Methodenartikel

Co-Immunopräzipitation Assay mit endogenen nuklearen Proteinen aus Zellen kultiviert unter hypoxischen Bedingungen

DOI:

10.3791/57836

⸱

2. August 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir ein co-Immunopräzipitation-Protokoll, um Protein-Protein-Interaktionen zwischen endogenen nuklearen Proteine unter hypoxischen Bedingungen zu studieren. Diese Methode eignet sich zur Demonstration der Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulierungsbehörden auf Hypoxie.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedrige Sauerstoffsättigung (Hypoxie) lösen eine Vielzahl von adaptive Reaktionen mit Hypoxie-induzierbaren Faktors Komplex als ein master Regler 1 (HIF-1). HIF-1 besteht aus einem heterodimerisierenden Sauerstoff reguliert α Untereinheit (HIF-1α) und konstitutiv ausgedrückt β-Untereinheit (HIF-1β) auch bekannt als Aryl Hydrocarbon-Rezeptor nuklearen Nyrianer (ARNT), Regulierung von Genen, die in unterschiedlichen Prozessen einschließlich Angiogenese , Erythropoese und Glykolyse. Die Identifizierung von HIF-1 interagierenden Proteine ist Schlüssel zum Verständnis der Hypoxie Signalweg. Neben der Regelung von HIF-1α Stabilität löst Hypoxie auch die nukleare Translokation von vielen Transkriptionsfaktoren einschließlich HIF-1α und ARNT. Bemerkenswert ist, basieren die meisten aktuellen Methoden zur Untersuchung solcher Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) auf Systemen, wo proteingehalte durch Protein-Überexpression künstlich erhöht werden. Protein-Überexpression oft führt zu unphysiologischen Ergebnisse aus zeitlichen und räumlichen Artefakte. Hier beschreiben wir eine modifizierte co-Immunopräzipitation Protokoll nach Hypoxie Behandlung mit endogenen nuklearen Proteine und als ein Proof of Concept, das Zusammenspiel von HIF-1α und ARNT zu zeigen. In diesem Protokoll die hypoxischen Zellen unter hypoxischen Bedingungen geerntet wurden und die Dulbecco Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) Waschpuffer war auch vorab äquilibriert hypoxischen Bedingungen vor der Benutzung zum Proteinabbau oder Proteinkomplex mindern Dissoziation in flussbettfilters. Darüber hinaus waren die nuklearen Fraktionen anschließend extrahiert, um konzentrieren und endogenen nuklearen Proteine stabilisieren und vermeiden mögliche falsche Ergebnisse oft während Protein Überexpression gesehen. Dieses Protokoll kann zur endogene und native Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulierungsbehörden unter hypoxischen Bedingungen zu demonstrieren.

Einleitung

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Hypoxie tritt auf, wenn die Zellen und Geweben des Körpers nicht ausreichend Sauerstoff zugeführt wird. Es spielt eine entscheidende Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen wie stammzelldifferenzierung, Entzündungen und Krebs1,2. Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) fungieren als Heterodimere bestehend aus einem Sauerstoff-regulierten α-Untereinheit und einer konstitutiv exprimierten β-Untereinheit auch bekannt als ARNT3. Bis heute wurden drei Isoformen von HIF-α-Untereinheiten (HIF-1α, HIF-2α und HIF-3α) und drei HIF-β-Untereinheiten (ARNT/HIF-1β, ARNT2 und ARNT3) identifiziert. HIF-1α und ARNT sind ubiquitär ausgedrückt, während HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 und ARNT3 mehr Ausdruck Muster4eingeschränkt haben. Die HIF-1-Protein-Komplex ist der zentrale Regler der Hypoxie Antwort. Unter hypoxischen Bedingungen HIF-1α stabilisiert wird, dann translocates in den Zellkern und dimerizes mit ARNT5. Anschließend dieser Komplex bindet an spezifische Nukleotide bekannt als Hypoxie reagiert Elemente (HREs) und den Ausdruck der Zielgene in vielfältigen Prozesse einschließlich der Angiogenese, Erythropoese und Glykolyse6regelt. Neben dieser "kanonisch" Reaktion, die Hypoxie-Signalweg ist auch bekannt, Übersprechen mit mehreren zelluläre Reaktion Signalwege wie Notch und Nuclear Factor-Kappa B (NF-κB)7,8,9.

Die Identifizierung von interagierenden Proteine Roman HIF-1 ist wichtig für ein besseres Verständnis für die Hypoxie Signalweg. Im Gegensatz zu ARNT, ist unempfindlich gegenüber Sauerstoff-Niveaus und konstitutiv exprimierten sind HIF-1α proteingehalte zellulären Sauerstoff-Niveaus fest geregelt. Bei normoxiezustand (21 % Sauerstoff) sind Proteine, HIF-1α stark degradierten10,11. Die kurze Halbwertszeit von HIF-1α am normoxiezustand präsentiert spezielle technische Herausforderungen für die Erkennung des Proteins aus Zelle Extrakten sowie für die Identifizierung von HIF-1α-wechselwirkenden Proteinen. Darüber hinaus translozieren mehrere Transkriptionsfaktoren, einschließlich derjenigen der HIF-1-Komplex in den Zellkern unter hypoxischen Bedingungen12,13,14. Die meisten der aktuellen Methoden für die PPI-Studien werden mit unphysiologischen Überexpression von Proteinen durchgeführt. Diese Protein-Überexpression wurde berichtet, zu verschiedenen zellulären defekten durch mehrere Mechanismen, einschließlich des Ressource-Überladung, stöchiometrischen Ungleichgewicht und promiscuous Interaktionen Weg Modulation15,16. In Bezug auf PPI Studien kann Protein Überexpression zu falsch positive oder sogar falsch Negative Ergebnisse je nach Protein Eigenschaften und der Funktionsweise der überexprimieren Proteine führen. Die aktuellen Methoden zur PPI Studien müssen daher geändert werden, um die physiologisch relevanten ppi unter hypoxischen Bedingungen zu offenbaren. Zuvor haben wir bewiesen, dass die Interaktion zwischen HIF-1 und Ets Familie Transkriptionsfaktors GA-bindeprotein (GABP) in hypoxischen P19 Zellen, die für die Reaktion des Hes1 -Promotors auf Hypoxie17beiträgt. Hier beschreiben wir ein co-Immunopräzipitation Protokoll zur ppi zwischen endogenen nuklearen Proteine unter hypoxischen Bedingungen zu studieren. Das Zusammenspiel von HIF-1α und ARNT erscheint als ein Proof of Concept. Dieses Protokoll eignet sich für den Nachweis der Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulatoren unter hypoxischen Bedingungen, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Identifizierung von HIF-1 interagierenden Proteine.

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Protokoll

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In diesem Protokoll Abschnitt, die menschliche embryonale Nieren 293A verwendet (HEK293A) Zelle s erfolgt nach den Richtlinien der Humanforschung Ethikkommission in Nanyang Technological University, Singapore.

1. Induktion von Hypoxie in HEK293A Zellen

  1. Bereiten Sie vier 10 cm Gerichte und Samen 3 – 5 x 106 HEK293A Zellen pro Schale in 10 mL Dulbeccos geändert Adlers Medium (DMEM, 4,5 g/L Glukose) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 110 mg/L Natrium Pyruvat, 100 U/mL Penicillin und 100 mg / mL Streptomycin. Kultur der Zellen in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator.
    Hinweis: Zelle Aussaat sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) durchgeführt werden. Die Oberflächen aller Materialien in der BSC platziert werden sollte mit 70 % Ethanol abgerieben werden.
  2. 24 h nach der Aussaat, wenn die Zellen 80 – 90 % Konfluenz erreicht haben setzen zwei Gerichte in der Hypoxie-Subchamber in den Inkubator Glovebox (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 % O2 und 5 % CO2 bei 37 ° C und halten Sie die anderen beiden Gerichte auf normoxiezustand (21 % O 2, 5 % CO2 bei 37 ° C) für 4 Std. verwenden Sie eine Reihe von Inklusieve und hypoxische Zellen zu bewerten die Hypoxie-Behandlung von western-Blot und die andere Gruppe von Zellen für die co-Immunopräzipitation Experimente zu nutzen.
    Hinweis: Der Sauerstoffgehalt ist einstellbar auf 0 – 5 % und die Dauer der Behandlung Hypoxie kann variiert werden, je nach Zelltyp und Ziel zu studieren.

(2) die ganze Zelle und nukleare Extraktion

Hinweis: Informationen finden Sie unter Tabelle 1 auf Puffer, die in diesem Protokoll verwendeten.

  1. Die normoxiezustand Kontrollzellen zu ernten.
    1. Entfernen Sie die Kultur-Medien durch Absaugen und spülen Sie die Zellen mit 10 mL DPBS (PH 7,0 – 7,2) mit einer 10 mL-Pipette.
      Hinweis: Berühren Sie nicht die Zelle monomolekularen Film mit der Pipette. Während des Waschens pipette vorsichtig die DPBS die Mauer der Zellplatte Kultur um Zellverlust zu vermeiden.
    2. 5 mL Pipette eiskalte DPBS in die Platte und die Zellen von der Oberfläche der Platte in eiskaltem PBS mit einer Zelle Spachtel zu kratzen.
    3. Übertragen Sie die Zellsuspension in 15 mL konische Röhrchen und halten Sie auf dem Eis.
  2. Ernten Sie die Zellen unter hypoxischen Bedingungen kultiviert.
    1. Pre-equilibrate des DPBS hypoxischen Bedingungen durch die Platzierung eines ungedeckten 100 mL Experiment Reagenz Glasflasche gefüllt mit DPBS in der Hypoxie-Subchamber (1 % O2 und 5 % CO2 bei 37 ° C) für 24 h im voraus.
    2. Ca. 1 h vor der Ernte der Zellen Hypoxie behandelt, legen Sie eine Eisbox mit Eis in der Prozesskammer das Handschuhfach, die 1 % O2 und 5 % CO2equilibriert worden. Übertragen Sie die Flasche mit Pre äquilibriert hypoxischen DPBS aus der Hypoxie-Subchamber in der Prozesskammer und auf Eis legen.
    3. 4 h nach der Behandlung der Hypoxie, übertragen die Zellen von Hypoxie-Subchamber auf die Prozesskammer, die vorab äquilibriert, 1 % O2 und 5 % CO2wurde.
    4. Entfernen Sie die Nährmedien durch Absaugen und spülen Sie die Zellen, einmal mit 10 mL eiskaltes Pre äquilibriert hypoxischen DPBS mit 10 mL pipette.
    5. Fügen Sie 5 mL eiskaltes Pre äquilibriert DPBS mit 5 mL pipette und verdrängen die Zellen durch kratzen mit einem Schaber Zelle hinzu.
    6. Kippen Sie der Zellplatte Kultur und sammeln Sie die freistehenden Zellen mit einer 10 mL-Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension in DPBS in 15 mL konische Röhrchen und halten Sie auf dem Eis.
    7. Öffnen Sie die Tür zwischen den Verarbeitungs- und Puffer Kammern der Glovebox, die beide Pre äquilibriert, 1 % O2 und 5 % CO2gewesen sein. Übertragen Sie die 15 mL konische Röhrchen auf Eis mit Hypoxie behandelt Zellen aus der Verarbeitung-Kammer, die Sperrkammer. Öffnen Sie die Tür der Pufferkammer und entfernen Sie die Zellen vollständig aus dem Handschuhfach.
  3. Pellet-sowohl die Inklusieve Zellen von 2.1 und die hypoxischen Zellen von 2.2 durch Zentrifugation bei 1.000 X g für 5 min bei 4 ° C.
  4. Bereiten Sie die ganze Zelle Extrakten.
    1. Die Zelle Pellets in 500 µL eiskalte Radio Immunopräzipitation (RIPA) Lyse testpuffer mit 50 mM Trisaminomethane-Hydrochlorid (Tris-HCl) pH 8.0, 150 mM Natriumchlorid (NaCl), 1 % Tergitol-Typ NP-40 (NP-40), 0,5 % Natrium Deoxycholate, aufschwemmen und 0,1 % Natrium Dodecyl Sulfat (SDS), ergänzt mit 1 x cocktail Protease-Hemmer (siehe Tabelle der Materialien) durch die Zelle Pellets nach oben und unten mehrmals pipettieren.
    2. Übertragen Sie die Zelle Lysates in neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie für 30 min mit gelegentlichen Vortexen auf Eis.
    3. Zentrifugieren Sie die Zelle Lysates 13.000 x g für 10 min bei 4 ° C.
    4. Der Überstand, aliquoten 50 µL des Überstands in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und speichern bei-80 ° C.
  5. Bereiten Sie die nukleare Extrakte mit einer nuklearen Extraktion kit (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Sanft Aufschwemmen der Zelle Pellets in 500 µL Lyse Puffer NL mit 1 x cocktail-Proteasehemmer und 0,1 M Dithiothreitol (DTT) ergänzt durch die Zelle Pellets nach oben und unten mehrmals pipettieren.
    2. 25 µL der Reinigungslösung NP hinzu kommen die Zellsuspension und Wirbel für 10 s mit maximaler Geschwindigkeit.
    3. Zentrifuge bei 10.000 X g für 5 min bei 4 ° C.
    4. Den überstand (zytoplasmatischen Auszüge), aliquoten 50 µL des Überstands in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, erheben und speichern bei-80 ° C.
    5. Aufschwemmen der Pellet mit Zellkerne in 500 µL Lyse Puffer NL ergänzt mit 1 x cocktail-Proteasehemmer und 0,1 M DTT durch Vortexen für 5 s mit maximaler Geschwindigkeit.
    6. Zentrifugieren bei 10.000 X g für 5 min bei 4 ° C, und speichern Sie die nukleare Pellet.
    7. Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 50 µL Extraktion Puffer NX1 mit 1 x Proteaseinhibitor cocktail durch pipettieren die Kugel nach oben und unten mehrmals ergänzt.
    8. Inkubation für 30 min auf Eis, Vortexen für 10 s alle 5 min. bei maximaler Geschwindigkeit.
    9. Zentrifuge bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C.
  6. Entsalzen Sie die nukleare Extrakte.
    1. Sammeln des Überstands Schritt 2.5.9 und Transfer in die Mini-Dialyse-Geräte mit einem maximalen Volumen von 100 µL pro Einheit.
    2. Verschließe die Mini Dialysegeräten und legen Sie sie in eine Schwimmhilfe.
    3. Legen Sie die Schwimmhilfe in einen Becher mit 500 mL vorgekühlt Dialyse-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 % Glycerin, 100 mM Kaliumchlorid (KCl), 0,2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 0,2 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) und 0,5 mM DVB-t) und 30 min bei 4 ° C unter schonenden rühren inkubieren.
      Achtung: PMSF ist gefährlich. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit Haut oder Inhalation.
    4. Die Proben aus der Ecke von der Mini-Dialysegeräten zu sammeln und übertragen in neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
    5. Zentrifugieren bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C, aliquoten 25 µL jeder überstand zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und bei-80 ° c Lagern

3. Bewertung der Hypoxie Behandlung durch Erkennung der Proteinexpression und subzelluläre Lokalisation der HIF-1α

  1. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins die ganze Zelle oder eines nuklearen/zytoplasmatischen Extrakte mit Mikrotestplatte Assay eine Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay Kit nach Herstellerangaben Anweisungen18.
  2. Verdünnen Sie die Zelle Lysates in 1 X Laemmli Probenpuffer mit 5 % 2-Mercaptoethanol und bei 95 ° C für 5 min kochen.
    Achtung: Berühren Sie nicht die Oberfläche der Heizblock, da dies zu Verbrennungen führen kann.
  3. Trennen Sie die Proteine durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE).
    1. Laden Sie gleiche Mengen von Protein (25 µg) in jede Vertiefung eine SDS-PAGE Fertigteile gradient Gele (4 – 20 %), zusammen mit 3 µL des Markers Molekulargewicht.
    2. Führen Sie das Gel im laufenden Puffer mit 2,5 mM Tris, 19,2 mM Glycin, 0,01 % SDS, PH8.3 für 30 min bei 200 V.
  4. Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf die Nitrozellulose-Membran.
    1. Montieren Sie das Transfer-Sandwich (Filterpapier-Gel-Membran-Filterpapier) mit dem Gel auf der Anodenseite und die Membran an der Kathodenseite der Kassette.
    2. Legen Sie die Kassette in den Transfer-Tank mit Transfer-Puffer mit 2,5 mM Trisaminomethane (Tris), 19,2 mM Glycin und 20 % Methanol gefüllt.
      Achtung: Methanol ist brennbar und sollte innerhalb der brennbaren Flüssigkeit Schrank gelagert werden.
    3. Führen Sie den Transfer für 1 h bei 100 V in den kalten Raum.
  5. Blockieren Sie den Blot in 10 mL blockierende Puffer mit 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,1 Tween 20 und 5 % fettfreie Milch für 1 h bei Raumtemperatur in einen Shaker geben.
  6. Inkubieren Sie den Fleck mit Anti-HIF-1α Antikörper (Verdünnung 1: 500) in den gleichen blockierenden Puffer über Nacht bei 4 ° c
  7. Waschen Sie den Fleck 3 Mal für 5 min jeweils mit 50 mL TBS-T.
  8. Inkubieren Sie den Fleck mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper (1/1.000 Verdünnung) in 10 mL TBS-T mit 5 % fettfreie Trockenmilch für 1 h bei Raumtemperatur.
  9. Waschen Sie den Fleck 3 Mal für 5 min jeweils mit 50 mL TBS-T.
  10. Mix 500 µL jeder verbesserte Chemilumescent (ECL) Reagenz A und B in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Wirbel kurz.
  11. ECL-Substrat auf den Fleck auftragen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  12. Die Chemolumineszenz Signale mit einem kostenlos – Coupled Gerät (CCD) Kamera-basierten imaging-System zu erfassen.
    1. Abtropfen lassen Sie überschüssige ECL Substrat durch berühren den Rand der Membran mit einem Papiertuch und die Membran in ein Blatt Beschützer.
    2. Legen Sie die Membran auf Probenteller des CCD Kamerabasierte imaging-System.
    3. Bildverarbeitungs-Software zu starten (siehe Tabelle der Materialien) und die Aufnahmen mit den folgenden Einstellungen: Datei → neue Protokoll → Einkanal → Protokolleinstellungen → Gel Imaging (Anwendung: Chemi; Imaging-Bereich: Bio-Rad bereit Gel; Imaging Belichtung: Die Software wird automatisch optimieren die Belichtungszeit für intensive Bands) → Run Protokoll
      Hinweis: Die Belichtungszeit kann manuell eingestellt werden, um die optimale Bilder zu erreichen.

4. Immunopräzipitation und Erkennung der Immunoprecipitated Proteine

  1. Waschen 50 µL Protein A/G-Sepharose-Kügelchen in 500 µL des TBS-Puffers in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und pellet-die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 2 min bei 4 ° C.
  2. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Perlen in 100 µL der TBS-Puffer.
  3. Fügen Sie 2 µL der Maus monoklonalen Anti-ARNT Antikörper (1,4 mg/mL) oder Maus-Immunglobulin G (IgG) (1,4 mg/mL), die durch Neuaufbau 0,7 mg Maus IgG in 500 µL TBS Puffer vorbereitet wurde.
  4. Legen Sie die 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, enthält die Perlen in ein Rohr-Rotator und inkubieren Sie für 2 h bei 10 u/min in den kalten Raum.
    Hinweis: Behandeln Sie die Rohre vorsichtig zu und halten Sie die Suspension mit den Perlen an der Unterseite des Rohres.
  5. Pellet-die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 2 min bei 4 ° C und die Überstände zu verwerfen.
  6. Verdünnen Sie 200 µg des nuklearen Proteins lysate erwarb Schritt 2.6.5 in 800 µL des Puffers IP-bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20 % Glycerin, 0,2 % NP-40 und 1 X Proteaseinhibitor cocktail. Inkubieren Sie mit dem Antikörper gekoppelt Perlen im Schritt 4.5 über Nacht bei 4 ° c erreicht die lysate
  7. Pellet-die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 2 min bei 4 ° C, verwerfen die Überstände und waschen Sie die Perlen 3 Mal mit 1 mL eiskaltes TBS mit 0,2 % NP-40.
  8. Kochen Sie die Perlen in 50 µL Laemmli Probenpuffer bei 95 ° C für 5 min.
  9. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 X g für 5 min bei 4 ° C, sammeln Sie den überstand zu und entsorgen Sie die Perlen.
    Hinweis: Der Überstand kann bei 4 ° C für den kurzfristigen oder-20 ° C dauerhaft gespeichert werden.
  10. Ermitteln Sie das Vorhandensein von HIF-1α aus der Immunoprecipitated-Protein-komplexe durch western-Blot wie oben beschrieben im Schritt 3.3 ab.
    Hinweis: Protein Quantifizierung ist nicht erforderlich für diesen Schritt. Laden Sie vollen Lautstärke (50 µL) des Überstands jeder Probe in jede Vertiefung eine SDS-PAGE Fertigteile gradient Gele (4 – 20 %)

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Ergebnisse

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Die zelluläre Reaktion auf Hypoxie, der Ausdruck beurteilen wurden Ebenen und subzelluläre Lokalisation der Komponenten der HIF-1 folgende Hypoxie Komplexbehandlung untersucht. HEK293A Zellen wurden kultiviert unter hypoxischen Bedingungen für 4 h oder als Steuerelemente auf normoxiezustand gehalten. HIF-1α und ARNT proteingehalte untersucht wurden ganze Zelle oder nukleare/zytoplasmatischen extrahiert durch western-Blot. Wie erwartete, total HIF-1α-Ebenen hochreguliert durch Hypoxie, ARN...

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Diskussion

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Der HIF-1-Komplex ist ein master Regulator der zellulären Sauerstoff Homöostase und regelt eine Vielzahl von Genen, die in verschiedenen zellulären adaptive Reaktionen auf Hypoxie. Identifizierung von neuen HIF-1 interagierenden Proteine ist wichtig für das Verständnis der hypoxischen Signaltransduktion. Co-Immunopräzipitation Experimente werden häufig für ppi Studien verwendet, um zelluläre Signalwege Transduktion zu umreißen. Allerdings Protein Überexpression ist immer noch weit verbreitet und dies kann zu experimentel...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Prof. Assoc. Sin Tiong Ong für die Nutzung der Hypoxie-Workstation. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die folgenden: Singapore Ministry of Education, MOE 1T1-02/04 und MOE2015-T2-2-087 (, Y.A), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University Gründungshilfe M4230003 (um Sokolov), der schwedischen Forschungsrat der Erling Persson Familienstiftung, die Novo Nordisk Stiftung, die Stichting af Jochnick Foundation, die schwedische Diabetes Association, Scandia-Versicherungs-Gesellschaft, der Diabetes-Forschung und Wellness, Liegeplatz von Kantzow Stiftung, die Strategische Forschungsprogramm bei Diabetes am Karolinska Institutet, der ERC ERC-2013-AdG-338936-Betalmage, und Knut und Alice Wallenberg Foundation.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Material
1,0 M Tris-HCl Puffer, pH 7,4 1. BASE1415
Protein A/G SepharosekügelchenAbcamab193262
Natürliches Maus-IgG-ProteinAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli ProbenpufferBio-Rad1610737
2-MercaptoethanolBio-Rad1610710
Nitrocellulose Membran    Bio-Rad1620112
Blotting-Grade BlockerBio-Rad1706404Fettfreie Trockenmilch für Western Blotting-Anwendungen
10x Tris Buffered Kochsalzlösung (TBS)Bio-Rad1706435
10% Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/Glycin/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/Glycine Buffer Bio-Rad1610771
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610374
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener AntikörperZellsignalisierung7074
Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener AntikörperZellsignalisierung7076
SignalFire ECL ReagenzZellsignalisierung6883
Dulbecco's Phosphatgepufferte KochsalzlösungCorning21-030-CV
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1 beta AntikörperNovus BiologicalsNB100-124 Konzentration: 1,4 mg/mL
HIF-1 alpha AntikörperNovus BiologicalsNB100-479Konzentration: 1,0 mg/mL
YY1 AntikörperNovus BiologicalsNBP1-46218Konzentration: 0,2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein KitQiagen37582Lysepuffer NL und Extraktionspuffer NX1 sind im Kit
enthalten GAPDH AntikörperSanta Cruzsc-47724Konzentration: 0,2 mg/mL
Glycerin (≥ 99%)SigmaG5516
KaliumchloridSigmaP9541
RIPA PufferSigmaR0278
Natriumchlorid (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM, 4,5 g/L Glukose)Thermo Fisher Scientific11995065
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Fötales RinderserumThermo Fisher Scientific10270106
HEK293A ZelllinieThermo Fisher ScientificR70507
MethanolThermo Fisher Scientific67-56-1
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Pierce Proteasehemmer TablettenThermo Fisher Scientific88660
Pierce BCA-Protein-Assay-KitThermo Fisher Scientific23225
QSP Gel-LadetippThermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 μl
Ausrüstung/Instrument
Thick Blot Filterpapier, vorgestanzt, 7,5 x 10 cmBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN  Tetra Vertikale Elektrophoresezelle für Mini-Fertiggele, mit Mini-Trans-Blot  Modul und PowerPac Basic NetzteilBio-Rad1658034
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561083
ChemiDoc XRS+ SystemBio-Rad1708265
I-GloveBioSpherixI-Glove
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader BioTekBTS1LFTA
Costar 5 ml Stripette serologische PipetsCorning4487
Costar 10 mL Stripette Serologische PipetsCorning4488
Costar 25 mL Stripette Serologische PipetsCorning4251
Corning 96-Well Klarer Boden Schwarz Polystyrol MikrotiterplattenCorning3631
15 mL hoch Clarity PP konische ZentrifugenröhrchenCorning352095
kleine Zellen SchaberCorning3010
Gilson   Pipetman L 4-Pipetten-Set GilsonF167370P2, P20, P200, P1000 und Zubehör
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aus PolypropylenGreiner Bio-One
PIPETBOY acu 2 PipettiererINTEGRA Biosciences155 000 
Justrite Lagerschränke für brennbare FlüssigkeitenJustrite Manufacturing Co.896000
Vortex-MischerLabnetS0200
CO2-InkubatorNuAireNU-5820
OrbitalschüttlerStuartSSL1
Röhrchenrotator SB3StuartSB3
MicroCL 21R MikrozentrifugeThermo Fisher Scientific75002470
Sorvall ST 16 ZentrifugeThermo Fisher Scientific75004240
Gewebekulturschalen (100 mm)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI DialysegerätThermo Fisher Scientific6958010K MWCO, 0,1 mL
Schwimmbojen für 0,1 mL Slide-A-Lyzer MINI DialysegeräteThermo Fisher Scientific69588
LSE Digitale TrockenbadheizungenThermo Fisher Scientific1168H25
Thermo Scientific  1300 Serie A2 Klasse II, Typ A2 Bio-SicherheitswerkbänkeThermo Fisher Scientific13-261-308
Software
Image Lab SoftwareBio-Rad1709691
616201

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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