Methodenartikel

Eine Invasive Methode zur Aktivierung der Maus Dentate Gyrus durch hochfrequente Stimulation

DOI:

10.3791/57857

⸱

2. Juni 2018

 , 
1Department of Neurobiology, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, 2Key Laboratory of Neuroregeneration, Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll zeigt, wie eine zuverlässige HFS-Methode bei Mäusen einrichten. Neuronen in der hippocampal dentate Gyrus werden durch HFS direkt und indirekt in Vivoelektrisch stimuliert. Neuronale Aktivität und molekulare Signale werden vom c-fos und Notch1 immunofluorescent Färbung, geprüft; Neurogenese wird durch Bromodeoxyuridine Assay Kennzeichnung quantifiziert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hochfrequenz-Elektrostimulation (HFS) mit implantierten Elektroden Ausrichtung auf verschiedene Gehirnregionen ist als eine wirksame Behandlung für verschiedene neurologische und psychiatrische Störungen nachgewiesen worden. HFS im tiefen Bereich des Gehirns, auch benannt Tiefe Hirnstimulation (DBS), wird in klinischen Studien immer wichtiger. Jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Hochfrequenz-DBS (HF-DBS) Chirurgie hat damit begonnen, die Möglichkeit der Nutzung diese invasive Technik auf andere Situationen, wie z. B. die Behandlung von schweren Depressionen Störung (MDD), Zwangsstörungen (OCD), zu verbreiten und so auf.

Trotz dieser wachsenden Anzeichen bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen die segensreiche Wirkungen von HF-DBS rätselhaft. Um diese Frage zu lösen, ist ein Ansatz, implantierte Elektroden verwenden, die spärlich verteilte Subpopulationen von Neuronen durch HFS aktivieren. Es wurde berichtet, dass HFS im anterioren Nucleus des Thalamus zur Behandlung der refraktären Epilepsie in der Klinik verwendet werden könnten. Die zugrunde liegenden Mechanismen könnten im Zusammenhang mit der erhöhten Neurogenese und neuronalen Aktivität verändert. Deshalb sind wir interessiert, die physiologischen Veränderungen durch die Erkennung von neuronaler Aktivität sowie Neurogenese bei der Maus dentate Gyrus (DG) vor und nach der Behandlung der HFS.

In diesem Manuskript beschreiben wir Methoden für HFS die Aktivierung der DG bei Mäusen, direkt oder indirekt und in akuter oder chronischer Weise ausrichten. Darüber hinaus beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Zubereitung von Gehirnscheiben für c-fos und Notch1 immunofluorescent Färbung um die neuronale Aktivität zu überwachen und Signalisierung Aktivierung und Bromodeoxyuridine (BrdU) beschriften, um festzustellen, die Neurogenese nach HF-DBS-Induktion. Die Aktivierung der neuronalen Aktivität und Neurogenese nach der HF-DBS-Behandlung bietet direkte neurobiologische Erkenntnisse und mögliche therapeutische Vorteile. Insbesondere kann diese Methodik verändert und auf anderen interessierten Gehirnregionen wie den Basalganglien und subthalamic Regionen für bestimmte Hirnerkrankungen in der Klinik angewendet werden.

Einleitung

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HF-DBS ist eine Neurochirurgische Technik für elektrische Stimulation des Gehirns, die seit den 1870er Jahren1entwickelt wurde. In den späten 1980ern HFS diente zuerst als eine mögliche therapeutische Intervention für Morbus Parkinson und andere Bewegung Störungen2. In den letzten Jahrzehnten hat HF-DBS mehr und mehr verbreitet in der Behandlung von Erkrankungen des Gehirns, die derzeit unheilbar sind durch eine traditionelle therapeutische Strategie. Insbesondere durch die genauigkeitsverbesserung der HFS-Elektrode, hochwirksame Resultate und minimalen Nebenwirkungen, die Zahl der Erkrankungen des Gehirns von HF-DBS behandelt deutlich gestiegen in den letzten Jahrzehnten3,4, 5. Zum Beispiel wurde HF-DBS von der US Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung der Parkinson-Krankheit (PD), Typ Alzheimer Demenz, essentiellem Tremor und andere Arten von Bewegung Störungen2,6, genehmigt 7. bei Parkinson-Patienten, die dopaminergen Medikation reduziert bis zu 50 % bei HF-DBS-8. Neben der erfolgreichen Behandlung von Bewegungsstörungen zeigen HF-DBS auch seine starke Effekte bei der Behandlung von psychiatrischen Erkrankungen in der Klinik und für kognitive Augmentation als gut2,9, 10 , 11. es sollte angemerkt werden, dass die Erforschung der HFS für die Behandlung von anderen psychiatrischen Erkrankungen sind in verschiedenen Stadien, bietet viel versprechend für Patienten12.

Obwohl viele Studien gezeigt haben, dass eine fokale HFS sowohl lokale als auch remote Auswirkungen im gesamten Gehirn13hat, bleiben die neurologischen und molekularen Mechanismen der Wirkung schwer fassbaren2,14. In der Klinik gilt therapeutischen HF-DBS in der Regel in einer langfristigen Weise für die Behandlung der Parkinson-Krankheit und chronische Schmerzen, etc. , die viele Meinungen ausgelöst werden, um zu erklären, die Verbesserung, erzeugt durch eine HF-DBS-Behandlung, unter denen eine Möglichkeit dass der HFS-Strom der neuronalen Netzwerk-Aktivität, wahrscheinlich durch eine sich wiederholende Depolarisation der Axone in der Nähe der implantierten Elektrode HFS moduliert. Oder HF-DBS die Fördermenge der Ausgang Neuronen und die geplanten Ziele ändern können. Auch HF-DBS führen kann zu langfristigen synaptischen Veränderungen, einschließlich Langzeitpotenzierung (LTP) und langzeitdepression (LTD), die auf eine symptomatische Verbesserung beitragen kann. Bisher ist noch unklar, ob HFS Janin die wichtigsten molekularen Ereignisse, die regulieren zelluläre Prozesse wie als adulten Neurogenese in Vivo. Mehrere Zeilen von Studien haben gezeigt, dass HFS bei Nagetieren ähnliche Neuronale Reaktionen von klinisch angewandter DBS15,16imitieren konnte. Um zu verstehen, die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen der HF-DBS, in dieser Studie richten wir zunächst eine in Vivo HFS Methodik bei Mäusen in einer akuten (ein Tag) oder chronische (fünf Tage) Art und Weise. Zweitens, richten wir eine Methodik der Aktivierung zu bestimmen, die Veränderung der neuronalen Aktivität und Neurogenese im Auslieferzustand eine HF-DBS.

Da die neuronale Produktion von neuralen Stammzellen während der embryonalen Entwicklung reichlich ist aber Erwachsenenlebens andauert, ist die hippocampale subgranular Zone eines der wichtigsten Gebiete wo die Neurogenese auftritt. Der Prozess der Neurogenese wird von vielen physiologischen und pathologischen Faktoren beeinflusst. In bestimmten epileptischen Fällen ist die hippocampale Neurogenese drastisch verringerte17,18. Darüber hinaus konnte eine einzelne Elektrokrampftherapie die neuronale Produktion im dentate Gyrus19deutlich steigern. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die elektrophysiologische Aktivität eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der adulten Neurogenese und Synaptische Plastizität in hippocampal Neuronen spielt. Daher, um die Auswirkungen von HF-DBS auf neuronaler Aktivität und Neurogenese unter Beweis zu stellen, wir führen zunächst eine Immunostaining Assay der unmittelbaren frühen gen (IEG)- c-fos ist ein bekannter Marker für kurzfristige neuronaler Aktivität infolge Erleben Sie20. Notch1 Signalisierung wird auch erkannt, um die Signalisierung Aktivierung nach der HFS Lieferung21,22zu überwachen. Darüber hinaus erkennen wir auch die neuronale Produktion durch eine BrdU Kennzeichnung Analyse nach der HF-DBS-Induktion in verschiedenen Manieren, obwohl BrdU Färbung auch als Marker für Gliogenesis sein kann.

In der vorliegenden Studie werden zwei HFS-Methoden, die Aktivierung der hippocampalen GD direkt und indirekt Zielen angepasst. Die Elektrode wird direkt in der DG implantiert oder in den Projektionen, die DG-Neuronen aktivieren sendet medialen Perforant Weg (PP) implantiert. Für die HF-DBS-Induktion ist eine programmierbare Stimulator für eine kontinuierliche Stimulation über die festen Elektrode auf den Kopf der Maus vorgestellt. Ermitteln Sie die Auswirkungen der HFS auf neuronalen Aktivierung und Neurogenese, erkennen wir den Ausdruck von c-fos und Notch1 durch immunofluorescent Färbung und die Anzahl der BrdU integriert positive Neuronen im Großraum hippocampal DG jeweils nach die HFS-Behandlung. Insbesondere werden die Auswirkungen von HF-DBS auf die Neurogenese in der DG zwischen dem eine akute und eine chronische Stimulation oder zwischen einer direkten und einer indirekten Stimulierung Weise bzw. verglichen.

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Protokoll

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Tierische Verfahren experimentelle der institutionellen Richtlinien von der Beijing Institute of Basic Medical Sciences (Beijing, China) und der chinesischen staatlichen Regelungen für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Mäuse (Erwachsene männlich, 26 ~ 30 g) untergebracht waren, und hielt bei einer konstanten Temperatur von 23 ° C, mit Wasser und Nahrung Ad Libitum, unter einen 12 h Licht/12-h dunklen Zyklus (Leuchten bei 07:00). Alle experimentelle Verfahren wurden während der Licht-Zyklus durchgeführt.

(1) chirurgische Vorbereitung

Hinweis: Eine benutzerdefinierte Elektrode war hausgemacht mit der Methode von Halpern es Bericht23geändert.

  1. Verwenden Sie 2 Mikro-Kupferdrähte (mit einem äußeren Durchmesser von 200 µm) als parallele bipolare Elektrode. Wickeln Sie die Elektroden umeinander, zylindrische Elektroden zur Stimulation zu bilden.
    Hinweis: Hier wurde die Elektrodenlänge innerhalb der PP oder DG nach anatomischen Tiefe des Kerns variiert.
  2. Sterilisieren Sie die Elektroden mit einem Ethylen oxid Desinfektion Gehäuse. Handhabung und Lagerung hausgemachte 2-Kanal Micro-Wire Elektroden ohne jegliche Kontamination. Die Elektroden sollten unbedingt vor jedem chirurgischen Implantation sterilisiert werden.
  3. Autoklaven der chirurgischen Instrumente.
  4. Spritzen Sie vor der Operation die Maus mit Pentobarbital (20-50 mg/kg) intraperitoneal, um eine chirurgische Ebene der Narkose zu erreichen.
  5. Spritzen Sie die Maus mit einer sterilen Penicillin G Procain Suspension (75.000 U, i.m.) und ein schmerzstillende Mittel (Carprofen, 0,05 - 1 mg/kg, SC) zu verringern das Risiko von Infektionen und Schmerzen, bzw.24.
  6. Gelten Sie nach der tierischen Narkose ein Auge Schmiermittel für beide Augen, Augentrockenheit zu verhindern. Sorgen Sie für die Induktion der Sedierung und die Tiefe der Narkose durch Reflexe des Tieres als Reaktion auf Zeh Kneifen und fahren mit dem Betrieb nur, wenn keine Reaktion erfolgt.
    Hinweis: Vet-Salbe ist eine weitere Option, Augentrockenheit zu verhindern.
  7. Rasieren Sie die meisten das Fell auf der Oberseite der Maus-Kopf mit elektrischen Haarschneidemaschinen oder einer Rasierklinge zu, Sterilisieren Sie den rasierten Bereich mit drei wechselnden Peelings von 70 % Alkohol und Betadine Lösung und den Betrieb fortsetzen Sie, nachdem der Betadine auf der Haut getrocknet ist.

(2) hochfrequente Stimulation Chirurgie25,26

Hinweis: In diesem Schritt wird eine Elektrode einseitig implantiert in der dorsalen DG oder medialen PP-Bereich, ein Teil des Hippocampus mit kritischen Rollen in episodischen lernen und Gedächtnis.

  1. Platzieren Sie die narkotisierten Maus auf der Stereotaktische Rahmen. Um die Maus Kopf unbeweglich zu halten, die Ohr-Bars richtig ausrichten und schnell zu installieren. Ziehen Sie vorsichtig an den Ohr-Bars, so dass sie zentriert Kopf zu unterstützen und die Maus etwas zu sichern.
  2. Eine Thermostat-Pad verwenden, um das Tier Körpertemperatur auf 37 ± 0,5 ° C.
  3. Verwenden Sie Zange zu fassen die Haut anterior-Mouse-Ohren und schneiden Sie es mit einer sterilisierten Schere, über 1 cm-2 -Gebiet der Haut auf der Oberseite der Maus Schädel zu entfernen.
    Hinweis: Eine kleine Menge von Blutungen konnte an den Rändern der geschnittenen Haut beobachtet werden.
  4. Entfernen Sie den Muskel und andere Anlage über den Schädel mit einem Wattestäbchen, die Schädel-Oberfläche verfügbar zu machen. Verwenden Sie ein Wattestäbchen und sezierenden Meißel, um alle Knochenhaut, Sehnen und Bindegewebe von des Schädels Oberfläche komplett auf die sagittale identifizieren und Lambda-Nähte Linien zu reinigen.
  5. Identifizieren Sie die Bregma und Lambda-Punkt. Schnittpunkt der Kranznaht und die sagittale Naht auf der überlegenen Mittelteil der Calvaria befindet sich die Bregma. Der Schnittpunkt der lambdoid Naht durch die sagittale Naht ist wo der Lambda-Ausdruck sichtbar ist. Verwenden Sie die Bregma als den ursprünglichen Punkt, die anderen Kern Position festzulegen.
  6. Stellen Sie nach der Identifizierung der Bregma und Lambda-Position auf dem Schädel diese beiden Punkte in der horizontalen Ebene. Stellen Sie sicher, dass die Höhe dieser beiden Punkte fast das gleiche in Richtung dorsal-Ventral ist (Fehler sollte < 0,05 mm). Stellen Sie außerdem sicher, dass der Schädel in der Medial-laterale Richtung in der gleichen Weise26ist.
  7. Montieren Sie für eine einseitige Operation einen hausgemachte 2-Kanal-kupfernen-Mikro-Draht-Elektrode in den rotierenden Elektrodenhalter auf die Stereotaktische Chirurgie Rahmen.
  8. Legen Sie die Elektrode senkrecht über dem Punkt Bregma zuerst, und legen Sie es als original-Website. Nutzung der digitalen angezeigt Stereotaktische chirurgischen Rahmen um der anterior-posterioren (AP), Medial-laterale (ML), anzugeben und dorsal-Ventral (DV) positioniert.
    Hinweis: Damit die Elektrode nicht immer gebogen, berühren Sie nicht die Elektrodenspitze auf den Schädel während des Betriebs.
  9. Ziehen Sie die Elektrode vorsichtig in die richtige Position (Abbildung 1A, AP-2.1/ML ± 1,0 für DG und AP-3,8/ML ± 3.0 für PP, beziehungsweise)27 über den Schädel ohne jede Berührung. Wenn die gewünschte Seite zum einführen der Elektrode identifiziert wurde, verwenden Sie den dorsoventral stereotaktischen Anpassungen höher des Elektroden-Halters, und markieren Sie die Position mit einem schwarzen Marker.
    Hinweis: Die genaue Position in Bezug auf die stereotaktischen Koordinaten variieren je nach Maus Belastung, Gewicht und Geschlecht. Erwachsener Mäuse des gleichen Geschlechts sollte verwendet werden, um Abweichungen in der Lage zu minimieren. Wenn möglich, sollten präoperativen anatomische Scans zur Bestimmung des Standorts auf einem einzelnen Thema Grundlage27.
  10. Handgeführten Mikromanipulator-gestützte Bohrer verwenden (burr Größe = 0,5 mm), Burr Löcher an der markierten Position genau zu machen. Sterilisieren Sie die Spitze der Grat mit 70 % Ethanol, vor dem Bohren. Die Mini-Bohrer durch den Schädel entlang der z-Achse 0,8 - 1,0 mm ohne Änderung seiner X-Y-Position aufrücken. Verwenden Sie eine sterile Baumwolle Blutungen während der Operation.
    Hinweis: Um überbohren und übermäßige Wärmeentwicklung während des Bohrens zu vermeiden, stellen Sie sicher die Bohrgeschwindigkeit 15.000-18.000 Umdrehungen pro Minute (u/min) und häufig entziehen der Bohrkrone Bohrlochs alle 8-10 s.
  11. Bohren Sie halten Sie bis die Dura ausgesetzt ist. Verwenden Sie eine verbogene Nadel Knochen Fetzen entfernen, die während des Bohrens entstehen und machen ein Loch auf die Dura ohne Beschädigung der zugrunde liegenden weichen Hirngewebe.
    Hinweis: Um Beschädigungen zu vermeiden das Hirngewebe, die verbogene stumpfe Nadel kann auch mit einer feinen stumpfen Pinzette ersetzt werden.
  12. Um zu bestätigen, dass Burr Löcher an der gewünschten Position richtig vorgenommen wurden, verringern Sie die Höhe der Elektrode durch eine Anpassung des Rahmens Stereotaktische Chirurgie und sicherstellen Sie, dass die Elektrode reibungslos durch die Bohrlochs eingefügt werden kann, ohne irgendwelche Hindernisse zu berühren. Wenn ja, fügen Sie langsam die Elektroden bis zu einer Tiefe von 1,8 mm für die Generaldirektion (oder 3,0 mm für PP) von der Oberfläche des Schädels befindet sich an der medialen PP an die GD (PP-DG).
    Hinweis: Wischen Sie alle Liquor oder Blut Abflüsse aus den Grat Löcher mit sterilen Baumwolle während des Prozesses der Elektrode Implantation.
  13. Nach dem Einlegen der Micro-Draht-Elektrode in den Schädel Loch, halten Sie es mit ausreichend dental Zement mit einem kleinen Spatel. Da der Zement verdichtet, Schimmel es rund um die eingefügten Elektrode und Schrauben um eine schöne glatte Kappe zu bilden. Debride und die Wundränder desinfizieren.
  14. Lösen Sie die Elektrode von der Elektrodenhalter. Entfernen Sie die Maus aus der Stereotaktische Rahmen und an einem warmen Käfig zurück.
    Hinweis: Warten Sie nach der Operation, mit der Rückkehr der Tiere in ihren Käfigen, bis sie aus der Narkose mit ausreichend Bewusstsein vollständig erholt haben.
  15. Lassen Sie die Maus bewegen sich frei und lassen Sie es für 2 Tage in den Käfig zu erholen. Dann verbinden Sie die Elektrode implantiert Gehirn ein programmierbarer Stimulator über die Maus führt. Richten Sie die Softwareschnittstelle, wie in Abbildung 2dargestellt. Die HFS-Parameter als 6er 6 Züge 6 Pulse bei 400 Hz festgelegt (Abbildung 1B, 100 ms zwischen den Zügen, 20 s zwischen den Serien)28. Legen Sie die Intensität der Stimulation auf 200 μA.
  16. Liefern Sie eine HFS für den gewünschten Zeitraum festgelegt. Liefern Sie die Stimulation 2 x täglich 08:00 und 20:00
  17. Für die Kontrollgruppe Implantat-Elektroden in den Mäusen und führen Sie eine Stimulation.
  18. Für die c-fos -Färbung, stimulieren die experimentellen Mäuse akut (2 X pro Tag). Für die Kennzeichnung von BrdU, teilen die experimentellen Mäuse in einer akuten Stimulation-Gruppe (2 X pro Tag angewendet) und eine chronische Stimulation-Gruppe (angewandte 10 X in 5 Tagen, 2 X pro Tag). Im Verlauf der Stimulation sicherstellen Sie, dass die Maus wach ist. Denken Sie daran, um sicherzustellen, dass die Leitungen nicht verdreht sind.
    Hinweis: Am letzten Tag des Verfahrens waren die Mäuse in der akuten Stimulation Gruppe stimuliert gleichzeitig.
  19. Wenn die Stimulation erfolgt trennen Sie sorgfältig die Elektrode Pin der Elektrodenhalter und Stecker von der Recording-System.

(3) Immunfluoreszenz-Färbung und Bromodeoxyuridine Kennzeichnung29

  1. Für die c-fos und Notch1 Färbung ca. 3 h nach der letzten HF-DBS-Stimulation zu betäuben die Mäuse durch Injektion von Pentobarbital (20-50 mg/kg, i.p.) um eine chirurgische Ebene der Narkose zu erreichen.
  2. Geben Sie für die Kennzeichnung von BrdU ca. 12 h nach der letzten HF-DBS-Stimulation, 6 Injektionen von BrdU auf das Steuerelement und die stimulierte Mäuse in 2-h-Intervallen (50 mg/kg in 0,9 % Kochsalzlösung, i.p.). 36 h nach der letzten Injektion zu betäuben die Mäuse durch Injektion von Pentobarbital (20-50 mg/kg, i.p.) um eine chirurgische Ebene zu erreichen.
  3. Stellen Sie Einschnitte mit einem Skalpell durch den Brustkorb zu entlarven die Herzen und übergeben Sie dann eine stumpfe Perfusion 22-Gauge-Nadel an der linken Herzkammer. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof. Transcardially es durchspülen mit 50 mL kalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt von 50 mL kalten 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer (pH 7,4).
    Hinweis: Wechseln Sie die PBS zu der PFA wenn die Maus Blut in Vivo ersetzt wird und die Flüssigkeit klar läuft. Eine gute Durchblutung kann durch die Lichtung der Leber beurteilt werden. Die Perfusion sollte gestoppt werden, sobald Fixierung Zittern30beobachtet wurden.
  4. Enthaupte die Maus mit ophthalmologischen Schere, einen Einschnitt auf der Haut machen und setzen den Schädel. Mit Pinzette, Chip aus dem Schädel leicht und vorsichtig zerlegen die ganze Mäusegehirn. Post-ausflug des Gehirns in 4 % Paraformaldehyd für weitere 2 Tage und überträgt es auf eine 30 % Saccharoselösung bei 4 ° C über Nacht.
  5. Die Gehirn mit einem Kryostat geschnitten 20 µm koronalen Abschnitte. Übertragen Sie und montieren Sie die Abschnitte auf dem Objektträger mit einer Bürste und bei-20 ° c Lagern
    Hinweis: Tiere mit Elektrode Misplacements oder übermäßige mechanische Schäden werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
  6. Übertragen Sie die Folien in normalen PBS (0,1 M, pH 7,4), enthält keine Fixiermittel. Waschen Sie die Scheiben mit PBS für 3 bis 4 X 5 min jede, jede überschüssige Fixativ zu entfernen. Für die Gruppe mit der Bezeichnung von BrdU in den Abschnitten 2 N HCl für 30 min bei 37 ° C inkubieren und spülen Sie sie in eine 0,1 M Borat-Puffer (pH 8,4; 10 min). Dann waschen Sie die Scheiben 2 X für 5 min in PBS.
    Hinweis: Immunostaining wird dann durchgeführt.
  7. Behandeln Sie Scheiben durch Inkubation in blocking-Lösung (1 % normalem ziegenserum, Rinderserumalbumin < BSA > 3 %, 0,5 % Triton x-100 und 0,02 % Natriumazid in 1 X PBS) für 1 h bei Raumtemperatur (RT).
  8. Über Nacht inkubieren Sie die Scheiben mit Anti -c-fos polyklonalen Antikörper (1: 500, Kaninchen), Anti-Notch1 Antikörper (01:50, Ziege) oder Anti-BrdU Antikörper (1:800, Ratte) in die blockierende Lösung bei 4 ° C.
  9. Waschen Sie die Scheiben 3 X mit PBS-Puffer, dann Brüten sie mit Alexa Fluor 568-konjugierten Anti-Kaninchen (1: 500), Alexa Fluor 488-konjugierten Anti-Ziege (1:1, 000), oder Alexa Fluor 488-konjugierten Anti-Ratte (1: 500) sekundäre Antikörper für 1 h bei RT
  10. Waschen Sie die Proben 3 X mit PBS-Puffer (10 min jedes Mal). Decken Sie die Immuno-Label Gehirn-Abschnitte mit einem Anti-Fade Reagenz Eindeckmittel mit DAPI. Lassen Sie die Scheiben an der Luft trocknen und bei 4 ° c lichtgeschützt aufbewahren
  11. Bilder der hippocampal Bereiche stimuliert und unstimulierte seitlich des Gehirns mit einem hochauflösenden Mehrkanal (sequenziell) Scannen confocal Mikroskop zu erwerben. Legen Sie die bildgebenden Parameter konstant zwischen Steuerung und experimentellen Gruppen.
  12. Führen Sie ein Mosaik-Bildgebung mit einer hohen Vergrößerung Ziel (20 X Luft Ziel, NA 0,45) kontinuierliche 3D-Bilder (XYZ) der angrenzenden Gesichtsfelder mit motorisierten Stage erwerben und nutzen Sie geeignetsten Software, um sie große Verbund zusammen zu nähen Bilder.
    Hinweis: Tiling Funktionen enthalten echte Nähte und Optionen für verbesserte nahtlose Bilder glätten. Zusammengesetzte Bilder sind schnell und einfach zubereitet stitching-Funktion, um ein Bild über ein weites Gebiet zu bilden.
  13. Führen Sie für c-fos und Notch1 Färbung eine positive Kerne Quantitative Analyse der immunofluorescent Dichte21 der Gestickte Bilder. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie 3 Bereiche in den rostral, dorsalen und ventralen hippocampalen DG Teilregionen und Messen Sie die immunofluorescent Dichte in eine doppelblinde Weise mit Bild J Software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
  14. Analysieren Sie für eine BrdU Kennzeichnung die Scheiben um die Bohrungen Punkt durch den dorsalen Hippocampus (-1,70 mm bis-2,70 mm im Vergleich zu den Bregma) in gewissem Sinne doppelblinde.
  15. Zählen Sie nur BrdU-positiven Neuronen in der DG. Zählen der Zellen liegen innerhalb von 2-Zelle Durchmesser der Granulat-Zelle in der Graf.
    Hinweis: Hier zählen erfolgte mittels einer 40 X Luft Ziel. Nach dem Zufallsprinzip, 3-5 Abschnitte pro Tier wurden gezählt, und die Grafen wurden gemittelt und als Mittel pro DG19ausgedrückt.

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Ergebnisse

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Im Anschluss an die HF-DBS-Stimulation der hippocampalen DG Subregion direkt oder PP Subregion im Hinblick auf die DG indirekt aktivieren über eingefügt Elektroden verwenden die stereotaktischen Anpassungen, die Nagetiere wurden mit Pentobarbital betäubt und beprobt 3 h nach der letzten HF-DBS-Stimulation für die c-fos und Notch1 Immunostaining. Für die BrdU Färbung, 36 h nach der letzten Injektion von BrdU nach 1 Tag oder 5 Tage der HF-DBS Stimulation, wurden die Nageti...

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Diskussion

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Die HF-DBS-Technik hat als ein mächtiges Werkzeug für die Behandlung von vielen neurologischen Erkrankungen seit den 1990er Jahren verbreitet. Bisher ist das Wahrzeichen Werk von HF-DBS für die Behandlung von Parkinson und essentiellem Tremor, der viel Aufmerksamkeit und das Interesse sowohl in der Klinik und der wissenschaftlichen Gemeinschaft angezogen hat. Es gibt verschiedene Arten der laufenden HF-DBS-Studien von vielen Gruppen für HF-DBS therapeutische Anwendung bestimmte neurologische und psychiatrische Erkrankung...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verzollen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unterstützt von der National Natural Science Foundation China Zuschüsse, 31522029, 31770929 und 31371149 (um Haitao Wu), Programm 973 (2014CB542203) aus dem Staat wichtige Entwicklungsprogramm für die Grundlagenforschung von China (, Haitao Wu) und Grant Z161100000216154 aus der Beijing Municipal Science and Technology Kommission (, Haitao Wu). Die Autoren danken allen Mitgliedern des Haitao Wu Labor für ihre Ermutigung und Diskussionen. Die Autoren sind sehr dankbar für seine Hilfe beim debugging der Apparat Zhenwei Liu.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Stereotaktisches Instrument für das GehirnStoelting51730DStereotaktische intrakranielle Implantation für Maus
StimulatorA-M-SystemeModell 3800MultiStim 8-Kanal programmierbarer Stimulator
ZahnbohrerSaeshin Precision Co., LtdSTRONG 90Für Bohrungen und Kraniotomie 
GratMeisingerHM1 005#Zum Bohren und Kraniotomie 
Digidata 1550 DigitizerMolecular DevicesAXON 1550Hochauflösende Datenerfassung
KryotomThermo Fisher ScientificThermo Cryotome FSESchneiden von gefrorenen Schnitten von Proben
Konfokales MikroskopOlympusFV-1200Japan, mit 20x Objektiv (NA 0,45)
Werkzeuge für die MauschirurgieSchere, Pinzette, Knochenschneider, Halter etc.
Pentobarbital-NatriumR& D-Systeme457920-50 mg/kg für i.p.
Injektion Penicillin G Sigma-AldrichP303275.000 U für i.m. Injektion
CarprofenSigma-AldrichSML17135-10mg/kg, für s.c. Injektion
4% Paraformaldehyd (PFA)Beijing Solarbio Sci-Tech Co. P1110Strumpflösung zur Gewebefixierung
Phosphatpuffer (PBS)Invitrogen10010023pH7,4, 500ml im Strumpf
Tissue-Tek O.C.T. VerbindungSakura4583Formulierung von wasserlöslichen Glykolen und Harzen
Anti-BrdU-AntikörperAbcamab6326Verdünnungen:1/800
anti-c-fos AntikörperAbcamab209794Verdünnungen:1/500
Anti-Kaninchen-IgG (Alexa Fluor 568)Thermo Fisher ScientificA11036Verdünnungen:1/500
Donkey Anti-Ratte IgG (Alexa Fluor 488)Jackson ImmunoResearch712-546-150Verdünnungen:1/500
Antifading-Eindeckmedium mit DAPIVector LaboratoriesH-1200Gegenfärbung mit DAPI
Anti-Notch1-Antikörper (C-20)Santa Cruz Biotechsc-6014Verdünnungen:1/50
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488)Abcamab150073Verdünnungen:1/1000
F.S.T.14084-08,11254-20,16109-14

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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