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Biology

सह immunoprecipitation परख कोशिकाओं से अंतर्जात परमाणु प्रोटीन का उपयोग Hypoxic शर्तों के तहत संस्कृति

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57836
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4, 5, 3, 1,2,3, 1,2
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

Summary

यहां हम hypoxic शर्तों के तहत अंतर्जात परमाणु प्रोटीन के बीच प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक सह-immunoprecipitation प्रोटोकॉल का वर्णन । इस विधि प्रतिलेखन कारकों और transcriptional सह हाइपोक्सिया पर नियामकों के बीच बातचीत के प्रदर्शन के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

कम ऑक्सीजन स्तर (हाइपोक्सिया) हाइपोक्सिया-inducible कारक 1 (HIF-1) जटिल एक मास्टर नियामक के रूप में अभिनय के साथ अनुकूली प्रतिक्रियाओं की एक किस्म को ट्रिगर । HIF-1 एक heterodimeric ऑक्सीजन विनियमित α उपइकाई (HIF-1α) और constitutively व्यक्त β उपइकाई (HIF-1β) भी aryl हाइड्रोकार्बन रिसेप्टर परमाणु translocator (ARNT), angiogenesis सहित विविध प्रक्रियाओं में शामिल जीन को विनियमित करने के रूप में जाना जाता है के होते हैं , erythropoiesis और glycolysis । HIF-1 बातचीत प्रोटीन की पहचान हाइपोक्सिया संकेतन मार्ग की समझ के लिए महत्वपूर्ण है । HIF-1α स्थिरता के विनियमन के अलावा, हाइपोक्सिया भी HIF-1α और ARNT सहित कई प्रतिलेखन कारकों के परमाणु translocation से चलाता है । विशेष रूप से, इस तरह के प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (PPIs) का अध्ययन करने के लिए प्रयुक्त वर्तमान पद्धतियों में से अधिकांश ऐसे सिस्टम पर आधारित हैं जहां प्रोटीन के स्तर को कृत्रिम रूप से प्रोटीन के माध्यम से बढ़ाया जाता है । प्रोटीन व्यक्त अक्सर गैर-शारीरिक लौकिक और स्थानिक कलाकृतियों से उत्पंन होने वाले परिणामों की ओर जाता है । यहाँ हम अंतर्जात नाभिकीय प्रोटीन का उपयोग कर हाइपोक्सिया उपचार के बाद एक संशोधित सह-immunoprecipitation प्रोटोकॉल का वर्णन, और अवधारणा का एक सबूत के रूप में, HIF-1α और ARNT के बीच बातचीत को दिखाने के लिए. इस प्रोटोकॉल में, hypoxic कोशिकाओं hypoxic शर्तों के तहत काटा गया था और Dulbecco के फास्फेट बफर खारा (DPBS) धोने बफर भी पूर्व equilibrated करने के लिए उपयोग करने से पहले hypoxic शर्तों को कम करने के लिए प्रोटीन क्षरण या प्रोटीन परिसर पृथक्करण के दौरान पुनर्ऑक्सीजन । इसके अलावा, परमाणु अंश बाद में ध्यान केंद्रित करने के लिए और अंतर्जात परमाणु प्रोटीन को स्थिर और संभव नकली अक्सर प्रोटीन व्यक्त के दौरान देखा परिणाम से बचने के लिए निकाले गए थे । इस प्रोटोकॉल के लिए प्रतिलेखन कारकों और transcriptional सह hypoxic शर्तों के तहत नियामकों के बीच अंतर्जात और देशी बातचीत का प्रदर्शन किया जा सकता है ।

Introduction

हाइपोक्सिया तब होता है जब अपर्याप्त ऑक्सीजन कोशिकाओं और शरीर के ऊतकों को आपूर्ति की है । यह विभिन्न शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जैसे स्टेम सेल विभेद, सूजन और कैंसर1,2. हाइपोक्सिया-inducible कारकों (HIFs) एक ऑक्सीजन विनियमित α उपइकाई और एक constitutively व्यक्त β उप इकाई भी ARNT3के रूप में जाना से बना heterodimers के रूप में समारोह । HIF-α उपइकाईयों के तीन isoforms (HIF-1α, HIF-2α और HIF-3α) तथा तीन HIF-β उपइकाईओं (ARNT/HIF-1β, ARNT2 and ARNT3) की पहचान कर ली गई है । HIF-1α और ARNT बैरे व्यक्त कर रहे हैं, जबकि HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 और ARNT3 अधिक प्रतिबंधित अभिव्यक्ति पैटर्न4है । HIF-1 प्रोटीन कॉम्प्लेक्स हाइपोक्सिया रिस्पांस का अहम रेगुलेटर है । hypoxic शर्तों के तहत, HIF-1α स्थिर हो जाता है, तो नाभिक को translocates और dimerizes5के साथ ARNT । इसके बाद, इस जटिल हाइपोक्सिया उत्तरदायी तत्वों (HREs) के रूप में जाना जाता विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड के लिए बांध और angiogenesis, erythropoiesis और glycolysis6सहित विविध प्रक्रियाओं में शामिल लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है. इस "विहित" प्रतिक्रिया के अलावा, हाइपोक्सिया संकेतन मार्ग भी कई सेलुलर प्रतिक्रिया संकेत के साथ crosstalk करने के लिए जाना जाता है जैसे पायदान और परमाणु कारक के रूप में मार्ग-कापा बी (NF-κB)7,8,9.

उपंयास HIF-1 बातचीत प्रोटीन की पहचान हाइपोक्सिया संकेतन मार्ग की एक बेहतर समझ के लिए महत्वपूर्ण है । ARNT, जो ऑक्सीजन के स्तर और constitutively व्यक्त के प्रति असंवेदनशील है के विपरीत, HIF-1α प्रोटीन का स्तर कसकर सेलुलर ऑक्सीजन के स्तर से विनियमित रहे हैं । normoxia (21% ऑक्सीजन), HIF-1α प्रोटीन तेजी से10,11नीचा दिखा रहे हैं । कम आधा HIF के जीवन-normoxia में 1α सेल निष्कर्षों से प्रोटीन का पता लगाने के लिए विशिष्ट तकनीकी चुनौतियों, साथ ही साथ HIF-1α-बातचीत प्रोटीन की पहचान के लिए प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, HIF के उन सहित कई प्रतिलेखन कारकों-1 hypoxic शर्तों के तहत नाभिक में जटिल translocate12,13,14। वर्तमान पीपीआई अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के अधिकांश गैर प्रोटीन के शारीरिक एक्सप्रेस का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं । इस तरह के प्रोटीन का इजहार संसाधन अधिभार, stoichiometric असंतुलन, संकीर्ण बातचीत, और मार्ग मॉडुलन15,16सहित कई तंत्र के माध्यम से विभिन्न सेलुलर दोषों का कारण बताया गया है । पीपीआई अध्ययन के संदर्भ में, प्रोटीन अधिक स्पष्ट झूठी सकारात्मक, या भी झूठी नकारात्मक, प्रोटीन गुण और व्यक्त प्रोटीन के कार्यों के आधार पर परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, पीपीआई अध्ययन के लिए मौजूदा तरीकों को संशोधित किया जाना है ताकि hypoxic शर्तों के तहत शारीरिक रूप से प्रासंगिक PPIs प्रकट करने के लिए । हम पहले HIF के बीच बातचीत का प्रदर्शन किया है-1 और Ets परिवार प्रतिलेखन कारक GA-बाध्यकारी प्रोटीन hypoxic P19 कोशिकाओं में (GABP), जो Hes1 प्रमोटर की प्रतिक्रिया के लिए योगदान 17हाइपोक्सिया । यहां, हम hypoxic शर्तों के तहत अंतर्जात परमाणु प्रोटीन के बीच PPIs अध्ययन करने के लिए एक सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल का वर्णन । HIF-1α और ARNT के बीच बातचीत अवधारणा का एक सबूत के रूप में दिखाया गया है । इस प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारकों और transcriptional सह hypoxic शर्तों के तहत नियामकों के बीच बातचीत के प्रदर्शन के लिए उपयुक्त है, सहित, लेकिन HIF की पहचान के लिए सीमित नहीं-1 बातचीत प्रोटीन ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल अनुभाग, जो मानव भ्रूण गुर्दा 293A (HEK293A) सेल का उपयोग करता है, एस नानयांग तकनीकी विश्वविद्यालय, सिंगापुर में मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों का पालन ।

1. HEK293A कोशिकाओं में हाइपोक्सिया की प्रेरण

  1. तैयार ४ १० cm व्यंजन और बीज 3 – 5 x 106 HEK293A कोशिकाओं प्रति डिश में 10 मिलीलीटर Dulbecco है संशोधित ईगल मध्यम (DMEM, ४.५ g/l ग्लूकोज) के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी l-glutamine, ११० mg/l सोडियम पाइरूवेट, १०० U/एमएल पेनिसिलिन और १०० मिलीग्राम/ मिलि streptomycin । संस्कृति एक ३७ ° c, 5% CO2 मशीन में कोशिकाओं ।
    नोट: एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में सेल सीडिंग किया जाना चाहिए । बीएससी में रखी जाने वाली सभी सामग्रियों की सतहों को ७०% एथेनॉल के साथ पोंछा जाना चाहिए ।
  2. 24 ज सीडिंग के बाद, जब कोशिकाओं 80 तक पहुंच चुके है-90% प्रवाह, मशीन glovebox में हाइपोक्सिया उपचैंबर में दो पकवान डाल ( सामग्री की तालिकादेखें) 1% O2 और 5% CO2 के साथ ३७ ° c पर, और अंय दो व्यंजन रखने पर normoxia (21% हे 2, 5% सीओ2 ३७ डिग्री सेल्सियस पर) 4 घंटे के लिए normoxic और hypoxic कोशिकाओं के एक सेट का प्रयोग पश्चिमी दाग द्वारा हाइपोक्सिया उपचार का मूल्यांकन करने के लिए और सह immunoprecipitation प्रयोगों के लिए कोशिकाओं के दूसरे सेट का उपयोग ।
    नोट: ऑक्सीजन का स्तर 0-5% पर सेट किया जा सकता है, और हाइपोक्सिया उपचार की अवधि के सेल प्रकार और अध्ययन उद्देश्य के आधार पर विविध किया जा सकता है ।

2. पूरे सेल और परमाणु निष्कर्षण

नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त बफ़र्स पर जानकारी के लिए तालिका 1 देखें ।

  1. normoxia नियंत्रण कोशिकाओं फसल ।
    1. आकांक्षा द्वारा संस्कृति मीडिया निकालें और 10 मिलीलीटर DPBS के साथ कोशिकाओं कुल्ला (पीएच 7.0-7.2) एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर ।
      नोट: पिपेट के साथ सेल monolayer को छूने से बचें । धोने के दौरान, धीरे सेल संस्कृति प्लेट की दीवार के नीचे DPBS पिपेट सेल नुकसान से बचने के लिए ।
    2. पिपेट 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा DPBS थाली में और एक सेल खुरचनी के साथ बर्फ ठंडा पंजाब में प्लेट की सतह से कोशिकाओं को परिमार्जन ।
    3. 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में सेल निलंबन स्थानांतरण और बर्फ पर रखो ।
  2. फसल hypoxic शर्तों के तहत प्रसंस्कृत कोशिकाओं ।
    1. प्री-equilibrate DPBS को hypoxic शर्तों के अनुसार एक खुला 100 मिलीलीटर प्रयोग ग्लास रिएजेंट बोतल हाइपोक्सिया उपचैंबर में DPBS से भरा (1% ओ2 और 5% CO2 पर ३७ डिग्री सेल्सियस) के लिए अग्रिम में 24 ज ।
    2. लगभग 1 ज हाइपोक्सिया इलाज कोशिकाओं की कटाई करने से पहले, एक बर्फ glovebox, जो 1% ओ2 और 5% सह2के लिए equilibrated गया है के प्रसंस्करण चैंबर में बर्फ युक्त बॉक्स जगह है । हाइपोक्सिया उपकक्ष से पूर्व equilibrated hypoxic DPBS युक्त प्रसंस्करण कक्ष के लिए बोतल हस्तांतरण और यह बर्फ पर जगह है ।
    3. 4 ज हाइपोक्सिया उपचार के बाद, हाइपोक्सिया उपकक्ष से कोशिकाओं को हस्तांतरण प्रसंस्करण चैंबर है कि पूर्व में किया गया है equilibrated 1% O2 और 5% सह2।
    4. आकांक्षा द्वारा संस्कृति मीडिया निकालें और एक बार 10 मिलीलीटर पिपेट के साथ 10 मिलीलीटर बर्फ शीत पूर्व equilibrated hypoxic DPBS के साथ कोशिकाओं कुल्ला ।
    5. 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडी प्री-equilibrated DPBS को 5 एमएल पिपेट के साथ डालें और सेल खुरचने के साथ स्क्रैप करके कोशिकाओं को उखाड़ फेंकें ।
    6. सेल संस्कृति प्लेट झुकाव और एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर अलग कोशिकाओं को इकट्ठा । DPBS में सेल सस्पेंशन को 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें ।
    7. glovebox के प्रसंस्करण और बफर चैंबर के बीच दरवाजा खोलो, दोनों जिनमें से 1% O2 और 5% सह2को पूर्व equilibrated गया है । प्रसंस्करण चैंबर से बफर चैंबर के लिए हाइपोक्सिया युक्त इलाज कोशिकाओं बर्फ पर 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों स्थानांतरण । बफर चैंबर के दरवाजे खोलें और glovebox से पूरी तरह से कोशिकाओं को हटा दें ।
  3. गोली दोनों normoxic कोशिकाओं से २.१ और २.२ से hypoxic कोशिकाओं पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा ।
  4. पूरे सेल अर्क तैयार करते हैं ।
    1. ५०० में सेल छर्रों resuspend बर्फ के µ एल-शीत रेडियो immunoprecipitation परख (RIPA) lysis बफर युक्त ५० mM Trisaminomethane हाइडरोक्लॉराइड (Tris-HCl) पीएच ८.०, १५० मिमी सोडियम क्लोराइड (NaCl), 1% tergitol-प्रकार np-४० (np-४०), ०.५% सोडियम deoxycholate, और ०.१% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), 1x चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल के साथ पूरक ( सामग्री की मेजदेखें) pipetting द्वारा सेल छर्रों ऊपर और नीचे कई बार ।
    2. नई १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में सेल lysates स्थानांतरण और सामयिक भंवर के साथ 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखो ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १३,००० x g पर सेल lysates केंद्रापसारक ।
    4. supernatant, aliquot ५० µ एल ले लीजिए supernatant में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों, और स्टोर पर-८० ° c ।
  5. एक परमाणु निष्कर्षण किट का उपयोग कर परमाणु निष्कर्षों को तैयार (सामग्री की तालिका देखें) ।
    1. धीरे lysis बफर NL के साथ पूरक के ५०० µ एल में सेल छर्रों resuspend और ०.१ मीटर dithiothreitol (डीटीटी) pipetting द्वारा सेल छर्रों ऊपर और नीचे कई बार....
    2. अधिकतम गति से 10 एस के लिए सेल निलंबन और भंवर के लिए डिटर्जेंट समाधान NP के 25 µ एल जोड़ें ।
    3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. supernatant (cytoplasmic अर्क), supernatant के aliquot ५० µ एल में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों, और स्टोर पर-८० डिग्री सेल्सियस ले लीजिए ।
    5. lysis बफर NL के ५०० µ एल में सेल नाभिक युक्त गोली resuspend अधिकतम गति से 5 एस के लिए भंवर द्वारा 1x छेड़ने अवरोधक कॉकटेल और ०.१ मीटर डीटीटी के साथ पूरक ।
    6. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० x g पर केंद्रापसारक और परमाणु गोली बचाने के लिए ।
    7. ५० में परमाणु गोली resuspend µ निष्कर्षण बफर के एल NX1 के साथ पूरक है 1x चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल द्वारा गोली pipetting और कई बार नीचे ।
    8. बर्फ पर 30 मिनट के लिए मशीन, 10 एस अधिकतम गति से हर 5 मिनट के लिए भंवर ।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. नाभिकीय अर्क को नमक ।
    1. कदम 2.5.9 से supernatant लीजिए और मिनी डायलिसिस उपकरणों में स्थानांतरण १०० µ एल प्रति यूनिट की अधिकतम मात्रा के साथ ।
    2. मिनी डायलिसिस उपकरणों कैप और एक प्लवनशीलता डिवाइस में उन्हें जगह है ।
    3. पहले से ठंडा डायलिसिस बफर के ५०० मिलीलीटर (20 मिमी Tris-एचसीएल नं० ७.४, २०% ग्लिसरॉल, 100mM पोटेशियम क्लोराइड (KCl), ०.२ मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), ०.२ mm phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) और ०.५ मिमी डीटीटी) युक्त एक चोंच में प्लवनशीलता डिवाइस रखें और कोमल सरगर्मी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
      सावधानी: PMSF खतरनाक है । त्वचा या साँस लेना के साथ सीधे संपर्क से बचें ।
    4. मिनी डायलिसिस उपकरणों के कोने से नमूने ले लीजिए और नए १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरण ।
    5. १२,००० पर 10 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक 4 ° c, aliquot 25 µ एल में प्रत्येक supernatant के एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, और स्टोर पर-८० ° c ।

3. प्रोटीन अभिव्यक्ति और HIF-1α के उपसेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने के द्वारा हाइपोक्सिया उपचार का मूल्यांकन

  1. एक bicinchoninic एसिड की microplate परख का उपयोग कर पूरे सेल या परमाणु/cytoplasmic निष्कर्षों का प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण (बीसीए) प्रोटीन परख किट के अनुसार निर्माता के निर्देश18।
  2. 5% 2-Mercaptoethanol युक्त 1x Laemmli नमूना बफर में सेल lysates को पतला करें और 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर उबालें ।
    चेतावनी: हीटिंग ब्लॉक की सतह को छूने नहीं है, क्योंकि यह जलता कारण हो सकता है ।
  3. सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) द्वारा प्रोटीन को अलग.
    1. प्रोटीन की बराबर मात्रा लोड (25 µ g) एक एसडीएस के प्रत्येक कुआं में-पृष्ठ कच्चा ढाल जैल (4-20%), आणविक भार मार्कर के 3 µ एल के साथ ।
    2. २.५ mm Tris, १९.२ mm glycine, ०.०१% एसडीएस, पीएच 8.3 30 मिनट के लिए २०० V से युक्त चल रहे बफ़र में जेल चलाएँ ।
  4. nitrocellulose झिल्ली को जेल से करने के लिए प्रोटीन स्थानांतरण ।
    1. स्थानांतरण सैंडविच इकट्ठा (फिल्टर कागज जेल-झिल्ली-फिल्टर कागज) anode ओर जेल के साथ और कैसेट के कैथोड ओर झिल्ली पर ।
    2. स्थानांतरण बफर से भरा हस्तांतरण टैंक में कैसेट प्लेस २.५ mm trisaminomethane (Tris), १९.२ mm glycine और 20% मेथनॉल ।
      सावधानी: मेथनॉल ज्वलनशील है और ज्वलनशील तरल भंडारण कैबिनेट के अंदर संग्रहित किया जाना चाहिए ।
    3. 1 के लिए स्थानांतरण बाहर ले १०० वी में शीत कक्ष में एच ।
  5. ब्लॉक में दाग 10 मिलीलीटर ५० mm Tris-सीएल (पीएच ७.६), १५० mm NaCl, ०.१ के बीच 20 और 5% गैर वसा वाले दूध के लिए 1 घंटे से अधिक एक बरतन पर कमरे के तापमान पर ।
  6. एक ही अवरुद्ध बफर में विरोधी HIF-1α एंटीबॉडी (1/500 कमजोर पड़ने) के साथ दाग की मशीन 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ।
  7. 5 मिनट के लिए ब्लाट 3 बार धो ५० एमएल टीबीएस-टी के साथ हर बार ।
  8. सहिजन peroxidase के साथ दाग मशीन (एचआरपी)-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1/1000 कमजोर पड़ने) में 10 मिलीलीटर टीबीएस-टी युक्त 5% गैर वसा शुष्क दूध 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर ।
  9. 5 मिनट के लिए ब्लाट 3 बार धो ५० एमएल टीबीएस-टी के साथ हर बार ।
  10. मिक्स ५०० µ l प्रत्येक को बढ़ाकर chemilumescent (ECL) रिएजेंट ए और बी में एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और भंवर संक्षेप में ।
  11. दाग के लिए ECL सब्सट्रेट लागू करें और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए मशीन ।
  12. एक चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा आधारित इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर chemiluminescent संकेतों पर कब्जा ।
    1. एक टिशू पेपर के साथ झिल्ली के किनारे को छूने और एक पत्रक रक्षक में झिल्ली जगह द्वारा अतिरिक्त ECL सब्सट्रेट नाली.
    2. सीसीडी कैमरा आधारित इमेजिंग प्रणाली के नमूना ट्रे पर झिल्ली प्लेस ।
    3. लॉंच छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) और निंनलिखित सेटिंग्स के साथ छवियों पर कब्जा: फ़ाइल → नए प्रोटोकॉल → एक चैनल → प्रोटोकॉल सेटअप → जेल इमेजिंग (आवेदन: Chemi; इमेजिंग क्षेत्र: बायो राड तैयार जेल; इमेजिंग जोखिम: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से तीव्र बैंड के लिए जोखिम समय का अनुकूलन होगा) → भागो प्रोटोकॉल
      नोट: जोखिम समय मैन्युअल रूप से इष्टतम छवियों को प्राप्त करने के लिए सेट किया जा सकता है.

4. Immunoprecipitation और Immunoprecipitated प्रोटीन का पता लगाने

  1. धो ५० प्रोटीन की µ एल एक/जी sepharose मोतियों की ५०० µ एल में टीबीएस बफर के १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ३,००० x G पर केंद्रापसारक द्वारा मोती गोली ।
  2. supernatant त्यागें और टीबीएस बफर के १०० µ l में मोतियों को फिर से सस्पेंड करें ।
  3. माउस के 2 µ l जोड़ें मोनोक्लोनल एंटी-ARNT एंटीबॉडी (१.४ मिलीग्राम/एमएल) या माउस Immunoglobulin जी (आईजीजी) (१.४ mg/जो ०.७ मिलीग्राम माउस आईजीजी को ५०० µ l टीबीएस बफ़र में गठित करके तैयार किया गया था ।
  4. एक ट्यूब रोटेटर में मोतियों से युक्त १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब प्लेस और ठंड कमरे में 10 rpm पर 2 ज के लिए मशीन ।
    नोट: धीरे ट्यूब संभाल और ट्यूब के तल पर मोती युक्त निलंबन रखने के लिए ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा मोतियों की गोली और supernatants त्यागें ।
  6. पतला २०० µ जी परमाणु प्रोटीन lysate के ८०० में चरण 2.6.5 में प्राप्त आईपी बफर के ५० मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ७.४), १८० मिमी NaCl, 20% ग्लिसरॉल, ०.२% NP-४० और 1x चिढ़ाने के कॉकटेल से मिलकर । एंटीबॉडी-युग्मित मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ४.५ कदम में प्राप्त के साथ lysate की मशीन ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा मोतियों की गोली, supernatants त्यागें और 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडा टीबीएस ०.२% NP-४० युक्त के साथ 3 बार मोती धो लो ।
  8. 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर ५० µ l Laemmli नमूना बफर में मोतियों को उबालें ।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर मोती केंद्रापसारक, supernatant इकट्ठा, और मोतियों को त्यागें ।
    नोट: supernatant लंबी अवधि के लिए अल्पावधि या-20 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  10. पहले चरण ३.३ के बाद में वर्णित के रूप में पश्चिमी दाग से immunoprecipitated प्रोटीन परिसरों से HIF-1α की उपस्थिति का पता लगाने ।
    नोट: इस चरण के लिए प्रोटीन ठहराव की आवश्यकता नहीं है । एक एसडीएस के प्रत्येक कुआं में प्रत्येक नमूने के supernatant के पूर्ण खंड (५० µ एल) लोड-पृष्ठ कच्चा ढाल जैल (4 – 20%)

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Representative Results

हाइपोक्सिया करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए, अभिव्यक्ति के स्तर और HIF-1 जटिल निम्नलिखित हाइपोक्सिया उपचार के घटकों के उपसेलुलर स्थानीयकरण की जांच की गई । HEK293A कोशिकाओं hypoxic शर्तों के तहत 4 ज के लिए या normoxia पर नियंत्रण के रूप में रखा गया था । पश्चिमी ब्लाटर द्वारा HIF-1α और ARNT प्रोटीन के स्तर की जांच पूरे सेल या परमाणु/cytoplasmic अर्क में की गई । के रूप में की उंमीद है, कुल HIF-1α स्तर हाइपोक्सिया द्वारा विनियमित थे, जबकि कुल सेलुलर lysates में ARNT स्तर काफी बदल नहीं थे (आंकड़ा 1a) । इसके अलावा, हाइपोक्सिया दोनों HIF के परमाणु संचय प्रेरित-1α और ARNT HEK293A कोशिकाओं में (आंकड़ा 1b), जो पिछले रिपोर्टों के अनुरूप है, हालांकि cytoplasmic के ARNT अभिव्यक्ति परीक्षण कक्ष लाइनों19में से कुछ में नहीं पाया गया ।

अगले, हम HIF-1α और ARNT निंनलिखित हाइपोक्सिया उपचार के बीच बातचीत का प्रदर्शन किया । नाभिकीय अर्क ४ एच के लिए normoxic या hypoxic शर्तों से उजागर HEK293A कोशिकाओं से तैयार किया गया था. HEK293A कोशिकाओं से परमाणु निष्कर्षों का उपयोग करते हुए सह-immunoprecipitation प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया. चित्रा 2में दिखाया गया है, HIF-1α hypoxic HEK293A कोशिकाओं के परमाणु निष्कर्षों से ARNT के साथ एक साथ सह immunoprecipitated था.

एक साथ लिया, प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक कोशिकाओं में एक hypoxic प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और आगे का निर्धारण करने के लिए endogenously के शारीरिक प्रोटीन बंधन व्यक्त HIF-1α/ARNT परिसरों नाभिक के भीतर ।

Figure 1
चित्रा 1: हाइपोक्सिया द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति और HIF-1 घटकों के उपसेलुलर स्थानीयकरण का विनियमन । (क) HEK293A कोशिकाओं में कुल HIF-1α या ARNT अभिव्यक्ति का Immunoblot विश्लेषण. कोशिकाओं 4 ज (एच) के लिए हाइपोक्सिया के संपर्क में थे या normoxia (एन) में रखा । पूरे सेल निष्कर्षों से प्रोटीन एसडीएस-पृष्ठ द्वारा अलग किया गया और विरोधी के साथ immunoblotting द्वारा विश्लेषण-HIF-1α, विरोधी ARNT और विरोधी glyceraldehyde 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) एंटीबॉडी. GAPDH एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । (ख) HEK293A कोशिकाओं के उपसेलुलर अंशों में HIF-1α और ARNT अभिव्यक्ति का Immunoblot विश्लेषण. HEK293A कोशिकाओं hypoxic शर्तों के तहत 4 ज (ज) या normoxia (एन) में रखा के लिए संस्कृति थे । परमाणु या cytoplasmic निष्कर्षों से प्रोटीन के 25 µ जी विरोधी HIF-1α, विरोधी ARNT, विरोधी यिन और यांग 1 (YY1) और विरोधी GAPDH एंटीबॉडी का उपयोग immunoblotting द्वारा विश्लेषण किया गया । YY1 और GAPDH क्रमशः परमाणु और cytoplasmic भागों के लिए लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: HIF-1α hypoxic शर्तों के तहत ARNT के साथ इंटरैक्ट करता है । HEK293A कोशिकाओं 4 ज के लिए हाइपोक्सिया को उजागर किया गया या नियंत्रण के रूप में normoxia में रखा । HEK293A कोशिकाओं से परमाणु निष्कर्षों को तैयार किया गया और immunoprecipitations एक विरोधी ARNT एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । नाभिकीय अर्क (इनपुट्स) और immunoprecipitated प्रोटीन्स का उपयोग immunoblotting द्वारा एंटी-HIF-1α, एंटी-ARNT और एंटी-YY1 एंटीबॉडी के द्वारा विश्लेषण किया गया । YY1 आईजीजी सह-immunoprecipitation प्रयोगों के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जबकि आदानों के लिए एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समाधान घटक टिप्पणियाँ
डायलिसिस बफर 20 एमएम Tris-एचसीएल (पीएच ७.४), 20% ग्लिसरॉल, १०० एमएम KCl, ०.२ एमएम EDTA, ०.२ एमएम PMSF और ०.५ एमएम डीटीटी उपयोग करने से पहले तुरंत PMSF और डीटीटी जोड़ें ।
बफ़र चल रहा है २.५ एमएम Tris-एचसीएल (पीएच ८.३), १९.२ एमएम glycine और ०.०१% एसडीएस मिक्स १०० ml 10x Tris/Glycine/एसडीएस बफर विथ ९०० ml ddH2ओ.
स्थानांतरण बफ़र २.५ एमएम Tris-एचसीएल (पीएच ८.३), १९.२ एमएम glycine और 20% मेथनॉल २०० एमएल मेथनॉल और ७०० एमएल ddH2ओ के साथ १०० मिलीलीटर 10x Tris/Glycine बफर मिला ।
टीबीएस बफर ५० मिमी Tris-सीएल (पीएच ७.६) और १५० मिमी NaCl मिक्स १०० एमएल 10x टीबीएस बफर विथ ९०० मब ddH२ओ.
टीबीएस-T बफ़र ५० मिमी Tris-सीएल (पीएच ७.६), १५० मिमी NaCl और ०.१% के बीच 20 मिक्स १०० एमएल 10x टीबीएस बफर के साथ ९०० एमएल ddH2ओ और 1 एमएल के बीच 20 ।
बफ़र ब्लॉक कर रहा है ५० मिमी Tris-सीएल (पीएच ७.६), १५० मिमी NaCl, ०.१% के बीच 20 और 5% गैर वसा दूध १०० एमएल टीबीएस-टी बफर में सोख्ता ग्रेड ब्लॉकर के 5 जी भंग ।
IP बफ़र ५० मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ७.४), १८० मिमी NaCl, 20% ग्लिसरॉल, ०.२% एनपी-४० और 1x चिढ़ाने के कॉकटेल तुरंत उपयोग करने से पहले को छेड़ो अवरोधक कॉकटेल जोड़ें ।

तालिका 1: समाधान तैयारी ।

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Discussion

HIF-1 कॉंप्लेक्स सेलुलर ऑक्सीजन homeostasis का एक मास्टर नियामक है और हाइपोक्सिया के लिए अलग सेलुलर अनुकूली प्रतिक्रियाओं में शामिल जीन की एक बहुतायत को नियंत्रित करता है । उपंयास HIF-1 बातचीत प्रोटीन की पहचान hypoxic संकेत transduction की समझ के लिए महत्वपूर्ण है । सह immunoprecipitation प्रयोगों सामांयतः सेलुलर संकेत transduction रास्ते चित्रित करने के लिए PPIs अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि, प्रोटीन अधिक व्यक्त अभी भी व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है और इस प्रयोगात्मक कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, HIF-1α एक अत्यधिक अस्थिर प्रोटीन है और यह तेजी से पुनः ऑक्सीजन11के दौरान नीचा हो जाता है । इसके अलावा, हाइपोक्सिया सबसे स्तनधारी सेल लाइनों में HIF-1 घटकों के परमाणु translocation चलाता है । इसलिए, पारंपरिक सह-immunoprecipitation प्रोटोकॉल हाइपोक्सिया उपचार के बाद शारीरिक रूप से प्रासंगिक HIF-1 बातचीत प्रोटीन की पहचान के लिए अनुकूलित किया जाना है । यहाँ, हम एक संशोधित सह-immunoprecipitation प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो HIF-1α और ARNT के बीच हाइपोक्सिया पर संपर्क प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता है.

री-ऑक्सीजन के दौरान HIF-1α के क्षरण से बचने के लिए hypoxic कोशिकाओं को मशीनी glovebox के प्रोसेसिंग चैंबर के अंदर काटा गया जो equilibrated शर्तों के पूर्व hypoxic था । DPBS वॉश बफर भी उपयोग करने से पहले hypoxic शर्तों को equilibrated था । यदि कोई हाइपोक्सिया कार्य केंद्र प्रसंस्करण के लिए उपलब्ध है, hypoxic कोशिकाओं को पूर्व equilibrated hypoxic DPBS के साथ धोया जा सकता है और उसके बाद बर्फ पर जल्दी से काटा । यह देखते हुए कि हाइपोक्सिया HIF-1 घटकों के नाभिकीय translocation को ट्रिगर कर सकते हैं और यह कि प्रोटीन प्रकिया artefactual परिणामों को प्रेरित कर सकता है, इस प्रोटोकॉल में अंतर्जात नाभिकीय प्रोटीन का उपयोग किया गया । सीओ immunoprecipitation प्रोटोकॉल में परमाणु अर्क के उपयोग की जानकारी भी अन्य लोगों ने20को दी है । यह परमाणु प्रोटीन के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए एक तकनीकी लाभ का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि यह पूरी सेल प्रोटीन से बाहर पतला किया जा रहा से परमाणु प्रोटीन का मौका कम कर देती है । इसके अलावा, परमाणु निष्कर्षों का उपयोग गैर विशिष्ट बातचीत की कमी के लिए उपयोगी हो सकता है, विशेष रूप से अत्यधिक प्रचुर मात्रा में अप्रासंगिक cytoplasmic प्रोटीन से, और के लिए जोखिम को कम करने से परमाणु प्रोटीन स्थिरता के सुधार के लिए कोशिका द्रव्य में मौजूद teases । अंतर्जात परमाणु निष्कर्षों के बजाय पूरे सेल के अर्क के उपयोग के लिए सह immunoprecipitation एक महत्वपूर्ण तकनीकी सुधार से पता चलता है, के रूप में हम केवल HIF-1α और GABPα के बीच बातचीत का पता लगाने के अंतर्जात परमाणु निष्कर्षों का उपयोग नहीं कर सकते हैं, लेकिन पूरे का उपयोग नहीं सेल अर्का17.

वर्णित प्रोटोकॉल में, कई स्थितियों को आगे परिणाम में सुधार करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हम 4 एच के लिए उंहें 1% ऑक्सीजन के साथ इलाज के द्वारा HEK293A कोशिकाओं में हाइपोक्सिया प्रेरित । हालांकि ऑक्सीजन का स्तर और हाइपोक्सिया उपचार की अवधि विभिंन प्रकार के सेल के लिए अलग किया जा सकता है और अध्ययन के उद्देश्य के अनुसार समायोजित । उदाहरण के लिए, HIF-1α और HIF-2α एक कोशिका प्रकार विशिष्ट तरीके से हाइपोक्सिया द्वारा विभेदक विनियमित किया जा सकता है, विभिन्न जैविक संदर्भों में उनकी अलग भूमिकाओं का संकेत है. यह दिखाया गया है कि neuroblastoma कोशिकाओं में, HIF-1α तीव्र हाइपोक्सिया (1% ओ2) की कम अवधि के दौरान सबसे अधिक सक्रिय है, जबकि HIF-2α भी हल्के हाइपोक्सिया के तहत सक्रिय है (5% हे2) और अधिक सक्रिय हो जाता है जीर्ण हाइपोक्सिया उपचार के बाद (48 – 72 एच के hypoxic एक्सपोजर)21. 0-5% हे2 स्तर आमतौर पर इन विट्रो हाइपोक्सिया उपचार के लिए उपयोग किया जाता है, जहां 1 – 5% हे2, 0.1 – 1% हे2 और 0 – 0.1% o2 अक्सर हल्के हाइपोक्सिया, हाइपोक्सिया और anoxia के रूप में परिभाषित कर रहे हैं, क्रमशः22. नमक एकाग्रता एक और पैरामीटर है कि अनुकूलन की आवश्यकता है, खासकर के बाद से यह23PPIs में ईओण बातचीत के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । परमाणु निष्कर्षों आमतौर पर नमक की उच्च सांद्रता युक्त एक बफर का उपयोग कर निकाला परमाणु प्रोटीन के साथ इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया । इसलिए परमाणु अर्क को सह-immunoprecipitation प्रयोगों से पूर्व ही उसे नमक देना पड़ सकता है. यहां, हम परमाणु एक डायलिसिस १०० mm KCl युक्त बफर का उपयोग कर निष्कर्षों को मिलाया, और आईपी १८० मिमी NaCl युक्त बफर के साथ dialyzed अर्क मिश्रित एक अंतिम नमक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए करीब १५० mm, जो शारीरिक के समान है intracellular PPIs अटी आहेत. अंतिम नमक एकाग्रता ब्याज की PPIs के गुणों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, GAPDH पूरे सेल निष्कर्षों और cytoplasmic भागों के लिए एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । हम HEK293A कोशिकाओं में GAPDH अभिव्यक्ति पर किसी भी महत्वपूर्ण हाइपोक्सिया प्रेरित विनियामक प्रभाव का पालन नहीं किया । हालांकि, GAPDH पहले कुछ सेल प्रकार24में हाइपोक्सिया द्वारा विनियमित किया जा करने के लिए दिखाया गया है । इस के साथ मन में, एक वैकल्पिक उचित लोड हो रहा है जब आवश्यक25नियंत्रण का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है । अलग से, हम पृष्ठभूमि संकेत का एक महत्वपूर्ण स्तर या तो मोतियों या एंटीबॉडी वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल से उपजी मनाया । पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, एक धुलाई कदम (10-15 मिनट) या अधिक से अधिक 3 धोया प्रदर्शन (5-10 बार) लंबा कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, धो बफर के ईओण ताकत भी १५० से नमक एकाग्रता titrating द्वारा धोया जा सकता है के दौरान ५०० mM । lysates भी पूर्व किया जा सकता है 1 के लिए प्रोटीन A/जी sepharose मोती के साथ मशीन रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर ।

यह प्रोटोकॉल परमाणु निष्कर्षों तक सीमित है और जैसे mitochondria और endoplasmic जालिका के रूप में अंय सेलुलर डिब्बों के भीतर PPIs के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । अंय पारंपरिक सह-immunoprecipitation प्रोटोकॉल के समान, इस विधि का उपयोग वास्तविक समय में PPIs का अध्ययन करने के लिए नहीं किया जा सकता या यह निर्धारित करने के लिए कि PPIs प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष हैं ।

संक्षेप में, हम उपंयास की पहचान के लिए एक संशोधित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल प्रदान शारीरिक रूप से प्रासंगिक HIF-1 बातचीत प्रोटीन । यह प्रोटोकॉल भी प्रतिलेखन कारकों और transcriptional सह hypoxic शर्तों के तहत नियामकों के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए उपयुक्त है । यद्यपि इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से हाइपोक्सिया शर्तों के तहत सह-immunoprecipitation प्रयोगों के लिए डिज़ाइन किया गया है, normoxia नियंत्रण कक्षों के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का एक भाग भी normoxia शर्तों के अंतर्गत नाभिकीय PPIs का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

हम Assoc. प्रो पाप तियोंग ांग हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के उपयोग के लिए धंयवाद । यह काम निंन द्वारा समर्थित किया गया था: सिंगापुर शिक्षा मंत्रालय, मो 1T1-02/MOE2015-टी 2-087 (Y.A.), ली कांग चियन स्कूल ऑफ मेडिसिन, नानयांग तकनीकी विश्वविद्यालय स्टार्ट-अप ग्रांट M4230003 (टू P.O.B.), स्वीडिश रिसर्च काउंसिल, फैमिली Erling-Persson फाउंडेशन, द नोवो Nordisk फाउंडेशन, द Stichting एएफ Jochnick फाउंडेशन, द स्वीडिश डायबिटीज असोसिएशन, द Scandia इंश्योरेंस कंपनी, द डायबिटीज रिसर्च ऐंड वेलनेस फाउंडेशन, बर्थ वॉन Kantzow की फाउंडेशन, कारोलिंस्का Institutet, ईआरसी ईआरसी-२०१३-AdG ३३८९३६-Betalmage, और Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन में मधुमेह में सामरिक अनुसंधान कार्यक्रम ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4  1st BASE 1415
Protein A/G Sepharose beads Abcam ab193262
Natural Mouse IgG protein Abcam ab198772
EDTA Bio-Rad 1610729
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610737
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
Nitrocellulose Membrane    Bio-Rad 1620112
Blotting-Grade Blocker Bio-Rad 1706404 Non-fat dry milk for western blotting applications
10x Tris Buffered Saline (TBS) Bio-Rad 1706435
10% Tween 20 Bio-Rad 1610781
10x Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 1610732
10x Tris/Glycine Buffer  Bio-Rad 1610771
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610374
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling 7074
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody  Cell Signaling 7076
SignalFire ECL Reagent Cell Signaling 6883
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Corning 21-030-CV
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Merck Millipore 52332
ARNT/HIF-1 beta Antibody  Novus Biologicals NB100-124  Concentration: 1.4 mg/mL
HIF-1 alpha Antibody Novus Biologicals NB100-479 Concentration: 1.0 mg/mL
YY1 Antibody Novus Biologicals NBP1-46218 Concentration: 0.2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein Kit Qiagen 37582 Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit
GAPDH Antibody Santa Cruz sc-47724 Concentration: 0.2 mg/mL
Glycerol (≥99%) Sigma G5516
Potassium chloride Sigma P9541
RIPA buffer Sigma R0278
Sodium Chloride (NaCl) Sigma 71376
NP-40 Sigma 127087-87-0
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) Thermo Fisher Scientific 11995065
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific R0861
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10270106
HEK293A cell line Thermo Fisher Scientific R70507
Methanol  Thermo Fisher Scientific 67-56-1
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Pierce Protease Inhibitor Tablets  Thermo Fisher Scientific 88660
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
QSP gel loading tip  Thermo Fisher Scientific QSP#010-R204-Q-PK 1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm Bio-Rad 1703932
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1658034
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561083
ChemiDoc XRS+ System Bio-Rad 1708265
I-Glove BioSpherix I-Glove
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader  BioTek BTS1LFTA
Costar 5mL Stripette Serological Pipets Corning 4487
Costar 10mL Stripette Serological Pipets Corning 4488
Costar 25mL Stripette Serological Pipets Corning 4251
Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates Corning 3631
15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes Corning 352095
Small Cell Scraper Corning 3010
Gilson Pipetman L 4-pipettes kit  Gilson F167370 P2, P20, P200, P1000 and accessories
1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes Greiner Bio-One  616201
PIPETBOY acu 2 Pipettor INTEGRA Biosciences 155 000 
Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets Justrite Manufacturing Co. 896000
Vortex mixer Labnet S0200
CO2 incubator NuAire NU-5820
Orbital shakers Stuart SSL1
Tube rotator SB3 Stuart SB3
MicroCL 21R Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002470
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004240
Tissue Culture Dishes (100 mm) Thermo Fisher Scientific 150350
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Thermo Fisher Scientific 69580 10K MWCO, 0.1 mL
Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices Thermo Fisher Scientific 69588
LSE Digital Dry Bath Heaters Thermo Fisher Scientific 1168H25
Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets Thermo Fisher Scientific 13-261-308
Software
Image Lab Software Bio-Rad 1709691

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References

  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).

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सह immunoprecipitation परख कोशिकाओं से अंतर्जात परमाणु प्रोटीन का उपयोग Hypoxic शर्तों के तहत संस्कृति
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