Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

In Vivo Photolabeling von Zellen im Darm wandernden Potential der hämatopoetischen Zellen bei Neugeborenen Mäusen zu bewerten

5.5K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/57929

⸱

10. August 2018

 ,  , 
1Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das hier beschriebene Protokoll nutzt einen Photolabeling Ansatz bei Neugeborenen Mäusen gezielt Immunzellen identifizieren, die aus dem Dickdarm in extra Darm Websites auszuwandern. Diese Strategie werden Host-Microbiome Interaktionen in den ersten Lebensjahren zu untersuchen.

Zusammenfassung

Magensaftresistente bakteriengemeinschaften sind schon früh im Leben etabliert und Immunzelle Entwicklung und Funktion zu beeinflussen. Die neonatale Mikrobiota ist anfällig für zahlreiche äußere Einflüsse, einschließlich Antibiotika-Einsatz und Ernährung, die Anfälligkeit für Autoimmun-und Entzündungserkrankungen auswirkt. Erkrankungen wie entzündliche Darm-Krankheit (IBD) zeichnen sich durch einen massiven Zustrom von Immunzellen in den Darm. Immunzellen, die bedingt durch die Mikrobiota können jedoch zusätzlich aus den Darm zu beeinflussen Immunreaktionen an extra Darm Standorten auswandern. So, gibt es eine Notwendigkeit zu identifizieren und zu charakterisieren, Zellen, die mikrobielle Nachrichten aus dem Darm zu distalen Seiten tragen können. Hier beschreiben wir eine Methode, um beschriftungszellen in den Darm des Neugeborenen Mäusen in Vivo , die ihre Identifizierung an extra Darm Standorten nach der Migration ermöglicht.

Einleitung

Der Säugetiere Magen-Darm-Trakt beherbergt Hunderte von Arten von Bakterien, die in einer symbiotischen Beziehung mit dem Host1vorhanden sind. Die Immunzellen vorhanden im lokalen Umfeld ein friedliches Zusammenleben mit dieser Mikroben zu erzwingen und eine schützende Barriere gegen Erreger Invasionen zu etablieren. Bi-direktionale Interaktionen zwischen den Immunzellen und die Mikrobiota sind so entscheidend für eine Kommensale Gemeinschaft zu etablieren, die bildet das Immunsystem des Wirts und setzt die Schwelle für immune Reaktivität gegenüber Krankheitserregern. Änderungen in der mikrobiellen Zusammensetzung oder Dysbiose, stören die Immunsystem Homöostase und Radardetektoren Regelkreise, die Darm-Entzündungen zu immunvermittelte Erkrankungen wie Typ-1-Diabetes und IBD2,3 zurückhalten .

Die Zeit unmittelbar nach der Geburt eine einmalige Entwicklung in der intestinalen mikrobiellen Gemeinschaften beginnen, zur gleichen Zeit das Immune System zu etablieren reift4. Die postnatale Mikrobiota ist nicht stabil, mit Verschiebungen in der Zusammensetzung natürlich vorkommenden und häufig5. Die Immunzellen, die Interaktion mit der Mikrobiota befinden sich in zwei unterschiedlichen anatomischen Standorten im Darm - Lamina Propria und dem Darmepithel6. Zahlreiche Arten von Immunzellen sind im Darm, einschließlich Lymphozyten (z. B. T-Zellen, B-Zellen und angeborene Lymphzellen) sowie myeloische Zellen (die dendritischen Zellen, Monozyten und Makrophagen enthalten). Diese Zellen, auch bekannt als hämatopoetischen Zellen führen eine Vielzahl von Funktionen, die bewahren die Darmbarriere und Homöostase aufrechtzuerhalten.

Neben ihrer regulatorischen Funktionen im Darm Websites können immune Zellen der Schleimhaut auch mikrobielle Nachrichten zu den extra Darm Sites, systemische Immunität7,8,9Regeln durchführen. Dies ist ein Bereich des wachsenden Forschungsinteresses und unterstreicht die Notwendigkeit der Methoden zur Ermittlung von Immunzellen, die aus intestinalen Gewebe migrieren, um ihre Funktion zu prüfen. Das Protokoll hier berichtet nutzt eine handelsübliche Maus-Modell in dem ein Photoconvertible fluoreszierendes Protein Label Zellen genutzt wird. PhAMherausgeschnitten Mäuse express ubiquitär ein grünes fluoreszierendes Dendra2 Protein, das irreversibel auf rote Fluoreszenz bei Aktivierung durch ultraviolette (UV) Licht10umgestiegen ist. Verwenden eine Faser-Optik-Kanüle, um 405 nm Licht in den Darm des Neugeborenen Mäusen zu liefern, zeigen wir, dass die Photoconverted hämatopoetischen Zellen, die ihren Ursprung in oder Durchreise durch den Darm in der Milz gefunden werden können.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle tierische Verfahren wurden mit Zustimmung und unter Einhaltung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) am Massachusetts General Hospital durchgeführt.

Achtung: Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von einem Laser der Klasse 3 b (LG3). LG3 Laserschutzbrillen müssen immer verwendet werden, wenn diese Laser in Betrieb. Entsprechende Schulung und Sicherheit Richtlinien befolgt werden, um das Risiko von Verletzungen zu vermeiden.

1. Aufbau und Montage von Laser

  1. Schließen Sie die Leuchtdiode (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fasergekoppelte) der LED-Treiber über die 4-polige M8 Stecker Kabel, das kommt beigefügt, die LED. Sorgfältig die Schraube um die Verbindung zu befestigen.
  2. Vor dem Anbringen der optogenetik Patchkabel an die LED, halten Sie den Connector Öffnung der LED für das Licht, um sicherzustellen, dass keine sichtbare Hindernisse sind. Schlag auf das Loch, alle Hindernisse zu beseitigen, falls erforderlich und die optogenetik Patch-Kabel in die Öffnung einführen.
  3. Schließen Sie Fiber optic Kanüle durch einführen der Kanüle in beiden Enden der Steckverbinder Hülse an die optogenetik Patch-Kabel an. Legen Sie das andere Ende des Ärmels Connector auf Patch-Kabel.  Genügend Druck zu sichern die Verbindung aber nicht verbiegen oder brechen die optische Faser in die Kanüle vorsichtig sein.
    Hinweis: Die fragile Fiber optic Kanüle wird mit der Schutzkappe behandelt, wenn der Laser nicht benutzt wird.
  4. Stellen Sie die LED-Treiber in den kontinuierliche Welle (CW) Modus mit den kontinuierlichen Einstellknopf auf 0 und die Strombegrenzung auf 1,2 A. festgelegt

(2) Ladungszustand der Zellen im Darm

Hinweis: Männliche und weibliche Mäuse wurden Intracolonic 405 nm Licht noch 1-2 Tage nach ihrer Geburt ausgesetzt und wurden geopfert, vor 1 Woche alt.

  1. Einem dunklen Ort mit einem Zugang zu einer Steckdose zu sichern. Schließen Sie das LED-Netzteil an die Steckdose.
    Hinweis: Dieses Verfahren erfolgt in dem minimalen weißen Licht wie eine längere Belichtung der Mäuse an das Umgebungslicht eine unerwünschte Ladungszustand der Zellen führen kann. Rotes Licht wird als Alternative verwendet.
    Achtung: Der folgende Schritt bezieht den Gebrauch eines Tieres Narkose. Die Verwaltung des Betäubungsmittels erfolgt in Klasse II Kapuze oder mithilfe einer anderen geeigneten Aufräumvorgang Systems. Die Inhalation des Betäubungsmittels kann Schwindel, Benommenheit oder sogar Bewusstlosigkeit führen.
  2. Die Maus durch die Einwirkung von 4-5 % Isofluran in 100 % O2 in einer Induktion-Box zu betäuben. Überprüfen Sie richtige Tiefe der Narkose durch fest Kneifen eine Hinterpfote (keine Antwort). Pflegen Sie Anästhesie über eine bugnase bei ca. 2 % Isofluran. Verhindern Sie Handler Exposition gegenüber Isofluran durch Verwendung einer geeigneten Haube oder Narkose Aufräumvorgang Gerät.
  3. Position der narkotisierten Maus für die Intracolonic Belichtung mithilfe von 1 hand Scruff die Rückseite der Maus sanft mit dem Zeigefinger und dem Daumen. Schalten Sie die Maus über den Bauch aussetzen. Lösen Sie den Griff, wenn die Maus fängt an, seine rosa Farbe verlieren oder ihre Atemfrequenz beginnt sich zu verlangsamen. Sichern Sie das Ende der Maus zwischen dem Ring und kleinen Finger.
  4. Entfernen Sie mit der anderen Hand die Schutzkappe von der Kanüle. Unter Beibehaltung der Längsachse parallel zur Mittellinie der Maus, der Kanüle sanft legen Sie Fiber optic Kanüle durch den Anus in den Darm so, dass alle 5 mm der Lichtleitfaser sind im Inneren der Maus.
    Hinweis: Dieser Vorgang erfolgt langsam und mit Sorgfalt nicht auf die Kolon Wand zu perforieren. Minute wackeln und Verdrehen der Kanüle hilft bei die Weiterentwicklung in den Darm.
  5. Don die Schutzbrille und erhöhen Sie den Laser auf den maximalen Wert (ganz im Uhrzeigersinn). Bestätigen Sie die Anwesenheit von UV-Licht durch das Betrachten des transluzenten Bauches der Maus.
    Hinweis: Die LG3 Laserschutzbrillen verringern drastisch Sichtbarkeit. Haben ein Kollege (tragen Schutzausrüstung) helfen bei der Brille anziehen und Einschalten des Lasers.
  6. Setzen Sie dem Doppelpunkt, das Laserlicht für insgesamt 2 min. zurückziehen der Kanüle ca. 1 mm alle 30 s, der luminalen Umgebung ausgesetzt, das Licht zu maximieren. Am Ende von 2 min schalten Sie den Laser aus.
  7. Entfernen Sie die Kanüle langsam von der Maus. Nach der Genesung von Anästhesie in einem leeren Käfig warm, die Maus zu Hause Käfig zurück

3. Isolation von Darm-Lymphozyten

  1. Bereiten Sie 1 L die Hank ausgewogen Salz Lösung/Kalb Serum (HBSS/CS) Puffer, 200 mL von epithelialen Streifen Puffer, 500 mL waschen Medien und 200 mL Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-freie Medien zu waschen.
    Hinweis: Die Reagenz Mengen sind für eine Stichprobengröße von 9 berechnet.
    1. Machen Sie den HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS) durch Zugabe von 50 mL CS bis 950 mL HBSS. Bewahren Sie es auf dem Eis.
    2. Vorbereiten des epithelialen Streifen Puffers [HBSS; 5 % CS; 5 mM EDTA; 1 mM Dithiothreitol (DTT), 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-Ethanesulfonic Säure (HEPES) (pH 7,2-7,5)] durch Zugabe von 10 mL CS 200 µL des DVB-t, 2 mL 0,5 M EDTA und 3 mL 1 M HEPES-Puffer 1 M bis 185 mL von HBSS. Ort der epithelialen Streifen-Puffer in einem 37 ° C-Wasserbad.
    3. Machen Sie waschen-Medien (HBSS, 1 % CS, 1 mM EDTA) durch Zugabe von 5 mL CS und 1 mL 0,5 M EDTA auf 494 mL HBSS. Bei Raumtemperatur lagern.
    4. Bereiten Sie die EDTA-freie Wäsche Medien (HBSS; 1 % CS 15 mM HEPES vor) durch Zugabe von 2 mL CS und 3 mL 1 M HEPES auf 195 mL HBSS. Bei Raumtemperatur lagern.
    5. Machen einen FACS-Puffer [1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,2); 2 % CS] durch Zugabe von 10 mL CS bis 490 mL PBS. Bewahren Sie es auf dem Eis.
  2. Bereiten Sie das Gewebe Sammlung Gericht, indem man ein 70 µm Zelle Sieb in der Kulturschale 60 x 10 mm. Das Gericht 10 mL HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS Puffer im Schritt 3.1.1 hergestellt und auf Eis gelagert) hinzu, und legen Sie es auf dem Eis.
  3. Der Maus über eine Überdosierung von inhalativen Isofluran mit entsprechenden Aufräumvorgang von Narkose einschläfern (ein ca. 3 min Exposition gegenüber > 4 % Isofluran in der Raumluft oder 100 % O2). Nach dem scheinbaren Einstellung der Atmung und reflex-Bewegung, die Abwesenheit von tiefen Schmerz durch eine Hinterpfote fest kneifen zu überprüfen (mit Pinzette wird empfohlen). Stellen Sie sicher der Euthanasie über eine Enthauptung mit der Chirurgische Schere oder ein neues Rasiermesser.
    Hinweis: Zervikale Dislokation empfiehlt sich nicht für diesen Schritt aufgrund der Größe und Alter des Tieres. Diese Methoden sind im Einklang mit den 2013 AVMA Richtlinien über Sterbehilfe und von der MGH IACUC genehmigt.
  4. Ernten Sie den Doppelpunkt mit saubere Zange und Schere um den Bauch zu öffnen. Spiegeln Sie den Darm zu 1 Seite der Maus Abdomen Dickdarm aussetzen. Entfernen Sie den gesamten Dickdarm durch erste transecting es nur distal (in Richtung des Afters), der Blinddarm. Verwenden Sie dann während fest greifen den Darm mit der Pinzette, Schere, Schneiden durch die Harnröhre, den Enddarm. Schneiden Sie den Doppelpunkt als in der Nähe des Afters wie möglich. Ernte die Milz nach dem Entfernen des Dickdarms (siehe Schritte 4.1-4.2 unten).
    Hinweis: Während der Ladungszustand Protokoll nur ~ 25 % der Neugeborenen Colon (5 mm der Fiber optic Kanüle) richtet, ist der gesamte Dickdarm geerntet, um die Zelle isoliert zu unterstützen.
  5. Reinigen Sie den Doppelpunkt mit Zange um den Inhalt aus dem Dickdarm und auf einem trockenen Papiertuch zu schieben. Das Gewebe mit Rasierklingen fein hacken des Dickdarms zu einer Paste auf dem Cover von einer Kulturschale und übertragen diese Paste in die Zelle Sieb in der Petrischale zu homogenisieren.
  6. Fügen Sie eine saubere 8 mm lange magnetische Stir Bar in das Sieb und legen Sie die Schüssel auf einen 9-Position Magnetrührer Teller. Die magnetische Stir Bar Geschwindigkeit auf 800 u/min und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur. Den Puffer zu verwerfen und mit 10 mL HBSS/CS (die HBSS; 5 % CS Puffer im Schritt 3.1.1 vorgenommen und gespeichert auf dem Eis) zu wiederholen. Verwerfen Sie den Puffer am Ende des SPÜLPROGRAMMS.
  7. Die Epithelzellen durch Zugabe von 10 mL vorgewärmte epithelialen Streifen Puffer (die HBSS 5 % CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM HEPES [pH 7,2-7,5] Puffer, der war im Schritt 3.1.2 hergestellt und gelagert in einem Wasserbad von 37 ° C) in die Zelle Sieb zu distanzieren und bei 800 u/min für 30 min in einem 3 rühren 7 ° C Inkubator. Am Ende der Inkubation übertragen des Puffers bereichert in der epithelialen Fraktion um eine saubere 15 mL-Tube.
    Hinweis: Das Epithel und die zugehörigen Zellen (intestinale Epithelzellen und der intestinalen epithelialen Lymphozyten) sind in den Puffer veröffentlicht, während die Zellen in die intakte Lamina Propria auf die Zelle Sieb während dieser Schritt11bleiben.
    1. Zentrifugieren Sie den angereicherten intestinalen epithelialen Bruch (Lal) 700 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL der FACS-Puffer. Bewahren Sie es auf dem Eis für Schritt 3.15.
  8. Waschen den Lamina Propria Bruch innerhalb der Zelle Sieb 2 X mit HBSS/CS. Dazu die Zelle Sieb 10 mL HBSS/CS-Lösung (HBSS; 5 % CS Puffer, die im Schritt 3.1.1 gemacht wurde, die auf dem Eis gespeichert wurden) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 5 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.
  9. Waschen Sie die Probe 2 X Waschen Medien. Die Zelle Sieb 10 mL waschen Medien (HBSS, 1 % CS, 1 mM EDTA Puffer, die im Schritt 3.1.3 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert wurde) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 15 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.
    1. Bewahren Sie nach der Verwendung waschen Medien es auf dem Eis für den Einsatz im Schritt 3.14.
  10. Waschen Sie die Probe 2 X mit HBSS/CS Zelle Sieb 10 mL HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS Puffer in 3.1.1 Schritt gemacht, der auf dem Eis gespeichert wurde) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 5 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.
  11. Inkubieren Sie das Gewebe in EDTA-freie Waschpuffer. Fügen Sie 10 mL EDTA-freie Waschpuffer (HBSS; 1 % CS 15 mM HEPES-Puffer, der in Schritt 3.1.4 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert wurde) in die Zelle Sieb und inkubieren Sie die Platte für 10 min bei Raumtemperatur ohne sich zu rühren. Verwerfen Sie den Puffer am Ende dieses Schrittes.
  12. Waschen Sie die Probe 2 X mit HBSS/CS und bereiten Sie die Enzymlösung. Fügen Sie 10 mL HBSS/CS (HBSS; 5 % CS Puffer gemacht synchron 3.1.1 auf Eis gespeichert wurde) in die Zelle Sieb Puffern und rühren Sie es mit 800 u/min für 10 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.
    1. Vorbereiten der Enzymlösung (EDTA-frei waschen Puffer; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL Kollagenase) während der zweiten Periode waschen: 9 mg hinzufügen der DNase I und 15 mg gefriergetrockneten Kollagenase, 90 mL EDTA-freie Puffer waschen. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur.
  13. Die Lamina Propria Bruchteil enthalten in der Zelle Sieb Lamina Propria Lymphozyten (Vormerkung) zu verdauen. Fügen Sie 10 mL der Enzymlösung (EDTA-freie Waschpuffer; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL Kollagenase Puffer in Schritt 3.12.1 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert) in die Zelle Sieb und rühren Sie es mit 800 u/min für 45 min in einem Inkubator 37 ° C.
    Hinweis: Vormerkung gelangen in die Lösung nach der enzymatischen Verdauung.
    1. Sammeln Sie das Enzym-Lösung enthält die Zellen zu und Filtern sie durch eine neue Zelle Sieb in ein 50 mL konische Röhrchen.
  14. Die gefilterten Zellen zu blockieren, die Kollagenase-Aktivität in der Enzymlösung fügen Sie 20 mL kaltwäsche Medien (die HBSS; 1 % CS; 1mM EDTA Puffer im Schritt 3.1.3 gemacht und gespeichert auf dem Eis im Schritt 3.9.1 hinzu). Zentrifugieren Sie das Rohr auf 700 X g für 6 min bei Raumtemperatur. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Pellets, die Vormerkung in 1 mL der FACS-Puffer enthalten.
  15. Kombinieren Sie IEL (aus Schritt 3.7.1) und die LPL (aus Schritt 3.14) Brüche und Färben sie mit Leuchtstoff-konjugierten Antikörpern für die durchflusszytometrischen Analyse (siehe Schritt 5).
    Hinweis: IEL und LPL Fraktionen können separat gefärbt werden, wenn Fach Informationen gewünscht wird.

4. Isolierung von Lymphozyten aus der Milz

  1. Bereiten Sie das sammelröhrchen durch Zugabe von 500 µL FACS Puffer zu einem Microcentrifuge Schlauch. Bewahren Sie es auf dem Eis.
  2. Nach dem Entfernen des Dickdarms (Schritt 3.4), Ernten Sie die ganze Milz und legen Sie sie in das sammelröhrchen. Speichern Sie das Gewebe auf dem Eis.
  3. Mit Hilfe einer elektrischen Gewebe-Homogenisator, Homogenisieren der Milz in einem Microcentrifuge Schlauch für ca. 1 min. Zentrifuge der Probe bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand.
  4. Führen Sie die Lyse der roten Blutkörperchen durch resuspending der Probenmaterials in 500 µL Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer, Zelltod durch osmotische Lyse zu initiieren. Lassen Sie die Probe 1-2 min bei Raumtemperatur inkubieren und es dann in 725 µL FACS Puffer aufzuwirbeln.
  5. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand. Aufschwemmen Sie das Pellet in 500 µL Puffer FACS und Filtern sie durch ein Sieb 40 µm Zelle zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch. Die gesamte Probe zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen und Färben Sie es mit Leuchtstoff-konjugierten Antikörpern für die durchflusszytometrischen Analyse (siehe Schritt 5).

5. Identifizierung von Dendra-R+ Zellen mittels Flow Cytometry

  1. Zentrifugieren Sie IEL/LPL und Milz Proben bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand.
  2. Aufzuwirbeln Sie die Pellets in 100 µL Antikörper Färbung Mischung. Vorbereiten des Antikörpers Färbung Mischung durch Zugabe von 1 µL eindringmittel konjugierten Anti-CD45 Antikörper zu 100 µL FACS Puffer pro Probe.
    Hinweis: Es ist wichtig, die Antikörper für die Durchflusszytometrie vor dem Experiment zur Bestimmung der optimalen Konzentration wo tritt verbindlich Sättigung verwendet titrieren.
  3. Inkubieren Sie die Proben auf Eis (an einem dunklen Ort) 35 min.
  4. Aufschwemmen Sie die Proben in 300 µL Puffer FACS und Zentrifugieren sie 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Proben in 325 µL FACS-Puffer. Analysieren Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Ein LWL-Kabel wurde verwendet, um 405 nm Licht in die Doppelpunkte der 2 - Tage alten PhAMherausgeschnitten Mäuse zu liefern. In bisherigen Experimenten wurde eine 30 s Belichtung entschlossen, einen maximalen Ladungszustand der Doppelpunkt Zellen mit minimalen Zytotoxizität (Abb. 1A) zu geben. Daher wurden sequenziellen 30 s Forderungen der verschiedenen Segmente des Dickdarms durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben. Im Anschlu...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die Identifizierung und Charakterisierung von Zellen, die Interaktion mit und sind beeinflusst durch die Mikrobiota im Dickdarm sind wichtig und sollten erleichtern Überblick darüber, wie Informationen aus der Schleimhaut Mikroumgebung für den Rest des Körpers weitergeleitet wird. Eine Methode zur Untersuchung im Zusammenhang mit dem Darm Zellwanderung erfordert die Isolierung des Darm-assoziierten Zellen, gefolgt von einen Adoptiv-Transfer in Empfänger Mäuse zu bestimmen, ihre Gewebe-Homing-Muster und1...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Nitya Jain wurde durch ein NIH/NIAID Career Transition Award-1K22AI116661-01 unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Laser
Leuchtdiode (LED)THORLABSM405FP1ACHTUNG: Hierbei handelt es sich um einen Laser der Klasse 3b. Bei der Verwendung des Lasers muss eine Schutzbrille getragen werden. Er emittiert eine Wellenlänge von 405 nm mit einem Strom von 1400 mA. Es ist fasergekoppelt. Es akzeptiert SMA-Anschlüsse. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 LED-Treiber
THORLABSLEDD1BTreibt einen konstanten Strom von 1200 mA durch den Laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616
Optogenetik PatchkabelTHORLABSM87L011 m langes Kabel mit SMA-Stecker. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454
Faseroptische KanüleDorische Linsen MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45mm lange Kanüle mit einem Außendurchmesser von 500 &μ; m und einem Innendurchmesser von 480 μm. Der NA-Wert beträgt 0,5. Die Zwinge ist Zirkonoxid, 1,25 mm Außendurchmesser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036
NetzteilTHORLABSKPS101Liefert 15 V mit einem Strom von 2,4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101
LG3 Laserschutzbrille THORLABSLG3Orange Gläser mit 47% Durchlässigkeit für sichtbares Licht https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523
RotlichtElektronenmikroskopie Wissenschaften74327-1015 W Lampe
https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciencesIsolierung von Darmzellen
IsofluranPatterson Veterinary07-893-1389ACHTUNG: Das Einatmen dieses Anästhetikums kann zu Schwindel, Schläfrigkeit oder sogar Bewusstlosigkeit führen. Dieses Anästhetikum sollte in einer Haube der Klasse II verwendet werden. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3
1X HBSSGibco14025076Ca/Mg frei https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076
KälberserumHyclone AZM197696
EDTAInvitrogen15575020Konzentration von 0,5 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020
DTTSigma10197777001ACHTUNG: gesundheitsschädlich beim Verschlucken und verursacht Hautreizungen. 1 M Konzentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US
HEPESGibco156300801 M Konzentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080
PetrischaleCorning353004https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F
70 Mikron ZellsiebFalcon352350https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712
Mikromagnetischer RührstabFisherbrand1451364Nach jedem Gebrauch in 70% Ethanol spülen. Vor jedem Gebrauch mehrmals in destilliertem Wasser abspülen. Die Stange ist 8 mm lang und hat eine achteckige Form. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364
MagnetrührplatteCorning Laborrührer440826https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE
KollagenaseRoche5401020001https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE
DNase ISigma10104159001https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US
1X PBSGibco20012-027https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027
PipettierhilfeThermo Scientific14387165https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165
serologische Pipette 10 mLFalcon357530https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
Serologische Pipette 25 mLFalcon357515https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
konisches Zentrifugenröhrchen 15 mLThermo Scientific339651https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
konisches Zentrifugenröhrchen 50 mLThermo Scientific339653https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Einzelzellsuspension
Eppendorf RöhrchenSeal-Rite1615-5500Fasst 1,5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx
GewebehomogenisatorKimbleK7495400000Benötigt 2 AA-Batterien. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000
Homogenisatorspitzen Kimble7495210590Kunststoff, 0,5 mL Spitzen https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590
ACK LysingpufferGibcoA10492-01https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01
40 Mikron ZellsiebFalcon08-771-1https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
Antikörper
BV786 Anti-Maus CD45 BD564225Klon 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225
Lebend/TotInvitrogenL34962https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962
Andere
Rasierer KlingenVWR55411-050Zur Enthauptung verwenden. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades
5

Referenzen

  1. Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
  2. Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
  3. Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
  4. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
  5. Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
  7. Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
  8. Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
  9. Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
  10. Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
  11. Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
  12. Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
  13. Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
  14. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

Markierung von KolonzellenMigration hämatopoetischer ZellenUV-Lichtexpositionfaseroptische Kanüleflusszytometrische AnalyseIsolation intestinaler LymphozytenVerdauung der Lamina propriaextraintestinales Trafficking
In Vivo Photolabeling von Zellen im Darm wandernden Potential der hämatopoetischen Zellen bei Neugeborenen Mäusen zu bewerten
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.