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Methodenartikel

In Vivo Mikrodialyse-Methode, um große extrazellulären Proteine Sammeln von Gehirn interstitielle Flüssigkeit mit hochmolekularen Gewicht Cut-Off-Sonden

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DOI:

10.3791/57869

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26. September 2018

1Department of Neuropathology, Graduate School of Medicine, University of Tokyo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In Vivo Mikrodialyse ermöglichte Ansammlung von Molekülen im Gehirn interstitielle Flüssigkeit (ISF) von wach, frei Verhalten Tieren vorhanden. Um relativ große Moleküle in ISF zu analysieren, der aktuelle Artikel konzentriert sich speziell auf der Mikrodialyse-Protokoll mit Sonden mit hohem Molekulargewicht Membranen abgeschnitten.

Zusammenfassung

In Vivo Mikrodialyse ist eine leistungsstarke Technik, ISF von wach, frei Verhalten Tieren basiert auf einem Prinzip der Dialyse zu sammeln. Während Mikrodialyse eine etablierte Methode, die relativ kleine Moleküle wie Aminosäuren oder Neurotransmitter misst ist, wurde es vor kurzem zur Dynamik von größeren Molekülen in ISF mit Sonden mit hohem Molekulargewicht abgeschnitten bewerten Membranen. Bei Verwendung solcher Sonden, muss Mikrodialyse in einem Push-Pull-Modus zu Druck im Inneren der Sonden angesammelt ausgeführt werden. Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle einschließlich stereotaktischen Chirurgie und Mikrodialyse Linien einrichten, um Proteine von ISF zu sammeln. Während Mikrodialyse können Medikamente systemisch oder durch direkte Infusion in ISF verabreicht werden. Umgekehrte Mikrodialyse ist eine Technik, um direkt Verbindungen in ISF einfließen. Aufnahme von Medikamenten in der Mikrodialyse Perfusion Puffer ermöglicht es ihnen, durch die Sonden in ISF diffundieren, während gleichzeitig die ISF zu sammeln. Durch die Messung von Tau-Protein als Beispiel, zeigt der Autor, wie die Ebenen auf anregende neuronaler Aktivität durch umgekehrte Mikrodialyse Picrotoxin verändert werden. Vorteile und Grenzen der Mikrodialyse werden zusammen mit dem erweiterten Programm beschrieben, durch die Kombination von anderen in-Vivo -Methoden.

Einleitung

ISF umfasst 15-20 % der gesamten Hirnvolumen und bietet eine Mikroumgebung für Signaltransduktion, substrattransport und Abfälle Clearance1von entscheidender Bedeutung. Daher wird die Möglichkeit des Sammelns ISF von lebenden Tieren größere Auswirkungen für verschiedene biologische Prozesse sowie Krankheitsmechanismus bieten. In Vivo Mikrodialyse ist eine der wenigen Methoden, die Probe und extrazelluläre Moleküle von ISF von Wachen, frei beweglichen Tieren zu quantifizieren und dient damit als ein nützliches Werkzeug in der neurowissenschaftlichen Forschung Feld2,3. Bei dieser Methode werden Mikrodialyse Sonden mit halbdurchlässigen Membranen im Gehirn und mit Perfusion Puffer auf die relativ langsame Fließgeschwindigkeit durchströmt (0,1-5 µL/min). Während dieser Perfusion extrazelluläre Moleküle im ISF passiv in die Sonde nach dem Konzentrationsgefälle diffundieren und sammeln Sie wie ein Dialysat. Obwohl dieser Artikel konzentriert sich auf die Methode zum Beispiel ISF im Gehirn, können das Prinzip und die Methode auf andere Organe durch entsprechende Modifikation bei Bedarf angewendet werden.

Mikrodialyse arbeitete zuerst in den frühen 1960er Jahren, und seit dann es ausgiebig verwendet wurde, um kleine Moleküle wie Aminosäuren oder Neurotransmitter im Gehirn zu sammeln. Aktuelle kommerzielle Verfügbarkeit der Mikrodialyse Sonden mit hochmolekularen Gewicht Membranen (100 kDa-3 MDa) abgeschnitten hat jedoch seine Anwendung auf relativ größere Proteine in ISF sowie4,5,6 erweitert. ,7. Die Studien mit diesen Sonden führte zu der Feststellung, dass Proteine wie Tau oder α-Synuclein, die lange werden exklusive zytoplasmatischen sind auch physiologisch in ISF4,5,8.

Eines der Probleme mit Mikrodialyse Sonden mit großen Cut-off-Membranen (in der Regel mehr als 1.000 kDa) ist, dass sie anfälliger für Ultrafiltration Flüssigkeitsverlust durch den inneren Druck in den Sonden angesammelt. Mikrodialyse Sonden verwendet hier haben eine einzigartige Struktur, um dieses Problem zu vermeiden. Der Druck wird nicht durch diese Struktur aufgebaut werden, so sollten Mikrodialyse mit diesen Sonden betrieben werden, in eine "Push-Pull"-Modus über eine Spritzenpumpe zum durchspülen von Sonden (= Push) und eine Walze/Peristaltikpumpe, das Dialysat kommen aus der Sonde Steckdose zu sammeln (= ziehen) 9 (obwohl es sowohl Push-als auch Pumpen, durch Druck abbrechen Luftlöcher vorhanden in den Sonden braucht der technisch nur Antrieb erfolgt durch die Pull-Pumpe). Dieser Artikel beginnt mit der stereotaktischen Operation ein Leitfaden Kanüle Implantation und beschreibt, wie Mikrodialyse Zeilen einrichten, um ISF durch Mikrodialyse Sonden mit 1.000 kDa Cutoff Membranen zu sammeln.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Use Committee der Graduate School of Medicine an der University of Tokyo.

1. präoperative Verfahren

  1. Wischen Sie vor Beginn der Operation alles mit 70 % Ethanol, sterile Bedingungen beizubehalten. Thermischen Unterstützung mit einem Heizkissen wird empfohlen.
  2. Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Chloral Hydrate (400 mg/kg). Anesthetization durch Ausführen einer Zehe Klemme zu bestätigen. Meloxicam SR auf Induktion und Buprenorphin bei Wiederherstellung Gebot wird für mindestens 24 Stunden empfohlen.
  3. Rasieren Sie die Haare mit einem chirurgischen Clipper. Befestigen Sie eine Maus in der Maus und der neonatalen Ratte Adapter mit Ohr-Bars und eine Nase Klammer.
    Hinweis: Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass Maus-Kopf ist zu diesem Zeitpunkt gesichert und bewegt sich nicht Side-by-Side.
  4. Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.

(2) stereotaktischen Chirurgie für Guide Kanüle Implantation

  1. Legen Sie die Maus und neonatalen Ratte-Adapter auf dem stereotaktischen Gerät. Machen Sie einen Schnitt sagittal auf der Haut über den Schädel mit einem Skalpell.　Blut und das Bindegewebe auf den Schädel mit einem feuchten Wattestäbchen abwischen.
  2. Bestimmen Sie die Koordinate für die Region des Gehirns mit Gehirn-Atlas. Messungen, vergewissern Sie sich vor dieser Mittellinie ist gerade, so dass die Bohrkrone A / P verschoben und bleiben auf der Mittellinie Naht die ganze Zeit.
    Hinweis: Dieser Artikel verwendet die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm, D/V:-1,20 mm, 12 Grad) hinteren Hippocampus ausrichten.
  3. Ebene Schädel A-P
    1. Legen Sie eine Bohrmaschine auf einen Manipulator stereotaktischen Rahmen. Senken Sie den Bohrer zu, bis er sanft Lambda berührt und notieren Sie ihre ventralen Koordinate. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Bregma.
      Hinweis: Wenn der Schädel abgeglichen wird, ist die vertikale Messung der Bregma gleich der Lambda. Wenn nicht, passen Sie die Höhe der Nase Klemme entsprechend an. Nachdem der Schädel nivelliert wird, zeichnen Sie die vorderen/hinteren, seitlichen Koordinate des Bregma.
  4. Ebene Schädel links-rechts
    1. Verschieben Sie den Bohrer aus Bregma in die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l: +2,0 mm), den Bohrer an den Schädel zu senken und die vertikale Koordinate aufzeichnen. Dann wiederholen Sie diesen Vorgang für die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,00 mm).
      Hinweis: Wenn der Schädel abgeglichen wird, entsprechen diese vertikale Messungen von zwei äquidistanten Punkten von der Mittellinie. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie die Höhe der Ohr-Bars.
  5. Bohren Sie vorsichtig an den Ziel-Koordinaten Grat (A / P:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm), eine Führer-Kanüle zu implantieren. Wenn der Durchmesser eines Bohrlochs nicht groß genug für eine Anleitung Kanüle Implantation ist, Bohren Sie ein weiteres Loch, das mit dem ersten überlappt. Bohren Sie ein weiteres Loch am rechten (kontralateralen Seite) Parietal Knochen und einsetzen Sie eine Knochenschraube, die hilft, um dental Zement in 1.10 (siehe Abbildung 1 b) zu sichern.
  6. Geschnitten Sie ein rundes Verriegelungs Stück von der Rückseite des Deckels eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen durch eine Rasierklinge und machen Sie eine '' Krone ''. Diese Krone wird verwendet, um dental Zement Ausbreitung auf der Haut zu verhindern. Legen Sie es auf den Schädel, so dass der Grat Löcher in Schritt 2.5 innerhalb des Kreises (siehe Abbildung 1 bleiben).
  7. Einrichten einer stereotaktischen Versammlung indem ein Leitfaden Kanüle auf den kürzeren Arm einer stereotaktischen Adapter und befestigen Sie es mit einer Hutmutter. Den längeren Arm des stereotaktischen Adapters auf die Elektrode Klammer gesetzt. Legen Sie es auf dem Manipulator des stereotaktischen Apparats (siehe Abbildung 1A).
  8. D-V Stereotax Montage auf den Greifarm durch 12 Grad (siehe Abbildung 1 b) drehen. Wechseln Sie die Führer-Kanüle an des Bohrlochs in 1.6 gemacht Setzen Sie die Guide-Kanüle langsam ins Gehirn von 1,2 mm Tieferlegung.
    Hinweis: Der Winkel der Sonde ist spezifisch für den Hippocampus; andere Regionen können überhaupt keine Winkel oder andere Winkel erforderlich. Einen Gehirn-Atlas für genaue Koordinaten zu konsultieren. Trocknen Sie die Oberfläche des Schädels, denn wenn nicht der Zement nicht haften und Zement GAP verdrängt werden kann
  9. Fügen Sie den dental Zement innerhalb der Krone voll decken das Metallteil der Führer-Kanüle und Knochenschraube genug um sie zu sichern. Gelten Sie zusätzliche dental Zement ist ein Teil des Schädels ausgesetzt.
  10. Warten Sie, bis dental Zement vollständig getrocknet ist (~ 12-20 min). Die Elektrode Klemme entfernen Sie den stereotaktischen Adapter. Entfernen Sie die Überwurfmutter und Ersetzen des stereotaktischen Adapters mit einer Dummy-Sonde und die Hutmutter befestigen.
  11. Lassen Sie die Maustaste aus dem stereotaktischen Gerät und Haus der Maus allein in einen einzelnen Käfig.
    Hinweis: Die Maus sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Überprüfen Sie die Maus täglich bis zum Tag der Mikrodialyse. Die Maus erhält NSAIDs wie Carprofen, wenn es Schmerzen zu haben scheint. 2 Wochen zu warten ist für Schlaf-Wach-Studien notwendig, damit die Maus an die neue Umgebung10 gewöhnt, aber andere Arten von Studien kürzere Erholungszeiten (z. B. 1-2 Tage erfordern).

(3) Mikrodialyse Setup

  1. Qualitäts-Check der Sonden: Füllung eine Einweg-1ml-Spritze mit destilliertem Waterand schließen Sie es an die Steckdose (kürzere Port) einer Sonde mit einem Byton Rohr. Decken Sie die Lüftungsschlitze mit den Fingern, und drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig, um Wasser, um die Sonde einflößen. Prüfen Sie, ob Wasser von der Sonde Einlass erscheint und gibt es keine Leckage auf der Oberfläche einer Mikrodialyse-Membran.
    1. Aktivierung der Sonden: die Membranen der Sonde in Ethanol (70-100 %) für zwei Sekunden Tauchen. Dann die Infusion destillierten Wassers in die Sonde wieder mit einer Spritze wieder.
  2. Vorbereitung der Perfusion Puffer: um Haftung der Zielmoleküle für die Schläuche zu vermeiden, fügen Sie BSA durch Verdünnung 30 % BSA Lösung auf 4 % mit künstlichen CSF (1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM Nahco33 , 122 mM NaCl, pH = 7,35), entspricht die Elektrolytkonzentration im CSF, unmittelbar vor dem Gebrauch. Filtern des Perfusion Puffers durch eine Spritze Filtereinheit mit 0,1 µm Porengröße.
    Hinweis: 4 % BSA verbessert die Erholung zum Aufkleben Proteine aber kann schränken Lieferung von Verbindungen, vor allem für Verbindungen, die hohe BSA-Bindung aufweisen. Dies ist ein Vorteil der Verwendung niedriger Konzentration von BSA (z. B. 0,15 %) in bestimmten Instanzen-3. Beachten Sie, dass die BSA kann sehr leicht zusammenfassen, wenn Wirbel oder rühren Platte bewegt. Diese Aggregate können Sonden oder Membranporen verstopfen. Seien Sie vorsichtig bei der Vorbereitung einer BSA-Lösung um diese Aggregation zu begrenzen
  3. Bereiten Sie zwei getrennte Leitungen für Einlass und Auslass (siehe Abbildung 1) und verbinden Sie beide Linien mit einer Verbindung Nadel. Füllen Sie eine Einweg-3 mL Spritze mit Perfusion Puffer gefüllt und verbinden Sie es mit dem Einlass-Ende des Schlauches mit einer stumpfen Ende Nadel. Füllen Sie das gesamte Rohr mit Perfusion Puffer durch die Spritzenpumpe läuft.
  4. Stoppen Sie die Spritzenpumpe und ersetzen Sie die Anschluss-Nadel zwischen Einlass und Auslass-Linie mit einem aktivierten Mikrodialyse-Sonde aus Schritt 3.3 (siehe Abbildung 1). Diese Ersetzung vorgelegt die Überwurfmutter an der Sonde.
  5. Die Tuchwelle in den Auslass-Schlauch auf der Walze-Pumpe zu montieren. Starten Sie die Spritzenpumpe mit 10 µL/min und dann die Walze Pumpe etwas langsamer Durchfluss (9.5-9,8 µL/min). Achten Sie darauf, alle Luftblasen in den gesamten Schlauch entfernen, die die Erholung beeinflussen können, wenn sie die Sonde in Kraft.
  6. Die Maus von Schritt 1.12 auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.2 zu betäuben. Legen Sie das Maus-Halsband um den Hals. Entfernen Sie die Überwurfmutter und Dummy-Sonde und langsam eine Mikrodialyse-Sonde von 3.4 durch die Führer-Kanüle und befestigen Sie die Hutmutter.
  7. Statt der Maus in den Käfig zu einem frei beweglichen System und die Maus mit dem Halsband Leine verbunden. Spritzenpumpe und Walze Pumpe mit der angegebenen Volumenstrom in 3.5 für mindestens 1 h Schritt läuft weiter.
    Hinweis: Um ISF Sammlung von Tieren, wach zu erreichen, verwendet dieser Artikel eine frei bewegliches System, wo ein Tier Bewegung Schläuche verdrehen halten der Käfig selbst entspricht. Alternativ können auch flüssige Wirbel von verschiedenen Firmen verwendet werden.
  8. Stop die Walze Pumpen zuerst und dann die Spritzenpumpe. Legen Sie die gewünschte Durchflussgeschwindigkeit. Führen Sie die Spritze Pumpe 20 % schneller als die Roller-Pumpe.
    Hinweis: zum Beispiel, wenn Sie mit 1 µL/min laufen, betreiben die Spritzenpumpe bei 1,2 µL/min. optimale Durchflussmenge sollte für jedes Molekül empirisch ermittelt werden.
  9. ISF Proben: Legen Sie das freie Ende des Auslass-Schlauch auf den gekühlten Fraktionssammler.
    Hinweis: Geeignete Probenvolumen variiert je nach Assays für die Analyse verwendet.
  10. Nach Abschluss des Experiments Entfernen der Sonde. (Zu betäuben die Maus je nach Bedarf.)  Behandeln Sie Maus Erholung genauso wie in Schritt 2.11. Analysieren Sie die gesammelten ISF durch Methoden wie HPLC oder ELISA.
  11. Um das gesamte Rohr nach Mikrodialyse waschen, verbinden Sie Einlass und Auslass Schläuche wieder, indem Sie die Sonde mit der Verbindung Nadel und verdünnte Bleichmittel in das gesamte Rohr laufen und dann mit Wasser spülen. Trocknen Sie und bewahren Sie es für eine wiederholte Verwendung.
    Hinweis: Andere Schläuche sind akzeptabel, jedoch BSA in Perfusion Puffer kann die Schläuche mit kleinem Durchmesser verstopfen, so gelten diese Schläuche als Einweg. Die Schläuche können abgenutzt oder verstopft nach mehreren Verwendungen, so stellen Sie sicher, dass der Durchfluss konsequent vor jeder Inbetriebnahme ist.

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Ergebnisse

Um zu stimulieren oder hemmen neuronalen Aktivität in umgekehrter Mikrodialyse11,12,13, Picrotoxin, GABA-A -Rezeptor-Antagonisten oder Tetrodotoxin, Na+ -Kanal-Blocker verwendet wurden. Es hat sich gezeigt, dass Tau Freigabe durch Erhöhung der neuronalen Aktivität13,14angeregt wird. Einklang mit diesen frühere Beobac...

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Diskussion

Mikrodialyse mit hohem Molekulargewicht Membranen abgeschnitten hat von einem Push-Pull-Modus betrieben werden, so ist es wichtig, dass die Durchflussmenge genau und konstant sind. Die Ungenauigkeit in der Durchflussmengen kann die Ursache der Luftblase Generation und Inkonsistenz in der probenkonzentration sein. Wenn der Fluss inkonsistent ist, prüfen Sie alle Anschlüsse auf Dichtheit. Wenn das Problem weiterhin besteht, kann es mit neuen Sonden und Schläuche Neustart erforderlich.

Microdilay...

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Offenlegungen

Der Autor hat nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von '' Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Gehirn Protein Altern und Demenz Control)(15H01552) aus MEXT und Beihilfe für junge Wissenschaftler (B) (16K 20969). Der Autor dankt Dr. David M. Holtzman und Dr. John R. Cirrito für die technische Beratung bei der Entwicklung dieser Methode.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Der Univentor 820 MikroprobensammlerUniventor8303002Kühlfraktionssammler
SpritzenpumpeKD scientificKDS-101
RollenpumpeEicom MikrodialyseERP-10
Raturn Stand-Alone-SystemBASiMD-1409Freibewegliches System
Käfig-Kit für zwei SpeziesBASiCX-1600
AtmosLM Mikrodialysesonde (Schaftlänge 8 mm, Membranlänge 2 mm)Eicom MikrodialysePEP-8-02Die Schaftlänge für eine Sonde, eine Führung, eine Dumy-Sonde und einen stereotaktischen Adapter sollte identisch sein.
Mikrodialyse-Schablone (Schaftlänge 8 mm)Eicom MikrodialysePEG-8
Mikrodialyse-Dummy-Sonde (Schaftlänge 8 mm)Eicom MikrodialysePED-8
KnochenschraubeBASiMD-1310
Super bond C& B-SetSunmedicalZahnzement
Stereotaktisches Instrument für Kleintiere mit digitaler AnzeigekonsoleKopfModell 940Stereotaktisches Gerät
Adapter für Maus und NeugeborenenratteStoelting51625
Standard-Ohrbügel und Gummispitzen für Maus StereotaxischesStoelting51648
Albuminlösung aus RinderserumSigmaA7284-50ML30% BSA-Lösung
FEP-Schlauch (70 cm)Eicom MikrodialyseJF-10-70Innenvolumen = 0,5 & Mikro; L/cm
Teflonschlauch (50 cm)Eicom MikrodialyseJT-10-50Innenvolumen = 0,08 & Mikro; L/cm
Byton-RöhrchenEicom MikrodialyseJB-30
Intramedic Luer-Stab-Adapter 23GBD427565Nadel mit stumpfem Ende
RollenschlauchEicom MikrodialyseRT-5SInnenvolumen = 4 & Mikro; L
HutmutterEicom MikrodialyseAC-5
0,25 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit KappeQSP503-QRöhrchen für Fraktionssammler
Sterotaxischer Adapter (Schaftlänge 8 mm)Eicom MikrodialysePESG-8
VerbindungsnadelEicom MikrodialyseRTJ
Maus TierhalsbandBASiMD-1365
Hochgeschwindigkeits-Rotations-Mikromotor-KitFOREDOMK.1070Bohrer
PicrotoxinSigmaP1675
Schraubendreher für Knochenschrauben
Skalpell
Wattestäbchen
Chirurgischer Haarschneider

Referenzen

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