Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Rosi Fassler; Nufar Edinger; Oded Rimon; Dana Reichmann

doi:10.3791/57806

Methodenartikel

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

DOI:

10.3791/57806

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7. Juni 2018

Rosi Fassler^*¹ , Nufar Edinger^*¹ , Oded Rimon¹ , Dana Reichmann¹

¹Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eines der schwierigsten Stressbedingungen, die Organismen im Laufe ihres Lebens zu begegnen bedeutet die Anhäufung von Oxidantien. Bei oxidativem Stress Zellen auf Molekulare Chaperone angewiesen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zu untersuchen, die Redox-regulierte Anti-Aggregation Tätigkeit, als auch strukturelle Veränderungen, die EZB der Chaperon-Funktion mit HDX-MS zu überwachen.

Zusammenfassung

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Lebenden Organismen müssen regelmäßig mit wechselnden Umgebungen während ihres gesamten Lebenszyklus, einschließlich Änderungen der Temperatur, pH-Wert und die Anhäufung von reaktiven Sauerstoffspezies zu bewältigen. Diese Schwankungen können führen zu einem weit verbreiteten Protein entfaltet, Aggregation und Zelltod. Daher haben Zellen ein dynamisches und Stress-spezifische Netzwerk von molekularen Chaperone entwickelt, die eine "gesunde" Proteom während Stress-Bedingungen zu gewährleisten. ATP-unabhängige Chaperone bilden eine große Klasse von molekularen Chaperone, die als erste Verteidigungslinie Moleküle, Schutz gegen Proteinaggregation in einer Stress-abhängigen Weise dienen. Eine Eigenschaft, die diese Chaperone gemeinsam haben ist ihre Fähigkeit, Strukturelle Plastizität für ihre Stress-spezifische Aktivierung, die Anerkennung und die Freisetzung von fehlgefaltete Client zu nutzen.

In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die funktionelle und strukturelle Analyse von einem solchen intrinsisch ungeordneten Chaperon, die bakterielle Redox-regulierten Hsp33, die Proteine gegen Aggregation bei oxidativem Stress schützt. Hier präsentieren wir Ihnen ein Instrumentarium der verschiedenen Techniken für die Untersuchung von Redox-regulierten Chaperon Aktivität sowie für die Zuordnung von Konformationsänderungen das Chaperon seine Tätigkeit zugrunde liegt. Im einzelnen beschreiben wir einen Workflow umfasst die Vorbereitung der vollständig reduziert und vollständig oxidierten Proteine, gefolgt von einer Analyse des Chaperon Anti-Aggregation Aktivität in Vitro mit lichtstreuenden, mit Schwerpunkt auf den Grad der die Anti-Aggregation-Aktivität und die Kinetik. Um häufige Ausreißer während der Aggregation Assays zu überwinden, beschreiben wir die Verwendung von Kfits, ein neuartiges grafisches Tool die einfache Verarbeitung der kinetische Messungen ermöglicht. Dieses Tool kann leicht auf andere Arten von kinetische Messungen zum Entfernen von Ausreißern und Montage kinetische Parameter angewendet werden. Um die Funktion mit der Proteinstruktur korrelieren, beschreiben wir die Einrichtung und den Workflow einer strukturellen Massenspektrometrie-Technik, Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie, die die Zuordnung von Konformationsänderungen auf das Chaperon ermöglicht und Substrat in verschiedenen Phasen der Hsp33 Aktivität. Dieselbe Methode kann auf andere Protein-Protein und Protein-Ligand-Interaktionen angewendet werden.

Einleitung

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Zellen haben häufig eine Ansammlung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) produziert als Nebenprodukte der Atmung¹^,², Protein und Lipid Oxidation³^,⁴und zusatzprozesse⁵^, ⁶^,⁷. Trotz ROS positive Rolle im vielfältigen biologischen Prozessen wie Mobilfunk Signalisierung⁸^,⁹ und Immunantwort¹⁰auftreten ein Ungleichgewicht zwischen ROS-Produktion und die Entgiftung, führen zu oxidativ....

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Protokoll

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1. Vorbereitung von vollständig reduziert und vollständig oxidierten Proteinen

Vorbereitung eines vollständig reduzierte Proteins
Hinweis: Hier beschreiben wir die Reduzierung eines Zink-haltige Protein und eine ZnCl₂ Lösung um den Zn eingearbeitet, reduzierte Protein Zustand wiederherzustellen. Die ZnCl-₂ -Lösung kann ersetzt oder verworfen werden. Beachten Sie, dass die Zeit und Temperatur des Reduktionsprozesses hängt die proteinstabilität und Funktion und ist somit spezifisch pro Protein.
1. Die Protein-Probe auf dem Eis Auftauen und bis zu entfernen Aggregate zu spinnen. Inkubation die Probe mindestens 1,5....

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Ergebnisse

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Die zwei vorgestellten Methoden ermöglichen es, die kinetische Aktivität und Dynamik von Protein-Interaktionen zwischen einem Chaperon und seinem Substrat zu folgen. Darüber hinaus ermöglicht die Reduzierung-Oxidation-Protokoll die Zubereitung vollständig reduziert und vollständig oxidierten Chaperon, geben ein vertieftes Verständnis des Aktivierungsmechanismus der ungeordneten Chaperone Redox-abhängige.

Erstens haben wir Lichts.......

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Diskussion

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In diesem Papier stellten wir Protokolle für die Analyse der Redox-abhängige Chaperone Aktivität und die Charakterisierung von strukturellen Veränderungen auf die Bindung eines Client-Proteins. Dies sind komplementäre Methoden, um potenzielle Chaperon-Substrat-komplexen zu definieren und analysieren mögliche Standorte werden Interaktion.

Hier haben wir diese Protokolle für die Charakterisierung eines Komplexes zwischen der Redox-regulierten Chaperon Hsp33 mit einem gut untersuchte Chaperon Sub.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Autoren sind dankbar, dass Meytal Radzinski für ihre hilfreichen Diskussionen und kritische Lektüre des Artikels, und Patrick Griffin und seine Labor-Mitgliedern für ihre uneingeschränkte Unterstützung beim Aufbau der HDX-Analyse-Plattform. Die Autoren sind dankbar, dass der Deutsch-Israel Foundation (I-2332-1149.9/2012), der binationale Science Foundation (2015056), Marie-Curie-Integration Grant (618806), der Israel Science Foundation (1765/13 und 2629/16), und das Human Frontier Science Programm (CDA00064/2014) für ihre finanzielle Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chemicals, Reagents
Acetonitril HPLC plus	Sigma Aldrich	34998-2.5L	Lösungsmittel
Ameisensäure Optima LC/MS	Fisher Chemicals	A117-50	Lösungsmittel
Isopropylalkohol, HPLC-Qualität	Fisher Chemicals	P750717	Lösungsmittel
Methanol	Fisher Chemicals	A456-212	Lösungsmittel
Tris(hydroxymethyl)aminomethan	Sigma Aldrich	252859	Puffer
Trifluoressigsäure	Sigma Aldrich	76-05-1	Lösungsmittel
Wasser für HPLC	Sigma Aldrich	270733-2.5L-M	Lösungsmittel
ZnCl2, Zinkchlorid	Merck	B0755416 308	Reagenz
DTT	goldbio	27565-41-9	Reduktionsmittel
PD Mini Trap G-25 Säulen GE Healthcare	GE Healthcare	29-9180-07	Entsalzungssäule
Kaliumphosphat	United States Biochemical Corporation	20274
Puffer Wasserstoffperoxid 30%	Merck	K46809910526	Oxidationsmittel
Citrat Synthase	Sigma Aldrich	C3260	Substrat
HEPES säurefreies	Sigma aldrich	7365-45-9	Puffer
Gndcl	sigma aldrich	G3272-500G	Vergällungsmittel
Deuteriumchlorid Lösung	sigma aldrich	543047-10G	Puffer
Deuteriumoxid 99%	sigma aldrich	151882-100G	Lösungsmittel
TCEP	bioworld	42000058-2	Reduktionsmittel
150uL Micro-Insert mit Dorninnenseite & Polymerfüße, 29*5mm	La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1,5 mL durchsichtiges Kurzgewindefläschchen 9 mm Gewinde, 11,6 * 32 mm	La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
Quarzküvette	Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorostrometer	Jasco
Thermomixer Comfort	Eppendorf	13058/0
Heraeus Megafuge 16R, Tischzentrifuge	Thermo Scientific
pH-Messgerät, PB-11 sartorius	Sartorius	13119/0
AffiPro Immobilisierte Pepsinsäule (20mm Länge, 2,0mm Durchmesser).	AffiPro
Waters Vorsäule (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1,7um, 2,1mmx5mm)	Waters
C18 analytische Säule (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Säule, 130 Å, 1,7um, 2,1mmx50mm)
Anaerobe Vinylkammer mit Luftschleusentür	COY
Q-exactive-orbitrap Massenspektrometer	Thermo-Fischer Scientific
PAL-System LHX - Robotersystem für die Handhabung von HDX-Proben	PAL-System	https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS-Pumpe	Thermo Scientific
Dionex AXP-MS Zusatzpumpe	Thermo Scientific<
strong>Software, Software Tools, Datenbanksuche
Kfits: Aggregation von Daten	anpassen http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur-Software	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)	https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos Software (Axel Semrau)	http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 Software	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX Workbench Software	http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

Referenzen

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Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. <....

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Chaperon Aktivit t von Hsp33 Lichtstreuungs Assay Kfits Analyse Citrat Synthase Aggregation oxidative Stressbedingungen proteinf rmige Konformations nderungen Massenspektrometrie Setup Anti Aggregations Aktivit t

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