Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Xuan Guo; Yiqing Zhao; Hieu Nguyen; Tonghua Liu; Zhenghe Wang; Hua Lou

doi:10.3791/57889

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Methodenartikel

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

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DOI:

10.3791/57889

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26. August 2018

Xuan Guo¹^,² , Yiqing Zhao¹^,³ , Hieu Nguyen¹ , Tonghua Liu² , Zhenghe Wang¹^,³ , Hua Lou¹^,³^,⁴

¹Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University, ²Department of Endocrinology, Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, ³Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University, ⁴Center for RNA Science and Therapeutics, Case Western Reserve University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.

Zusammenfassung

Alternatives Spleißen (AS) tritt in mehr als 90 % der menschlichen Gene. Das Muster des Ausdrucks einer Alternativ gespleißten Exon wird oft in einer Zelle Typ-spezifische Art und Weise geregelt. ALS Ausdruck, die Muster sind in der Regel durch RT-PCR und RNA-Seq analysiert mit RNA-Proben von einer Bevölkerung der Zellen isoliert. In Situ Untersuchung als Expressionsmuster für eine bestimmte biologische Struktur kann durch RNA in Situ Hybridisierung (ISH) mit Exon-spezifischen Sonden durchgeführt werden. Jedoch wurde diese besondere Verwendung des ISH beschränkt, weil alternative Exons in der Regel zu kurz, um Exon-spezifischen Sonden zu entwerfen. In diesem Bericht wird die Verwendung von BaseScope, eine neu entwickelte Technologie, die kurze antisense Oligonukleotide in RNA ISH beschäftigt beschrieben als Expressionsmuster in Maus Gehirn Abschnitten zu analysieren. Exon 23a der Neurofibromatose Typ 1 (Nf1) dient als ein Beispiel zur Veranschaulichung, dass kurze Exon-Exon-Junction-Sonden robuste Hybridisierung Signale mit hoher Spezifität in RNA ISH Analyse auf Maus Gehirn Abschnitte aufweisen. Noch wichtiger ist, können Signale mit Exon Aufnahme und überspringen-spezifische Sonden erkannt verwendet werden, die Werte von Nf1 Exon 23a Ausdruck in verschiedenen anatomischen Bereichen des mausgehirns einer gespleißt Prozent zuverlässig berechnen. Die experimentelle Protokoll und Berechnungsmethode für die Analyse werden vorgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass BaseScope bietet ein leistungsfähiges neues Tool als Ausdruck Muster in Situbewerten.

Einleitung

Alternatives Spleißen (AS) ist ein gemeinsamer Prozess, der auftritt, während der Pre-mRNA-Reifung. In diesem Prozess kann ein Exon differentiell in Reife mRNA aufgenommen werden. So kann durch AS, ein Gen viele mRNAs, dass Code für verschiedene Proteinprodukte generieren. Es wird geschätzt, dass 92 – 94 % der menschlichen Gene alternative Spleißen¹^,²unterziehen. Abnorme Alternative Spleißen Muster ergab sich aus genetische Mutationen zu einer Vielzahl von Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, myotonische Dystrophie und Krebs³^,⁴in Verbindung geb....