Summary
흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.
Abstract
흰색 adipose 조직 (WAT)은 무게와 매일 건강을 조절에 중요 한 역할을 한다. 아직도, 모두 충실 하 게 정리 지방 microenvironment 또는 2 주 이상 와트 생존을 연장 하지 사용할 수 있는 기본 문화 모델에 상당한 한계가 있다. 신뢰할 수 있는 주 문화 모델의 부족은 심각 하 게 와트 대사 및 약물 개발에 연구를 방해 한다. 이 위해 우리 와트 주 문화 라는 'SWAT' (샌드위치 백색 지방 조직)에 대 한 새로운 플랫폼을 개발 하는 microphysiologic 시스템의 NIH의 표준 활용 있다. 우리는 지방이 많은 파생 된 stromal 세포 시트 사이 다진된 와트 클러스터 사이 여 adipocytes의 자연 력 극복. 이 구문에서 와트 샘플 가능한 이상 8 주 문화에 있다. 스와트 유지 그대로 ECM, 셀 연락처 및 물리적 압력 조건의 vivo에서 와트; 또한, 기동 강력한 transcriptional 프로필, 외 인 화학 신호 및 전체 조직 기능에 감도 유지 합니다. SWAT의 주 지방 문화, 재현성, 간단 하 고 효과적인 메서드를 나타냅니다. 잠재적으로, 그것은 와트 생리학, 병 태 생리학, 물질 대사, 및 제약 개발 연구에 대 한 광범위 하 게 적용 가능한 플랫폼입니다.
Introduction
지방 조직 미국1$147 십억 $210 십억 사이 연간 직접 의료 비용 운반 비만의 주 기관 이다. 지방이 많은 직물의 축적은 또한 심장 질환, 2 형 당뇨병, 그리고 특정 유형의 암2등 죽음의 다른 주요 원인에 기여. 생체 외에서 문화 모델 대사 연구와 신약 개발을 위해 필수적입니다 하지만 지방이 많은 직물의 현재 연구 모델 주요 결함. Adipocytes, 부 력, 그리고 말기 분화 세포를 세포 문화 플라스틱에 고착 하지 않을 것 이다 따라서 기존의 셀 문화 방법을 사용 하 여 경작 될 수 없습니다. 1970 년대 이후, 여러 가지 방법이 사용 되었습니다 시도에서 유리 coverslips, 천장, 현 탁 액 문화, 문화와 세포 외 매트릭스3,,45, 의 사용을 포함 하 여 이러한 장벽을 극복 하기 위해 6 , 그러나 7., 이러한 방법은 세포 죽음과 dedifferentiation, 의해 표시 된 하 고 그들은 2 주 연구 기간 보다 더 일반적으로 사용 됩니다. 또한,이 모델을 시도 하지 않는다 그들은 그대로 ECM을 유지 하지 않는, adipocytes 사이 고 stromal 상호 작용 지원 셀도 수축 힘 셀에 에서 vivo에서 발휘로 네이티브 지방 microenvironment 정리 와트.
골드 표준 기본 지방 문화 방법의 부재, 지방 연구는 차별화 된 사전 adipocytes (diffAds)에 주로 의존 했다. DiffAds multilocular, 부착, 그리고 metabolically 활성 있습니다. 대조적으로, 기본 흰색 adipocytes 단원제의 nonadherent, 그리고 상대적으로 낮은 신진 대사를 보여 줍니다. 건강 한 성숙 지방 조직 생리학 정리 현재 지방 문화 모델의 실패 가능성이 FDA 승인 약품을 직접 대상으로 adipocytes의 부재에 주요 요인입니다. 사실, 기관 모델 physiologic 생체 외에서 부족 대부분 장기 및 질병에서 중요 한 문제입니다.
Microphysiological 시스템 (MPS) 프로그램의 생성을 발표의 위치 종이, 국립 보건원 (NIH) 모든 인간의 제약 임상 시험 통해 2013 성공률은만 18 단계 II에 대 한 %와 50% 단계 III에 대 한 보고 임상 시험8. MPS 프로그램은 직접 모델 인간의 생리를 생체 외에서 monoculture의 무 능력을 해결 하기 위해 설계 되었습니다. NIH 문화 시스템 인간의 기본 또는 기관 기능 정리 다세포 3D 구문에서 줄기 세포의 구성으로 MPSs를 정의 합니다. 균질, 불멸 하 게 한 세포 배양의 reductionist 모델과 달리 MPSs-셀, 마약 셀, 약물-약물, 및 장기 약물 상호 작용9모델 정확 하 게 한다. 단기 주 문화 메서드와 달리 NIH 기준 MPS 지속 문화8에서 4 주 이상 지정합니다. MPS 프로그램의 자세한 내용은 NIH의 댓글은 (#RFA-엉-18-001)10에서 찾을 수 있습니다.
우리 간단 하 게, 소설, 적응력, 개발 하 고 저렴 한 지방 의원 "백색 지방 조직에 끼여" 되 나 (기동)11. 우리는 지방이 많은 파생 된 stromal 세포 (줄기) (그림 1) 시트 사이 "붙여" 다진된 기본 지방 조직으로 adipocytes의 자연 력 극복. 결과 3D 구조 셀 연락처 및 네이티브 지방 microenvironment 자연 체형 지원 세포 인구를 가진 성숙한 adipocytes 주변으로. 스와트 8 주 생존, exogenous 신호, adipokine 분 비, 및 동물 모델로 engraftment 응답으로 검증 되었습니다.
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Protocol
LSUHSC-NO. IRB 사무실에 의해 승인 된 프로토콜 #8759 #9189, 준수 모든 작업 수행 했다 모든 동물 작품 프로토콜 #3285 IACUC 사무실 LSUHSC-호에 의해 승인 준수에서 수행 되었다
1. 셀 시트 끼우기의 시드
참고: 그림 1을 참조 하십시오.
- 씨 줄기 조직 문화 접시 (6 cm 또는 6 잘 플레이트)에 약 80 %confluency. 스와트 원하는 각 잘 잘 1 기존의 조직 문화 및 조직 문화 poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) 코팅 플라스틱 접시에 해당 크기의 1 잘 씨앗.
참고: 따라, 스와트 6 잘 플레이트 필요 합니다 한 6-잘 표준 조직 배양 플레이트 (기본 레이어)에 셀과 하나의 조직 문화 6-잘 pNIPAAm 코팅 접시 (상위 계층) 시드. pNIPAAm 코팅 접시 상업적으로 구입하실 수 있습니다 또는 실험실에서12,,1314를 생산. - 37 ° C, 5% CO2 에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10 보충에서 줄기를 유지 하 고 1 %FBS 페니실린/스. x 미디어 매 2 일 변경.
- 때까지 그들은 100% 합칠 되 고 전기 패턴 (약 6-8 일)에 합체를 셀 수 있습니다.
참고: 이러한 셀 부 력 지방 조직 안정화 위해 단일 그대로 셀 시트 작동 해야 합니다. 충분 confluent 셀 와트와 시드 시 조각화 됩니다.
2입니다. 기동 장치의 준비
- 준비 몇 10 mL aliquots의 1 x 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS); 여분의 볼륨 번호판의 원하는 수 만큼 준비 합니다.
-
스와트 시드에 플런저 장치를 준비 합니다. 줄기는 둥근 디스크에 연결 된로 구성 된 간단한 아크릴 플라스틱을 사용 하 여 플런저를 생성 합니다. 그것은 조직 문화 우물의 둘레에 맞는지 확인 (직경: < 6 cm 접시, 6 cm < 6 잘 플레이트에 대 한 3.5 c m, 대략적인 질량: 6 cm 접시, 6 잘 플레이트에 대 한 5.1 g 6.7 g).
- 프로시저 실행 것을 원활 하 게 경우에 어떤 개별 플런저와 함께 문제가 되도록 추가 plungers를 준비 합니다.
- 플런저 디스크의 가장자리 주위 랩 테이프 감아 젤라틴 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 적어도 2 배.
- 스프레이 biosafety 내각 (BSC) 70 %EtOH. 스프레이로 빈, 세척제 15 mL 원뿔 튜브; BSC 내부 15 mL 원뿔 튜브 랙 튜브는 젤라틴 plungers의 위치를 확보 하는 데 도움이 됩니다.
- 스프레이 각 테이프 포장 플런저 철저 하 게 70 %EtOH 장소 선반에 15 mL 원뿔 튜브로. 금속 와셔 (대략적인 질량 6.3 g)를 살포 하 고 한 쌍의 갈고리 집게; 함께 선반에 그들을 두십시오 와셔 기동 시드 중는 plungers에 무게를 추가 합니다.
- BSC 창틀 닫고 UV 빛 건조 및 살 균을 설정 합니다.
참고: 이상적으로, 기동 뿌리기 전에 24 h이이 단계를 수행 합니다. 또는, 과정 조직 컬렉션/기동 시드; 요일에 실시 그러나,이 경우에, UV 건조/살 균에 대 한 15-45 분 수 있습니다.
3. 젤라틴 Plungers 준비-상단 셀 시트 응용 프로그램
- 75 ° c 물 목욕을 열
-
1 x HBSS의 10 mL 재고 젤라틴 분말의 0.75 g을 추가 하 여 젤라틴 솔루션을 준비 합니다. 증기 두건에서 1 M NaOH 솔루션의 산도 균형의 100 µ L를 추가 합니다.
- 물 목욕을 10 mL 주식을 추가 하 고 분말 솔루션으로 해소 될 때까지 5 분에 적극적으로 악수. 가루 젤라틴 온수 물 목욕에 추가 후 곧 해산을 목표로 합니다.
- BSC 송풍기, UV 빛 해제 켜고 틀 마련. BSC 표면 스프레이 공급 (5 mL luer 잠금 주사기와 0.2 µ m 주사기 필터) 필터를 준비. 효율적으로 변형 적용할 plungers 젤라틴의 충분 한 볼륨에 여러 개의 필터를 준비 합니다.
- 젤라틴 솔루션 도달할 때 동질적인 일관성, 필터링 솔루션을는 plungers에 적용 됩니다. 젤라틴으로 주사기를 로드 합니다. (6-잘 접시 ~2.5 mL, 6 cm 요리에 대 한 ~4.5 mL) 주사기 필터를 통해 플라스틱 plungers를 젤라틴을 적용 하 고 (~ 20 분)을 강화 하기 위해 허용.
- 젤라틴은 고체, 일단은 plungers의 가장자리에서 테이프를 풀 다. 갈고리 집게와 플런저의 외부 가장자리에서 젤라틴을 제거 (즉, 초승달 모양의 제기 가장자리). 플런저의 센터에 남아 있는 젤라틴 완전히 수준 인지 확인 ADSC 시트와 접촉을 최대화 하기 위해.
- 일단 초과 젤라틴을 제거 하 고, 부드럽게 ADSC pNIPAAm 코팅 판 젤라틴 plungers 적용 됩니다. 금속 와셔를 사용 하 여 플런저를 누르다. plungers를 적용 하는 동안 셀 시트를 전단 하지 마십시오.
-
실 온에서 1.5 h에 대 한 셀 시트에는 plungers를 둡니다. 접시/plungers pNIPAAm 코팅 판 표면에서 셀 시트의 분리를 완료 하는 데 1.5 h에 대 한 얼음 물 목욕에서 품 어.
- 얼음 목욕; 잠복기 동안 주의 인큐베이션 기간 동안 셀 미디어 오염 얼음 목욕을 허용 하지 않습니다.
- 부 화 완료 후 비 살 균 물 제거 pNIPAAm 코팅 접시의 바닥을 청소.
4. 백색 지방 조직 처리
- 수술 실에서 인간 지방 조직 때, 기동 시드할 수 때까지 얼음에 있는 무 균 용기에 모든 샘플을 계속. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 등의 살 균 유지 보수 미디어 조직 안정성에 대 한 지방 조직 컨테이너를 추가 합니다.
- 추가 될 각 잘/요리 1.5 mL microcentrifuge 관에 찬 세포 배양 시드 (6-잘 접시 100 µ L, 6 cm 요리 200 µ L).
-
지방이 많은 직물을 말하다.
- 단단한 지방 조직 세그먼트에 대 한 다음과 같은 할.
- 지방이 많은 직물 3의 큰 세그먼트를 세척 살 균 PBS에 x 제거 가능한 많은 PBS.
- 개의 집게와 면도기 살 균 티슈를 말하다 고 많은 맥 관 구조 및 가능한 근 막 제거 (자세한 내용 참조).
- 잘게 다진된 조직 두께, 액체 일관성에 때까지 면도칼으로 지방을 말하다.
참고: 이상적으로 조직이 나타납니다 와트의 없음 표시 개별 세그먼트와 동질적인이 항상 가능한.
- Lipoaspirate를 다음과 같이 처리 합니다.
- BSC에서 비 커, 위에 멸 균 거 즈 테이프 하 고 모든 초과 액체를 수집 하는 큰 비 커에이 비이 커를 배치 합니다.
- 25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 필요에 따라 많은 lipoaspirate 그리고 멸 균 거 즈의 표면에 그것을 적용. Lipoaspirated 지방 질을 세척 하 고 과잉 혈액 및 지질 잔류물 제거 하이 표면에 직접 PBS를 적용 합니다.
- 집게를 사용 하 여 물기 조직 복구, 살 균 고기 저 미 표면에 그것을 전송 하 고는 lipoaspirate를 말하다.
- 단단한 지방 조직 세그먼트에 대 한 다음과 같은 할.
- 살 균 면도기를 사용 하 여 전송 다진된 조직; p1000 피 펫 팁의 선단부를 잘라 이 체형 lysis로 이어질 수 있는 전단 응력을 최소화 합니다. 일단 적절 한 조직의 일관성 (300-400 µ L 6-잘 접시, 6 cm 접시 500-600 µ L) 각 1.5 mL 튜브에 다진 조직의 원하는 볼륨을 전송. 다진 와트와 튜브에 짧게 미디어 믹스.
-
기본 ADSC 격판덮개를가지고 고 가만히 따르다 aspirate 미디어. 각 1.5 mL 튜브에서 와트/미디어 혼합물에 미디어를 바꿉니다.
- 부드럽게 pNIPAAm 코팅 접시에서 젤라틴 plungers를 제거 하 고 기본 ADSC 접시에 와트 혼합물에 적용. 세포질 분리 확인 현미경 pNIPAAm 코팅 접시의 단층을 검사 합니다.
- BSC에서 약 37-40 ° C에 열 블록을 설정 합니다. 장소에 아직도 plungers, 번호판 열 블록의 표면에 이동. 셀을 품 어 젤라틴 용 해 촉진을 따뜻하게 문화 미디어의 2-3 mL를 추가 합니다.
- ~ 30 분 후 부드럽게 플레이트 표면에서는 plungers를 제거 합니다. 기본 조직 문화 접시의 뚜껑을 대체 하 고 셀 문화 인큐베이터로 이동. 젤라틴은 37 ° C에서 완전 하 게 액 화, 일단 발음 하 고 세포 배양을 바꿉니다.
- 37 ° C, 5% CO2 에 7 µ M 인슐린, 30 µ M dexamethasone, 1 x 페 놀 레드 무료 M199 매체에 유지 하는 기동 페니실린/스. 약 2 mL 미디어 6 잘 플레이트 및 6 cm 요리 3 mL에에서 유지 합니다. 미디어 매 2 일 변경.
5. 기동 수확
- 콜라 (0.5 mg/mL 콜라, PBS에 500 nM 아데노신) 준비 15 mL 원뿔 튜브 (10 mL의 대략적인 볼륨)에서 aliquots. 튜브를 고정 하 고-20 ° c.에서 그들을 저장합니다
- 셀에서 모든 문화 매체를 발음, PBS, 1 x를 세척 하 고 PBS 발음. 37 ° C 물 욕조에 녹고에 의해 콜라 aliquots를 준비.
참고: 이상적으로, 콜라 솔루션 도달 37 ° C; 즉시 그 후, 조직을 추가 합니다. -
스와트 접시에서 개별 aliquots 모든 조직을 추가 합니다. 스와트 멸 균 셀 scrapper를 사용 하 여 수확 하 고 잘라 p1000 피 펫 팁 콜라 aliquots에 전송. 조직 콜라 솔루션을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 직접 추가 합니다.
- 또는, 50 mL 원뿔 튜브; 조직/콜라 혼합물을 품 어 증가 된 노출 영역 추가 효소 소화를 촉진 한다.
- 45 ° 각도로 incubated 궤도 셰이 커에 샘플 튜브를 배치 합니다. 30-60 분 동안 37 ° C에서 200 rpm에서 품 어.
- 장소는 250 µ m 컬렉션에 대 한 새로운 15 mL 원뿔 튜브로 필터 메쉬. 필터를 통해 소화 체형 솔루션을 붓는 다.
참고:이 섬유 조직에 밖으로 필터링 하는 동안 통과 하는 모든 셀을 허용할 것 이다. - 단계 분리 수 있도록 실 온에서 5 분 동안 앉아 통해 흐름 수 있습니다.
참고:는 adipocytes 됩니다 플 로트 솔루션의 상단에 지방 stromal 세포 (ASCs) 낮은 단계에 정착 하는 동안. 500 x g 에 5 분 동안 원심 분리 세포 분리 또는 펠 릿에 줄기를 둘러싼 수확에도 극대화할 수 있습니다. -
컷오프 p1000 피 펫 팁을 사용 하 여, 1.5 mL microcentrifuge 컬렉션 튜브 adipocytes (콜라 솔루션의 상단에 떠 있는 레이어) 전송. 한 번에 ~ 250 µ L를 복용, 플라스틱 튜브를 수집 하는 adipocytes의 가장자리를 따라 천천히.
- 셀 내부에 준수의 복구를 최대화 하기 위해 adipocytes 수집 하면서 튜브를 천천히 회전 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 전체 때까지 더 많은 셀을 그리기 유지.
- 바늘 (~ 21 G)에 부착 된 주사기를 사용 하 여 격리 adipocytes에서 과잉 액체를 제거 합니다. 부동 체형 레이어에서 바늘 잠수함 짧게 준수 니 들 축 하 셀을 꺼내 려 니 들 선동 하 상단에 떠 빠질된 adipocytes에 대 한 기다립니다.
- 천천히 adipocytes의 의도 하지 않은 제거 되지 않도록 주의 하면서 초과 액체를 그립니다. Microcentrifuge 튜브 졸업식 지속적으로 샘플 볼륨을 사용 하 여 (예:. 0.1 mL 각 샘플에 대 한)입니다.
- 격리 된 셀을 사용 하 여 DNA/RNA 추출, 포도 당 통풍 관 분석 결과, 분석 결과 lipolysis, 등
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Representative Results
SWAT의 처음 개별 와트 클러스터의 직렬 명시 화상 진 찰에 의해 평가 되었다 (n = 12) 약 7.6 주 동안. 클러스터에이 시간에 걸쳐 단층에 보안 남아 있었다. 약간의 형태학 상 변화는 개별 adipocytes 약간 휘게 하거나 위치 이동으로 관찰 되었다. 그러나, adipocytes도 될 multilocular 시간이 지남에 dedifferentiation의 부족을 나타내는 그들은 셀룰러 blebbing, 세포, 또는 조각화 (그림 2)와 같은 세포 죽음의 가능한 증상을 전시 했 어. 클러스터의 체형 id 2 주 오래 된 지질 얼룩 나 일 빨강 (NR)과 특수 기동 대에 확인 되었다. 이들은 실제로 그대로 막 보다는 유물, cysts, 또는 죽은 adipocytes adipocytes 표시 분명 NR 단원제의 체형 클러스터의 얼룩. NR 주변 ADSC 시트에 얼룩의 부재는 이러한 셀 하지 지질 축적 하 고 따라서 하지 차별화 adipogenic 혈통으로 (그림 3a) 스스로 나타냅니다. Propidium 요오드 화물 얼룩 53 일 된 기동에서 수행 되었다. 고급 timepoints에서 체형 클러스터 내에서 얼룩의 세포 죽음 (그림 3b)의 부족을 보여줍니다. 오일-레드-O (오로) 얼룩 기동 adipocytes 고급 timepoints (그림 3c) 에서도 그대로 adipocytes와 생존 유지 나타내는 고정된 체형 클러스터 내에서 지질 얼룩 지역화와 51 일 된 기동에서 수행 되었다.
Immunocytochemistry (ICC)는 예상된 단백질 표정 및 기동 내 성숙한 체형 마커의 지역화 수행 되었다. 그대로 기동 접시 PPARγ2 perilipin (ab3526, 1: 200 희석)에 대 한 항 체로 얼룩진 했다 (사우스 캐롤라이나-166731, 1: 100 희석), 및 FABP4 (ab92501, 1:1,000 희석). 12 일 된 SWAT의 공초점 이미지의 지질 작은 물방울 표면 (그림 4a) 주위 perilipin 예상된 지역화 시연. 형광 현미경 검사 법 3 일 된 기동 지질 카운터 얼룩 BODIPY의 설명 (그림 4b), 세포질 내에서 FABP4 지역화와 겹치는 신호 PPARG와 DAPI에서 얼룩 핵 ( 에 PPARG 지역화 그림 4 c).
스와트 transcriptional 프로필 여러 과목에서 시드 조직에서 평가 되었다 (n = 4 기증자). 수집, 지방이 많은 직물의 부분 사용 되었다 초기 RNA 추출 (d0), 나머지는 사용 하는 동안 씨앗 기동 번호판. 이 접시 다음 24 h, 14 일, 그리고 28 일 스와트 문화에서 수확 했다. 원스텝 양이 많은 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-정량) 전사 레벨을 결정 하기 위해 수행 되었다. 6 키 체형 유전자 조사 했다: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL, 및 ADIPOQ (그림 5). ACTB는 내부 제어로 사용 되었다 그리고 transcriptional 수준 주제 일치 기준선 (d0) 식의 %로 표현 했다. 모든 유전자 레벨 아래쪽으로 시간이 지남에 동향 않았다 비록 SWAT에서 강력한 전사를 설명 했다. 우리는 우리가 토론 섹션에서 자세히 설명 하는 대로 transcriptional 프로필 추가 미디어 최적화 향상 될 수 있는 관찰 믿습니다.
기저 내 분 비 기능 transcriptional 프로필에 사용 하는 동일한 문화에 평가 했다. 상쾌한 기동 격판덮개에서 수집 및 leptin 수준을 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) (ab100581)를 활용 하 여 측정 했다. 스와트 일 1, 14, 28 (그림 6a)에서 기저 leptin 분 비 표시. ADSC 시트 컨트롤 (즉, 어떻게 와트 없이 ADSC 시트)로 기동 접시와 병렬로 유지 되었다. Leptin 분 비 이러한 컨트롤 (데이터 표시 되지 않음)에 감지 되지 않을 수 있습니다.
기동 시간이 지남에 유도할 수 있는 대응에 대 한 용량을 유지할 수 있는 여부를 확인 하려면 lipolysis 조사 되었다 (n = 4). 를 유도할 수 있는 lipolytic 용량을 평가 하려면 갓 수집된 와트 (d0)의 일부는 다진 고 adipocytes 효소 고립 되었다 (와 유사한 프로토콜 섹션 5에서 기동 수확), 반면 나머지 기동 접시를 시드하는 데 사용 되었다. 절연된 adipocytes 2% 지방-산 성-무료 소 혈 청 알 부 민 HBSS에서 100 µ M 산림, 1 µ M 피 네 프 린, 또는 제어 버퍼의 300 µ L에서 37 ° C에서 3 h에 대 한 인 큐베이 팅 했다. 수집 된 미디어에 글리세롤 레벨 무료 글 리세 린 시 약으로 측정 되었다. 기동 다음 1 및 5, lipolytic 용량 했다 같은 방식으로 평가 하는 일에 수확 했다. 화학 자극 증가 글리세롤 릴리스 모두에서 크게 3 timepoints (그림 6b): 치료 adipocytes의 글리세롤 릴리스 82 ± 46 %d0 와트에 증가 했다 (p = 0.01), 1 일 기동 577 ± 387% (p = 0.02), 그리고 5 일 기동 348 ± 343% (p = 0.03). 자극된 adipocytes에 글리세롤 수준 모든 3 개의 timepoints에서 매우 유사 했다 의미: 기본 와트 5.2 ± 0.8, 1 일 기동 4.4 ± 1.9과 5 일 기동 4.8 ± 1.8 µ g 글리세롤/mg 총 단백질. 평균 글리세롤 레벨 컨트롤 (즉, 기저 lipolysis) 기동 수확 셀에 비해 갓 수집된 와트 (d0)에서 상대적으로 높았다. 이것은 외과 절단, 실험실, 그리고 닦지를 전송 하는 동안 d0에서 와트 조직에 스트레스를 증가 원인일 수 있습니다. 그러나, 이러한 실험 1 또는 5 일 갓 수집된 와트에 비해 기동 lipolytic 용량에 아무 축소를 보여 줍니다.
스와트 이식 및 마우스 모델에서 복구 수 입증 되었다 (n = 4)의 복잡 하 고, 전체 조직 기능 데모. 그것은 또한 가능한 응용 프로그램 플랫폼의 한 연구원 조직 동물 모델에 이식 하기 전에 와트에서 생체 외에서 조작 하는 기동을 활용 하고자 한다. 스와트 교양 10 일 이었고; 표준 프로토콜을 활용 하 여 수확 스와트 격판덮개에서 절연된 adipocytes 다음 1 mL 주사기 (바늘) 없이 로드 되었습니다. 절 개는 immunocompromised eGFP 표현 쥐 (끄 덕 임 등 쪽 피부 아래 되었다. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ)입니다. 이 작은 지 느 러 미 피하 포켓에 기동 교양 adipocytes, 주사기로 주입 했다 고 주머니를 다음으로 봉합을 만든 폐쇄. 10 일 후 이식 후 생쥐 희생 했다. 이식 명확 하 게 볼 수 있었고, 쉽게 복구 (그림 7a). 복구 된 이식 및 마우스 contralateral 지방 창 고 고정 했다, 파라핀 포함 하 고 구분. Immunohistochemistry는 GFP (A10262, 1: 100 희석), 그리고 인간의 PLIN (사우스 캐롤라이나-390169, 1: 100 희석)에 대 한 1 차 항 체와 sectioned 슬라이드에서 수행 되었다. 선택한 안티 PLIN 항 체는 인간의 PLIN 하지만 하지 마우스 얼룩 실험적으로 검증 된다. 복구 된 이식에서 adipocytes 인간의 adipocytes 예상된 범위는 크기에서 약 50-120 µ m 이었고 GFP (그림 7b)에 대 한 완전 하 게 부정 했다. 그러나, 약 31%는 adipocytes의 호스트에 성공적인 engraftment를 나타내는 인간의 plin 베스트에 대 한 긍정적인 했다. 마우스 지방 창 고에서 adipocytes 20-40 µ m, GFP와 완전히 완전히 긍정적인 얼룩 동안 마우스 adipocytes, 일치는 인간의 PLIN (그림 7c)에 대 한 부정적인 크기 했다. (아니 어떻게 와트)와 ADSC 시트 셀 문화 요리에서 긁어 되었고 컨트롤로 마우스에 이식. 그러나, 이러한 모든 복구 가능한 조직 (데이터 표시 되지 않음)을 생성 하지 않았다. 이 복구 된 adipocytes 교양된 SWAT, 그리고 차별화 된 인간의 줄기의 아닌 결과에서 성숙 했다 나타냅니다.
그림 1:이 기동 방법. (a) 회로도의 기동 pNIPAAm 코팅 조직 문화에서 ASCs eGFP 레이블 시트의 전송을 보여주는 요리 ASCs 표준 조직 배양 접시에 성장의 두 번째, 레이블이 시트에. 다진, 주 인간의 와트 2 ASCs 시트 사이 끼워 넣으면은. (b) 형광 현미경 관찰법, GFP, 및 설명 하는 기법으로 만든 특수 기동 대의 병합 된 채널 설명에 (a). 눈금 막대 = 100 µ m. (c) 디지털 사진 대표, 5 일 된 기동 표준 6 잘 플레이트에 경작의. 와트의 큰 볼륨 우물의 바닥에 안정적으로 확보 된다. 그림은 라우 외에서 수정 됩니다. 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 기동 가능한 문화에서 8 주에 남아 있다. 직렬 명시 이미징 단일 기동 클러스터의 55 일 동안 세포 죽음 일치 morphologic 변경 보여 줍니다. 바 규모 = 100 µ m. 그림 라우 외에서 수정. 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 특수 기동 대 50 일 이상에서 가능한 남아. (한) 나 일 레드 얼룩 얼룩 제한 기동 라이브 가능한 adipocytes 나타내는 15 일에 대 한 교양을 보여 줍니다. Stromal 세포를 둘러싼 얼룩 하지 않았다. 그림은 확대, 그리고 눈금 막대 X 40 = 100 µ m. (b) Propidium 요오드 화물 (PI) 얼룩 스와트 53 일 밝혀 완료할 PI 제외, 교양 나타내는 아무 체형 죽음; 눈금 막대 = 100 µ m. (c) 오일-레드-O는 51의 얼룩 일 된 기동 보여줍니다 adipocytes를 중립 지질 제한 체형 세포 막의 장기적인 안정성을 나타내는. 그림은 라우 외에서 수정 됩니다. 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Immunocytochemistry 기동 예상된 지역화와 성숙한 체형 셀 표식에 대 한 긍정적으로 얼룩을 보여 줍니다. (한) Confocal 현미경 검사 법 2 주 된 SWAT의 인간의 PLIN + 단원제의 세포를 지질 방울 표면에 지역화와 밝혔다. 눈금 막대 = 100 µ m. (b) 형광 현미경 검사 법 3 일 된 SWAT의 지역화를 세포 핵과 세포질 및 (c) 가진 + 셀에 지역화와 인간 FABP4 + 셀 공개. 눈금 막대 = 100 µ m. 그림 라우 외 에서 수정 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 기동 키 체형 정체성 유전자 발현을 유지 한다. 스와트 클러스터 콜라 1, 14, 및 문화와 유전자 식에서 28 일 실시간 정량 Pcr에 의해 결정 소화 했다. 실시간 정량에 1 일 된 및 14 일 된 기동 (는) PPARG, (b) FABP, (c) (d) CbEBPA, (e) LPL HSL의 높은 수준을 유지 하는 방법을 보여 줍니다 및 (f) ADIPOQ. ACTB 참조 유전자로 사용 되었다. 오차 막대 표준 오류 =. 그림은 라우 외. 에서 수정 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 기동 basally adipokines secretes 고 순수 카 테 콜 아민 자극. 24 h 기저 leptin 분 비의 (한) ELISA 정량화 문화에 28 일 후 아니 중요 한 변화를 보여줍니다. 갓 수확된 기본 와트에 상당한 glycolytic 응답을 생성 하는 (b) 피 네 프 린 및 산림 아드레날린 자극 (1.7 x) 주제 일치 스와트 문화에서 1 ~ 5 일에. 주 1 기동 응답 6.3-fold 증가와 카 테 콜 아민 자극 기저 분해를 통해 기저 분해에 3.3-fold 증가 보여준 하루 5 기동 하는 동안. 자극된 분해 스와트 일치 신선한 와트에 비해 크게 다른 아니었다 (p = 0.53, n = 4). 오차 막대 표준 오류 =. 그림은 수정 된 라우 외. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 기동 reimplanted 수 비보에, 전체 조직 기능 보존 시연. (한) 기동 immunocompromised 마우스 (별표)으로 이식 후 쉽게 시각된 10 일 이었다. 기동 하지 성공적으로 이식 했다, 10 일에 의해 괴 사 성 기동 것가지고 되었습니다 액 화. 복구 된 특수 기동 대의 (b) 섹션 설명 했다 eGFP-큰, 단원제의 adipocytes (직경 50 ~ 120 µ m). 31.3는 adipocytes의 %를 사용 했다 인간의 PLIN +. 인간의 PLIN + adipocytes 작게, 작은 adipocytes는 전송의 살아남을 가능성이 더 인 간에 있는 지방 이식의 임상 관찰과 맞는 것 이라고는 경향이 있었다. 눈금 막대 = 100 µ m, 200 배 확대. (c) Contralateral 지방 패드 같은 쥐에서 가져온 훨씬 작은 adipocytes (20-40 µ m)를 시연 하 고 인간의 PLIN. 눈금 막대 = 100 µ m, 200 배 확대. 그림은 라우 외 에서 수정 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 세부 샌드위치 인간의 흰색 adipose 조직; 줄기를 사용 하 여 인간의 ADSC 셀 라인 잘 설립 프로토콜15를 통해 격리 된 수 있습니다. 그러나, 시스템 (3T3L-1 셀 샌드위치 마우스 와트를 사용 하 여) 등 개별된 연구 요구 사항에 맞게 수 있습니다. 이 프로세스는 기본 인간의 조직 처리 해야 합니다. 표준 안전 예방 조치를 고용 한다; 인간의 조직 BSL-2 병원 체 (예: HIV, HepC)로 처리 합니다. 만 조직 BSC에서 직접 처리 합니다. 기관 안전 표준에 의해 규정으로 모든 적절 한 보호구를 착용-이중 장갑 사용 하지 않는 것이 좋습니다. 제대로 모든 공급을 소독 하 고 폐기물 10% 표 백제 솔루션 또는 70% 에탄올 솔루션 재사용 하거나 처분 하기 전에.
스와트 문화에서 중요 한 첫걸음 조달 이며 pNIPAAm 코팅 조직 배양 배지를 유지. 이러한 플레이트 상업적으로 사용할 수 있습니다 또는 설립된 방법12,,1314를 통해 생산 될 수 있습니다. 이 접시는 온도 응답 셀 문화 화면. 임계 온도 (~ 32 ° C), 위에 표면 소수 이며 셀 것입니다 준수, 조직 문화에 대 한 다른 대우 플라스틱 비슷합니다. 그러나,이 임계 온도 아래 표면 친수성 되 하 고 셀16플라스틱 표면 해리 것입니다 키를 누릅니다. As a result, 주의 해야 설정할: 전체 confluency (즉, 일반 미디어 변경 시)와 2) 젤라틴으로 온도 낮추기 위해 필요한 시간을 도달 하기 전에 주어진된 셀 종류는 단층에서 해리 하는 1) 얼마나 빨리 전체 셀 시트 분리 되도록 플런저 pNIPPAm 코팅 접시에 적용. 37 ° C로 예 열 하는 미디어와 미디어 변화를 수행 한다 셀 빠른 분리 하는 경향이 있다면, BSC에서 37 ° C로 설정 열 블록에 미디어 변경 내용을 수행 합니다.
두 번째 중요 한 단계는 기동 시드를 위한 준비가 지방 조직 처리 합니다. 우리가 우리의 특성화 소독된 집게와 소독된 면도기 와트를 닦지 수행 합니다. 그러나, 인간의 근 막 면도칼으로 쉽게 삭감 될 수 없습니다. 체형 근 비율을 극대화 하는 것은 장기적인 기간 동안 가능한 기동 내에서 많은 지방 조직 유지 하는 것이 중요. 그대로 근 막의 큰 조각을 함께 기동을 유지 하기 위해 필수적인 줄기와 adipocytes, 사이 세포 세포 접촉을 막을 것 이다. 근 막의 과도 한 양의 "스레드 풀링" 효과 가질 수도 있습니다. 반면 단일 와트 클러스터 인접 클러스터를 영향을 주지 않고 한 접시에서 해리 수, 근 막에 의해 연결 된 여러 클러스터는 기동을 잘 사용할 수 없게 렌더링 하는 단층에서 충분 한 클러스터를 가져올 수 있습니다. 와트의 기계화 닦지 포함, 지방 흡입으로 근 막 수술 동안 잘게 다진은이 문제를 우회할 수 있습니다. 그러나, 지방 흡입, 중 환자는 정기적으로 치료 피 네 프 린;의 고용량으로 조직 (및 후속 실험)이이 치료의 가능한 결과 연구 기간 동안 차지 해야 합니다.
스와트 문화에 마지막 중요 한 단계는 실험적인 문화 미디어를 선택 하 고 있다. 우리는 표준 셀 문화 정립을 활용 하 여 우리의 초기 특성 실험을 수행 (10 %FBS, 1 DMEM에 페니실린/스 x). 그러나, 사용할 수 문학에 기초에 관한 특수 배합 사용 극대화 체형 전사, (7 µ M 인슐린, 30 µ M dexamethasone, 1 x M199 미디어에 페니실린/스)17. 이 초기 단계의 전사, 하지만 시간이 지남에 따라 감소 수준 향상. 우리 본문에, adipocytes 다양 한 화학 신호에 노출 되는 때문에이 종종 하루에 걸쳐 먹이 굶 어 간에 사이클링 믿습니다. 따라서, 그것은 더 최적화 우리의 세포 배양을 보충 하 여 시간이 지남에 관찰된 transcriptional 프로필을 개선 가능 해야 합니다.
스와트 수확 (프로토콜, 섹션 5) adipocytes 문화에서 분리, 샘플 볼륨을 감소 하 고 주변 ADSC 시트 간섭을 제거 합니다. 이 체형 (즉 단백질 또는 핵 산 격리에 필요한) 균질, 붙일 수 있습니다 또는 그대로의 기능 분석 실험 (예: 해당 분해 또는 포도 당 통풍 관 분석 실험) adipocytes. 또는, 그대로 기동 플레이트 ADSC 시트 착 과정을 통해 단층에 와트 클러스터 보호를 수 있는 immunocytochemical 얼룩이 지기에 대 한 수확 될 수 있습니다. 이 경우에, 문화 미디어 발음 및 표준 프로토콜을 통해 전체 문화를 수정. 그러나, 이미징 3D 체형 클러스터를 병합 하 여 결과 이미지 품질을 개선 하기 전에 유리 coverslip를 추가 하는 것이 좋습니다.
우리는 기동 플랫폼 검사 약물으로 주요 잠재력이 믿습니다. 기술은 간단 하 고 재현성, 그리고 기존의 조직 문화 접시를 활용. 따라서, 약물 검사 실험 문화 매체에 약리학 활성 화합물을 추가 하 여 실행 됩니다. Adipocytes는 유전자 발현, epigenetic 프로 파일, 인슐린 감도, 등 문화 매체 환경 독 소의 추가 adipocytes에 그들의 효과 검사 하는 데 사용 마찬가지로 수 화합물의 효과 검사 하기 다음 수확 수 있습니다. 기동 시간이 지남에 개별 체형 클러스터를 추적 하는 연구 때문에, 그것은 고유 adipocytes phenotypic 변화를 보이는 게 치료 평가 적합 합니다. 눈에 띄는 예를 들어 인간의 체형 "브라우닝," 어떤 점에서 흰색, 지질 저장 체형 된다 "갈색" 또는 유사한 thermogenic, multilocular 갈색 체형18것입니다. 이것은 마우스 모델, 하지만 결코 인간에서에서 입증 되었습니다 잠재적으로 주요 임상 관련성의 현상입니다. 스와트에 공동 경작된 유사 또한 엄청난 연구 잠재적인 개최. 기동 표준 셀 문화 우물을 이용 하는 자연적인 공동 문화 시스템 이다. 따라서, 하나는 붙여 셀을 변경 하거나 조직 문화 막 삽입을 이용 하 여 다른 임상 관련 세포 유형 사이 adipocytes를 유지할 수 있습니다. 예를 들어 hepatocytes 약물을 통해 지방 조직에 도달 하기 전에 필터링 화면 상단 붙여 셀 시트 작동 수 있습니다. 마찬가지로, adipocytes 암 병 리에 어떻게 공헌 하는지 검사 하는 기동을 통해 암 세포 막 삽입에 성장 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 프로젝트 자금 LSU 건강 과학 센터에 의해 제공 하는 제도적 지원 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250 µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2 µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5 mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75 °C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
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