनारों दिखाया, अनियमित परमाणु आकृति और स्पष्ट अध (4 चित्रा) के साथ ।
चित्रा 1: एक सेल शीट का निर्माण एक ३.५-मुख्यमंत्री तापमान प्रतिक्रियाशील संस्कृति पकवान का उपयोग कर । (क) इस पैनल के एक क्षतिग्रस्त सेल शीट प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं दिखाता है । (ख) यह पैनल एक बरकरार सेल शीट से पता चलता है, प्रत्यारोपण के लिए तैयार है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : नंगा चूहों में सेल शीट प्रत्यारोपण प्रक्रिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : एक चूहे के जिगर पर विकसित ट्यूमर सेल शीट प्रत्यारोपण के एक महीने के बाद । ट्यूमर (a) एक HepG2 कक्ष पत्रक (आकार: ४.५ सेमी), (B) एक HepG2 और BMMSC कक्ष पत्रक (आकार: 4 सेमी), और (C) एक HepG2 और UCMSC कक्ष पत्रक (आकार: २.५ सेमी) से उत्पन्न किया गया था । नीले हलकों ट्यूमर क्षेत्र दिखा । यह आंकड़ा पहले से प्रकाशित काम10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : एक चूहे के जिगर का ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण । एच एंड ई एक चूहे के जिगर के दाग, चार सप्ताह के सेल शीट प्रत्यारोपण के बाद । (क) यह पैनल सामान्य चूहे जिगर की कोशिकाओं को दिखाता है. (ख) इस पैनल के कैंसर की कोशिकाओं प्रत्यारोपण के बाद जिगर आकृति विज्ञान से पता चलता है । काला तीर यकृत कैंसर इंगित करता है, हरे तीर सामान्य हेपैटोसाइट्स इंगित करता है, नीला तीर सूजन कोशिकाओं को इंगित करता है, और नारंगी तीर HCC कोशिकाओं को इंगित करता है । स्केल पट्टियां 20X आवर्धन इंगित करती हैं । यह आंकड़ा पहले से प्रकाशित काम10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
अनुसंधान की एक व्यापक राशि है कि मानव कैंसर जैसा दिखता है vivo में एक पर्याप्त नैदानिक पशु मॉडल विकसित करने के लिए समर्पित है । वर्तमान में, प्रमुख कैंसर पशु मॉडल बनाने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण आनुवंशिक इंजीनियरिंग और कोशिका प्रत्यारोपण11शामिल हैं । आनुवंशिक रूप से संशोधित पशु मॉडल पहचान और लक्ष्य जीन की मांयता के लिए अच्छा उपकरण हैं, साथ ही साथ आणविक तंत्र दवा प्रेरित विषाक्तता को समझने । हालांकि, यह मॉडल कुछ सीमाओं के साथ संबद्ध है; उदाहरण के लिए, एक दिए गए जीन के संशोधन प्रत्याशित phenotype12में हमेशा परिणाम नहीं है । कोशिका प्रत्यारोपण दृष्टिकोण और अधिक सामांयतः पशुओं में कैंसर पैदा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह कैंसर सेल निलंबन के इंजेक्शन शामिल है । फिर भी, इस सरल और सुविधाजनक दृष्टिकोण अपने स्वयं के नुकसान है । एक सेल निलंबन उत्पंन करने के लिए, एक एंजाइमी पाचन कदम कैंसर कोशिकाओं फसल के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । यह कुछ आसंजन प्रोटीन के नुकसान में परिणाम है, जो प्रत्यारोपण कोशिकाओं की engraftment दक्षता कम हो जाएगा । इसलिए, वहाँ कोई गारंटी नहीं है कि प्रत्यारोपित कैंसर कोशिकाओं कैंसर ऊतक फार्म, प्रेरित ट्यूमर के आकार को नियंत्रित करने की कठिनाई का उल्लेख नहीं होगा । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण एक और गंभीर खामी है, जो रक्त परिसंचरण या कोशिका engraftment में गैर-लक्षित अंगों में प्रत्यारोपित कैंसर कोशिकाओं के तेजी से संक्रमण है13।
इन वंचितों को दूर करने के लिए उपन्यास सेल शीट तकनीक विकसित की गई । सुजुकी एट अल. 14 सफलतापूर्वक बृहदांत्र, जिगर, और अग्ंयाशय ट्यूमर असर जानवरों कैंसर कोशिका शीट प्रत्यारोपण विधि का उपयोग कर बनाया है । जब कैंसर कोशिका प्रत्यारोपण विधि के माध्यम से उत्पन्न ट्यूमर के साथ तुलना में, इन ट्यूमर बड़ा और अधिक स्थिर थे. एक जानवर में एक छोटे ट्यूमर ऊतक के आरोपण एक ट्यूमर को प्रेरित करने के लिए एक प्रत्यारोपण विधि है कि एक एंजाइमी पाचन कदम की आवश्यकता नहीं है के उपयोग पर अत्यधिक निर्भर है । Proteolytic एंजाइमों extracellular मैट्रिक्स को नुकसान का कारण है, जो सेल के लिए सेल संपर्क को प्रभावित करता है । सेल शीट प्रौद्योगिकी एक इनवेसिव कटाई विधि का उपयोग कर की इस सीमा पर काबू पाता है, एक बरकरार monolayer सेल शीट के संग्रह की अनुमति है, इसके साथ जुड़े extracellular मैट्रिक्स और विकास कारकों15के साथ । सेल शीट प्रौद्योगिकी भी लंबी अवधि engraftment16,17के लिए अनुमति देता है । इस में महान मूल्य की है vivo अध्ययन, जहां कोशिकाओं को ऊतक के जीवन की पूरी अवधि के लिए17मेजबान के ऊतकों में engraft करने में सक्षम होना चाहिए । इसके अलावा, इस तकनीक biodegradable पाड़ों3,15के उपयोग के बिना, ऊतक इंजीनियरिंग के एक उपंयास विधि के विकास के लिए सक्षम होना चाहिए । अभी तक, इस दृष्टिकोण अभी भी कुछ सीमाएं हैं । जब सेल शीट तकनीक का उपयोग कर, भ्रष्टाचारी ऊतक के केंद्रीय भाग संभवतः अगर भ्रष्टाचार बहुत बड़ा है गल हो सकता है । इसके विपरीत यदि भ्रष्टाचार बहुत छोटा है तो प्रत्यारोपण की सफलता का मौका कम किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, ट्यूमर के बाद के विकास को नियंत्रित करने के लिए, प्रत्यारोपित ऊतक का आकार सभी प्रयोगों में एक समान होना चाहिए । प्रत्यारोपण ऊतक के आकार गरीब ऑक्सीजन पर्यावरण18के कारण परिगलन की प्रेरण का एक परिणाम के रूप में 2 मिमी3 तक ही सीमित है ।
इस अध्ययन में, एक HCC पशु मॉडल सफलतापूर्वक सेल शीट के पाड़ मुक्त प्रत्यारोपण का उपयोग कर बनाया गया था । सेल शीट के तीन प्रकार के चूहों के जिगर में प्रत्यारोपण किया गया: HCC सेल लाइन कोशिकाओं का एक सेल शीट, HCC सेल लाइन कोशिकाओं और BMSCs के एक सेल शीट, और HCC सेल लाइन कोशिकाओं और UCMSCs के एक सेल शीट । सभी तीन सेल शीट के प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता चूहों में ट्यूमर पैदा करने के लिए पर्याप्त था । हालांकि, यह नोट किया गया था कि पत्रक को जोड़ने MSCs गठन ट्यूमर का आकार कम कर दिया । यह इंगित करता है कि MSCs इस्तेमाल किया, विशेष रूप से UCMSCs, ट्यूमर के विकास पर एक प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है । समाप्त करने के लिए, कैंसर सेल शीट ट्रांसप्लांटेशन ठोस ट्यूमर के साथ एक पशु मॉडल बनाने के लिए एक कुशल विधि प्रदान करता है । ऐसे vivo मॉडल में महत्वपूर्ण नैदानिक जानकारी में काफी अनुप्रयोगों के साथ परिणाम सकता है । इसके अलावा, के रूप में ट्यूमर के आकार में कमी से स्पष्ट, UCMSCs सीमा ट्यूमर के विकास और प्रचार । यह इंगित करता है कि कुछ MSC उपप्रकार एक कोशिका में इस्तेमाल किया जा सकता है कैंसर के उपचार के लिए आधारित दृष्टिकोण ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक अपने सहयोग और समर्थन के लिए कॉलेज ऑफ मेडिसिन, किंग सऊद विश्वविद्यालय में प्रायोगिक सर्जरी और पशु प्रयोगशाला के कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं-खासकर हुसैन Almukhayzim और हिशाम Aloudah । लेखक भी दृश्य सामग्री-खासकर Muath बिन Ghannam और Abdulwahab Alsulami तैयार करने के लिए राजा सऊद बिन अब्दुल अजीज विश्वविद्यालय में मीडिया टीम को स्वीकार करना चाहूंगा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river |
References
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