Eine Microphysiologic Plattform für menschliches Fett: weißen Fettgewebe eingeklemmt

Zusammenfassung

Weißen Fettgewebe (WAT) hat kritische Mängel in seiner aktuellen Primärkultur Modelle, pharmakologischen Entwicklung und metabolische Studien zu behindern. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine adipöse Microphysiological System durch sandwichartig WAT zwischen den Blättern der Stromazellen Zellen zu produzieren. Diese Konstruktion bietet eine stabile und flexible Plattform für WAT Primärkultur.

Zusammenfassung

Weißen Fettgewebe (WAT) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Gesundheit Gewicht und jeden Tag. Dennoch gibt es erhebliche Einschränkungen verfügbar Primärkultur Modelle, die versäumt haben, treu der adipösen Mikroumgebung rekapitulieren oder WAT Lebensfähigkeit über zwei Wochen hinaus zu verlängern. Das Fehlen eines verlässlichen Primärkultur Modells behindert stark Forschung in WAT Stoffwechsel und Arzneimittelentwicklung. Zu diesem Zweck haben wir NIH Normen eines Microphysiologic-Systems zur Entwicklung einer neuartigen Plattform für WAT Primärkultur genannt "SWAT" (Sandwich weißen Fettgewebe) genutzt. Wir überwinden den natürlichen Auftrieb der Adipozyten durch sandwiching Hackfleisch / WAT Cluster zwischen den Blättern von Fettgewebe abgeleitet Stromazellen Zellen. In diesem Konstrukt sind WAT Proben tragfähige über acht Wochen in der Kultur. SWAT unterhält die intakte ECM, Zell-Zell Kontakte und physischen Druck der in Vivo WAT Bedingungen; Darüber hinaus unterhält SWAT eine robuste transkriptionelle Profil, Sensibilität für exogene chemische Signal- und ganze Gewebefunktion. SWAT stellt eine einfache, reproduzierbare und effektive Methode der adipösen Primärkultur. Möglicherweise ist es eine breit anwendbar Plattform für Forschung im WAT-Physiologie, Pathophysiologie, Stoffwechsel und pharmazeutischen Entwicklung.

Einleitung

Fettgewebe ist das primäre Organ von Fettleibigkeit, die direkte jährlichen medizinische Kosten zwischen $ 147 Milliarden und $ 210 Milliarden in die US-¹trägt. Die Ansammlung von Fettgewebe trägt auch zu anderen führenden Todesursachen wie Herz-Kreislauferkrankungen, Diabetes Typ II und bestimmte Arten von Krebs². In-vitro- Kultur-Modelle sind essentiell für metabolische Studien und Entwicklung von Medikamenten, aber aktueller Forschungsmodelle von Fettgewebe haben erhebliche Mängel. Adipozyten sind zerbrechlich, lebhaft und unheilbar differenzierte Zellen, die Zelle Kultur Kunststoffe nicht halten, und daher k....

Protokoll

Alle Aufgaben wurden in Einhaltung der Protokolle #8759 "und" #9189 durchgeführt, wie von der IRB Office LSUHSC-NO. genehmigt Alle tierische Arbeit erfolgte unter Einhaltung Protokoll #3285 genehmigt vom Büro IACUC in LSUHSC-Nr.

(1) Aussaat von Sandwiching Zelle Blätter

Hinweis: Siehe Abbildung 1.

1. Samen ADSCs bei ca. 80 % Konfluenz in Gewebekultur Platten (6 cm oder 6-Well Platten). Für jede Vertiefung von SWAT gewünscht, Saatgut, 1 konventionelle Gewebekultur gut und 1 gut von entsprechender Größe auf Poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm)-beschichtete Gewebe-Kultur Kunststo....

Ergebnisse

Lebensfähigkeit des SWAT wurde zunächst durch serielle Hellfeld Darstellung der einzelnen WAT Cluster beurteilt (n = 12) über ca. 7,6 Wochen. Cluster blieb auf der Monolage während dieser Zeit gesichert. Leichte morphologische Veränderungen beobachtet mit einzelnen Adipozyten leicht verziehen oder Positionen verschieben. Jedoch Adipozyten weder zu multilocular im Laufe der Zeit, zeigt einen Mangel an Entdifferenzierung, noch haben sie weisen keine sichtbaren Zeichen des Zelltods wie zellu.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von ADSCs zu Sandwich menschlichen weißen Fettgewebe; menschlichen ADSC-Zell-Linien können über gut etablierte Protokolle¹⁵isoliert werden. Jedoch kann das System für individuelle Forschungsanforderungen (z. B. mit 3T3L-1-Zellen, Sandwich Maus WAT) angepasst werden. Dieser Prozess beinhaltet Umgang mit primären menschlichen Gewebes. Standard-Sicherheitsvorkehrungen sollten eingesetzt werden; menschliche Gewebe als BSL-2 Krankheitserreger (z. B. HIV,.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10x HBSS	Thermofisher	14185052
Gelatine	Sigma-aldrich	G9391
Kollagenase	Sigma-aldrich	C5138
Adenosin	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	Thermofisher	11995065
M199 Medium	Thermofisher	11043023	Phenol rotfrei
250 &Mikro; m Siebfilter	Pierce	87791
0,2 µ m Spritzenvorsatzfilter	Celltreat	229747
5 mL Luer-Lok Spritzen	BD	309646
Unterlegscheiben Dies sind einfache Unterlegscheiben			aus Metall, die in jedem Baumarkt gekauft werden können. Sie fügen einfach ein geringes Gewicht auf der Rückseite der Pluger hinzu, um einen gleichmäßigen Kontakt zwischen Zellen und Gelatine zu gewährleisten, während sie gleichzeitig einfach zu lagern und zu sterilisieren sind. Ungefähre Masse: 6,3 g & nbsp;
Name<	strong>Unternehmen	Katalognummer<	strong>Kommentare
>Beheizte Ausrüstung
Inkubierter Orbitalschüttler	VWR	10020-988	Proben sollten in einem Winkel von 45° geneigt werden, um den Kollagenaseaufschluss zu erleichtern
Wärmeblock			Auf 37-40 ° C und unter
Wasserbad-Set			auf ~75 &° gestellt; C
Name	Unternehmen	Katalognummer<	strong>Kommentare
Specialized Plastics
Upcell Schalen 6cm 6-Multiwell	Nunc	174902  oder 174901	Dabei handelt es sich um handelsübliche pNIPAAm-beschichtete Schalen, die zum Züchten des oberen Blechs von ADSCs verwendet werden können. Alternativ können pNIPAAm-beschichtete Platten im Labor hergestellt werden. Durchmesser: < 6 cm für 6 cm Schale, < 3,5 cm für 6-Well-Platte; Ungefähre Masse: 6,7 g für 6-cm-Schale, 5,1 g für 6-Well-Platte
Kolbenapparatur			aus Kunststoff Diese können so geformt werden, dass sie in die gewünschten pNIPAAm-beschichteten Kunststoffe (Multiwell-Platten, Petrischale) passen. Sie bestehen aus einem einfachen Stiel, der an einer kreisförmigen Scheibe befestigt ist. Sie können im Labor oder von jeder anderen Einrichtung hergestellt werden, die Acrylkunststoffe herstellen kann

Die dem der Biosicherheitswerkbank