Summary
Här presenterar vi ett protokoll för kännetecknar monocyt delmängder av helblod flödescytometri. Detta inkluderar beskriver hur gate delmängder och bedöma deras uttryck för yta markörer och ger ett exempel på bedömningen av uttrycket av M1 (inflammatorisk) och M2 markörer (antiinflammatoriska).
Abstract
Monocyter är nyckelpersoner i olika inflammatoriska sjukdomar och ändringar till dessa celler, inklusive deras delmängd proportioner och funktioner, kan ha patologiska betydelse. En idealisk metod för att undersöka förändringar av monocyter är helblod flödescytometri som minimal hantering av prover av denna metod begränsar artefaktiska cellaktivering. Dock tas många olika metoder till gate monocyt delmängder vilket leder till inkonsekvent identifiering av delmängder mellan studier. Här visar vi en metod där helblod flödescytometri att identifiera och karakterisera mänskliga monocyt undergrupper (klassisk, mellanliggande och icke-klassisk). Vi beskriver hur man förbereda blodprov för flödescytometri, gate delmängder (säkerställa kontaminerande celler har tagits bort) och avgöra monocyt delmängd uttryck för yta markörer – i detta exempel M1 och M2 markörer. Detta protokoll kan utvidgas till andra studier som kräver en Usenets standardmetod för att bedöma monocyt delmängd proportioner och monocyt delmängd uttryck för andra funktionella markörer.
Introduction
Monocyter är en typ av vita blodkroppar som spelar en viktig roll i att främja och lösa inflammation. Det finns tre huvudsakliga grupper av monocyter erkända, Klassiskt (~ 85%), intermediär (~ 5%) och icke-klassisk (~ 10%) monocyter, som karakteriseras av deras nivå av kluster av differentiering (CD) 14 och CD16 uttrycket1. Proportionerna av monocyt undergrupper kan skilja sig med förekomsten av sjukdom, till exempel en ökad andel av intermediärer i olika inflammatoriska stater2,3 , inklusive kardiovaskulär sjukdom, där av intermediärer är associerade med kliniska händelser4,5. Dessutom i sjukdomstillstånd, kan monocyter också genomgå funktionella förändringar, med många förändringar upptäckas av en skillnad i ytan markör uttryck6,7. Ett sådant exempel är monocyt M1-skevning, en ökning av markörer associerade med M1 makrofager, som har observerats i hjärt-kärlsjukdom, diabetes, fetma och metabolt syndrom7,8,9 , 10.
Trots populariteten av flödescytometri att bedöma monocyt delmängd andel och funktion, finns det en betydande variation i provberedning och delmängd gating mellan studier vilket gör det svårt att jämföra resultaten mellan sådana studier. Ännu viktigare, det finns ingen konsensus i avgränsningen av monocyt delmängder, men en standardiserad metod är viktigt med tanke på den kliniska betydelsen av förändringar i delmängd proportioner i flera sjukdomar. En del av svårigheten att gating härrör från det faktum att monocyter skilja från den klassiska genom mellanliggande till den icke-klassiska delmängd11 och som sådan, monocyter existerar som ett kontinuerligt spektrum snarare än distinkta populationer12 . Intressant, visade Zawada et al. att använda antingen en rektangulär eller trapetsoid gating av mellanliggande delmängden, båda resulterade i en högre mellanliggande delmängd som förutspådde en kardiovaskulär endpoint13. Detta belyser att, åtminstone för beräkning av proportioner, nyckelfrågan tillämpning av en konsekvent Usenets strategi mellan olika prover (och studier), snarare än att försöka slutgiltigt diskriminera delmängder. Slutgiltiga gating kan vara viktigare vid bedömning av funktion, förändringen i markör uttryck mellan undergrupper är inkrementella12,14, och thus igen, konsekvens i gating är kanske nyckel. Som sådan, som ett mål som gating metod som reproducibly apportions monocyt delmängder mellan olika prover behövs. Syftet med den metod som presenteras här är att gate monocyt undergrupper med en tydlig förklaring och motivering till Usenets tekniken sysselsatt och bedöma delmängder för surface markör uttryck, vilket ger en metod som tillåter forskare att ha förtroende för användningen av denna teknik när man bedömer olika prover.
Protocol
Denna studie har godkänts av utskottet för WSLHD mänskliga forskningsetik (HREC) (godkännande AU röd HREC/15/WMEAD/289).
1. provberedning för helblod flödescytometri
Obs: Eftersom humanblod är potentiellt smittsam, prov set-up bör utföras med biohazard huva.
- Samla in blodprover från deltagarna i 3 mL eten diamine tetra ättiksyra (EDTA) rör.
- Bestämma antalet vita blodkroppar (WBC) använder en hematologi analyzer eller hemocytometer.
- Späd med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH ~ 7,4) justera koncentrationen till ~ 5 x 106 WBC/mL.
- Förbereda tillräckliga master mix för antalet rör (t.ex. för 14 rör, förbereda 16 x master mix) genom att kombinera 16 x volymer av 50 µL blod, 0,75 µL anti CD14-V450, 0,5 µL anti CD16-APC och 0,625 µL anti HLA-DR-PerCP. Vortex och pipett 51,9 µL av blandningen i varje provrör (tabell 1).
Obs: Antikroppar bör titreras för att fastställa optimala färgning koncentrationer för fluorescerande antikropparna används. - Lägga till surface markör (M1 och M2 eller isotypen kontroll, fykoerytrin (PE) märkt) antikroppar (exempel enligt tabell 2) och PE märkta markörer för T-celler (CD3), B-celler (CD19), neutrofiler (CD66b), och naturliga mördarceller (NK) celler (CD56) (tabell 3). Vortex och inkubera i 30 min, 4 ° C i mörker.
Obs: Markörer för lymfocyter, neutrofiler och NK celler ingår endast för validering av metoden Usenets. - Tillsätt 250 µL av kombinerade röd blod cell lysis/WBC fastställande lösning, vortex försiktigt omedelbart, och inkubera i 10 min i mörker vid 4 ° C.
- Tillsätt 250 µL av PBS och spin celler ner på 260 x g under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten, resuspendera cellerna i 300 µL av 1% formaldehyd.
Obs: Formaldehyd är giftiga. Använd nitrilhandskar och i dragskåp. - Förvaras vid 4 ° C skyddas från ljus tills analysen utförs.
Obs: Flödesanalys rekommenderas att göras inom 48 h för provberedning.
2. flödescytometri
- Kontrollera flödet cytometer logg att säkerställa anläggning personal har utfört kvalitetskontroller.
Obs: För att säkerställa konsekvens mellan analyser, instrumentet kvalitetskontroll och upprätthålla konsekvent mål fluorescens stödnivåer använder kontroll pärlor rekommenderas. - Ställ in flödet flödescytometri experimentet, klicka på ”nytt experiment och sedan” nytt prov ”och” nya tube ”att lägga rör. Välj bivariate tomter genom att klicka på ikonen och Använd rullgardinsmenyerna för att välja axis parametrarna. Se till att införandet av en CD16/CD14 tomt och en tomt visar en detektor tillsammans med tid att övervaka förvärvet.
- Sätt röret och klickar på ”Hämta”. Kontrollera instrument spänning inställningar Se till att detektorn signaler inte skalan.
- Iaktta cellerna faller i stadsporten monocyt i CD14/CD16 tomt. Ange inspelningen tröskelvärde till 5.000 händelser för klassiskt monocyt porten och klicka på ”Record”.
- Fortsätta att registrera data för resterande rör. När data för alla rör har registrerats, exportera flödesdata som .fcs-filer för analys.
Obs: För att säkerställa noggrannhet, enfärgad ersättning kontroller bör registreras. En kompensationsmatris kan beräknas och tillämpas på uppgifterna före analys att redovisa för spektral spill över15,16.
3. monocyt Gating
- Öppna filer i programvaran analys. Dubbelklicka på tube namn och välj parametrar från listmenyerna att visualisera cellerna på ett framåt scatter område FSC (A) / vidarebefordra spridningsdiagram höjd FSC(H). Skapa en dublett utslagning grind genom att klicka på verktygsikonen polygon gate och innesluter cellerna som i (figur 1A).
- Markera de gated cellerna (vid dubbel klickande på gated regionen) och i den nya displayen rutan justera dropdown menyn parametrar för att Visa cellerna på ett FSC (A) / side scatter SSC(A) tomt. Klicka på ikonen rektangulära gate och generöst Välj monocyt befolkningen baserat på framåt och side scatter boenden att utesluta majoriteten av lymfocyter och NK-celler granulocyter (figur 1B).
- Markera cellerna som gated och Visa på en CD14/CD16 tomt, välja parametrar med hjälp av rullgardinsmenyerna. Klicka på polygon grinden att välja monocyter baserat på deras karaktäristiska ”┐” form (figur 1 c).
- Markera cellerna som gated och Visa monocyter på en CD16/HLA-DR tomt genom att använda rullgardinsmenyerna välja parametrar. Klicka på polygon gaten för att markera cellerna som är positiva för HLA-DR och utesluta eventuella återstående NK celler och neutrofiler17 (figur 1 d).
- Markera cellerna som gated och Visa HLA-DR positiva cellerna på en CD14/HLA-DR tomt med dropdown menyer för att välja parametrar. Klicka på polygon grinden och rita en grind för att utesluta de HLA-DR hög/CD14 låg celler (B-celler uttrycker höga nivåer av HLA-DR men inte CD14) (figur 1E).
Obs: B cell kontaminering kan inträffa och därför bör utredas. Om den icke-klassiska befolkningen i figur 1 c inte är skild från cellerna till vänster, sedan är kontaminering troligt. Steg 3.5 förs.cykeletapper om B-celler inte överlappar med icke-klassisk monocyter. - Markera cellerna som gated och Använd rullgardinsmenyerna för att visa dem på en CD16/CD14 tomt. Från tomt alternativ väljer du ”Zebra plot” som kommer att möjliggöra monocyt delmängd gates dras för att avgöra delmängd proportioner (figur 1F).
Obs: om zebra tomt är inte tillgänglig på analys programvara, pseudo färg (mjuka) eller kontur tomt kan vara lämpliga. - Klicka på ikonen rektangulära gate och välj de klassiskt monocyter genom att rita en ungefärlig rektangulära grind runt CD14 hög/CD16 låg, klassiskt monocyt befolkningen. Välj ”Visa medianer” under ”Visa” att Visa median fluorescensintensiteten för klassiskt monocyter. Justera grinden så att befolkningen har en jämn fördelning från medianen på vänster och höger som omfattar alla celler till vänster.
- Välj den mellanliggande befolkningen genom att rita en rektangulär grind som omfattar cellerna till höger om klassiskt grinden. Justera botten av utfärda utegångsförbud för att utesluta de icke-klassiska cellerna genom att anpassa porten med botten av koncentriska cirklar som ligger helt inom klassisk monocyt grinden, som garanterar att den mellanliggande delmängden har ett CD14 uttryck jämförbar med den stora klassiska befolkningen överensstämmer med den aktuella nomenklaturen.
- Utfärda utegångsförbud för den icke-klassiska delmängden av Rita en rektangulär låda ner från den nedre kanten av den mellanliggande delmängd, markera alla celler till botten av befolkningen (figur 1F).
- Under ”Visa” väljer du ”Visa gate frekvenser” att bestämma procentandelen av varje monocyt delmängd.
4. validering av Gating metod
- För att avgöra om potentiellt smittsamt celltyper är effektivt gated-ut, först identifiera olika cellpopulationer med antikroppar mot T-celler (CD3), B-celler (CD19), neutrofiler (CD66b) och NK-celler (CD56) (figur 2).
Obs: Här T celler och neutrofiler inte sitta nära ”┐” formen av monocyter och är gated ute i figur 1 c. - Bekräfta att NK-celler tas bort i steg 3,4 (figur 1 d) och B-celler tas bort i steg 3.5 (figur 1E) som visas i figur 3. Om NK-celler eller B-celler inte är gated-out, och justera grindarna.
5. fenotypiska monocyt markör uttryck
- Markera celler från varje monocyt delmängd. Ändra rullgardinsmenyn parametrar för att skapa ett histogram för varje monocyt delmängd (figur 1F) visar varje markör och dess matchande isotyp (figur 4).
- Beräkna graden av uttryck för varje markör (median eller geometriska medelvärdet) jämfört med respektive isotypen kontroll.
Representative Results
Monocyt Usenets strategi och flödescytometri Flödesanalys används här (figur 1) framgångsrikt gated monocyt delmängder och avslöjade deras relativa proportioner. Proportioner (för detta prov) beräknades som 88,1% classicals, 4.33% intermediärer och icke 7.49%-classicals. Dessa delmängd gates var inte förorenade med B-celler, T-celler, neutrofiler eller NK-celler, som bekräftades med markörer CD19, CD3, CD56 och CD66b, respektive. Genom att bedöma den relativa positionen för andra populationer, är det tydligt att de T-celler och neutrofiler faller väl utanför monocyt ”┐” formen på en CD16/CD14 tomt (figur 2A och 2D). Dock både NK-celler och B-cells populationer överlappas med icke-klassisk monocyt befolkningen (figur 2B och 2 C). Trappan till Usenets strategin (figur 1 d och 1E) bekräftades för att utesluta den NK-celler (figur 3A) och B-celler (figur 3B). Även om B-cell befolkningen ingår en liten del av icke-klassisk monocyter, var beloppet försumbar.
Att ha inhängnad delmängder, graden som de uttryckte olika yta markörer, M1 (CD64 CD86 och CD120b) och M2 (CD163, CD11b och CD93) bedömdes. Markörerna visade positivt uttryck jämfört med deras motsvarande isotyp-kontroller, som ses av förskjutningen av histogram (figur 4). Medianen av markörer var större än isotypen kontrollerna.
Tillämpningen av denna Usenets strategi på ett blodprov, som var uppdelad i fyra rör, målat och analyseras separat, avkastning jämförbara resultat mellan rören (tabell 4).
Figur 1: representativa monocyt gating strategi i helblod. (A), FSC(A) vs. FSC(H) plot: Gating de celler som har en lika stor yta och höjd, således att ta bort klumpar (större FSC(A) i förhållande till FSC(H)) och skräp (mycket låg FSC) K = 1000. (B), FSC(A) vs. SSC(A) plot: brett urval av monocyter baserat på deras SSC/FSC-egenskaper. (C) CD16 vs. CD14 plot: Gating Markera monocyter baserat på deras karaktäristiska ”┐” form. (D) CD16 vs. HLA-DR plot: Usenets att välja HLA-DR positiva celler och avlägsna NK celler. (E) CD14 vs. HLA-DR: Usenets att utesluta de B-cellerna (HLA-DR hög/CD14 låg) från monocyter. (F) valt monocyter igen på CD16 vs. CD14 tomt till gate monocyt delmängder. För A-F representerar färg cell densiteten med blått och grönt indikerar låg densitet, rött och orange indikerar hög densitet och orange som anger mid-range densitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: validering av gating strategi av identifiering av potentiellt kontaminerande celler. Potentiellt smittsamt celler identifieras av markörer (A) T celler (CD3), (B), B-celler (CD19), (C) NK-celler (CD56) och (D) neutrofiler (CD66b). Vänster sida paneler Visa identifiering av varje befolkning efter gating enligt figur 1A och 1B, med färg som representerar cell densiteten från hög (röd) till lågt (blå). Panelerna till höger visar varje cell befolkningen (blå) ovanpå sista monocyt CD16/CD14 tomten att avslöja närheten av dessa populationer att monocyter (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bekräftelse att Usenets steg bort kontaminerande celler. Värme kartor visar graden av uttryck från hög (röd) till lågt (blå) (A) CD56 och (B) CD19. Usenets steg framgångsrikt utesluta celler med hög CD56 (NK-celler) och hög CD19 (B-celler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: monocyt uttryck för M1 (CD120b) och M2 (CD93) markörer. Slätade histogram av monocyt M1 och M2 markör uttryck (blå) visar tydligt övergången från isotypen (röd) för (A) classicals, (B) intermediärer och (C) icke-classicals. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antikropp | Volym (50 µL blod) | Volym (16 x) 800 µL blod |
| CD14 - V450 | 0.75 ΜL | 12 ΜL |
| CD16 - APC | 0,5 ΜL | 8 ΜL |
| HLA-DR-PerCP | 0,625 ΜL | 10 ΜL |
Tabell 1: Antikroppar för helblod flöde och master mix.
| Tube | PE-antikroppar | Koden | Isotypen Match | Beståndet koncentration | Arbetande volym |
| 1 | IgG1 | BD (555749) | NA | 1,0 µg/20 µL | 0,625 ΜL |
| 2 | CD163 | BD (556018) | BD IgG1 | 0,125 µg/20 µL | 5 ΜL |
| 3 | CD64 | BD (558592) | BD IgG1 | 0,06 µg/20µL | 10 ΜL |
| 4 | IgG1 | BD (555749) | NA | 1,0 µg/20 µL | 1,25 ΜL |
| 5 | CD86 | BD (555658) | BD IgG1 | 1,0 µg/20 µL | 1,25 ΜL |
| 6 | CD11b | BD (561001) | BD IgG1 | 1,0 µg/20 µL | 1,25 ΜL |
| 7 | IgG2a | R & D (IC003P) | NA | 25 µg/mL | 5 ΜL |
| 8 | CD120b (TNFRII) | R & D (FAB226P) | R & D IgG2a | 25 µg/mL | 5 ΜL |
| 9 | IgG1 | BL (400112) | NA | 0,2 mg/mL | 2,5 ΜL |
| 10 | CD93 | BL (336108) | BL IgG1 | 50 µg/mL | 1,25 ΜL |
Tabell 2: M1/M2-PE fluorokrom märkt monoklonala antikroppar för hela blodflödet.
| Tube | Antikropp | Arbetande volym |
| 11 | CD3 | 5 ΜL |
| 12 | CD19 | 5 ΜL |
| 13 | CD66b | 1,25 ΜL |
| 14 | CD56 | 5 ΜL |
Tabell 3: PE fluorokrom märkt monoklonala antikroppar för lymfocyter (T-celler, B-celler), neutrofiler och NK-celler.
| Tube | % Classical | % Intermediär | % Icke-klassisk |
| 1 | 84,3 | 5.11 | 10.1 |
| 2 | 84,2 | 5,05 | 10.5 |
| 3 | 84,3 | 5,03 | 10,7 |
| 4 | 81,6 | 5,03 | 12.1 |
Tabell 4: Monocyt delmängd proportioner från ett blodprov färgas och analyseras separat.
Discussion
Helblod flödescytometri är en idealisk metod för att studera monocyter som cellerna undersöks i förhållanden nära deras fysiologiska närmiljön som ger en inblick i deras roller i infektion och inflammatoriska tillstånd. Dessutom, användning av färska (dvs, obearbetade) blodprov minimerar de ändringar eller cell omvandlingar som kan uppstå på grund av lagring eller hantering18,19, såsom de rapporterats med freeze-tinade monocyter 20. snabb provberedning rekommenderas eftersom vissa markörer är uppreglerad om proverna förvaras vid rumstemperatur före bearbetning19. Den optimala koncentrationen av M1 och M2 markörer bestämdes genom titrering, och detta bör göras för eventuella nya antikropp att begränsa icke-specifik bindning samtidigt att graden av Skift är på grund av antigen uttryck och inte begränsas av brist på antikroppar. Borttagning av röda blodkroppar och fixering av vita blodkroppar med Lys lösning är ett viktigt steg i detta protokoll som förekomst av röda blodkroppar kan störa flödet flödescytometri21,22. Observera att medan vissa lysis är kompatibla med no-tvätta färgning, tydligare populationer är tydligt i våra händer när en TVÄTTNINGSSTEGET används.
Rätt inställning av en flödescytometer är också kritisk när man jämför uttryck av monocyt markörer. Vi rekommenderar att forskare upprätthålla konsekventa mål fluorescens intensiteter av kontroll pärlor och utföra kvalitetskontroll på instrumentet skall användas till att ge konsekventa resultat över olika prover kör på olika dagar. Utöver detta används isotypen kontroller att bistå i tolkningen av någon icke-specifik bakgrund signal genereras av icke-specifik antikropp bindande. Monocyter har höga nivåer av Fc-receptorer11 och är därför benägna att icke-specifik bindning. Notera, nivån på icke-specifik bindning skiljer sig för de olika undergrupper, och därmed användningen av en isotypen kontroll blir viktigt när man jämför graden av markör uttryck mellan undergrupper.
Ett annat viktigt kriterium anses är Usenets stegen anställd. Vissa studier tyder på att det är avgörande för att rita en tight grind runt monocyt befolkningen i FSC(A)/SSC(A) komplott för att bli av med de flesta av de icke-monocytic CD16 positiva celler23,24,25, men detta kan leda till förlust av några monocyter som icke-monocyt celler kan överlappa med monocyter på FSC/SSC tomter26. Snarare för att utesluta alla andra blodkroppar som kan förorena monocyter, är införandet av en tredje monocyt markör förutom CD14 och CD16, väsentliga26,27. Av denna anledning, HLA-DR används ofta och är idealiskt eftersom det inte är uttryckt av NK celler eller neutrofiler17,28. Även lymfocyter (B-celler och T-celler) kan uttrycka HLA-DR, de skiljer sig från monocyter i respekt till CD14 uttryck. HLA-DR är en idealisk tredje markör, CD86 har också rekommenderat5,27,29 men användes inte här eftersom det är också en M1 markör och därmed dess grad av uttryck på monocyt undergrupper bedömdes.
Validering av den portande strategi som används är av avgörande betydelse. NK-celler är kända att överlappa med icke-classicals om de inte är gated ut28, märker vi att B-celler också kan överlappa med den icke-classicals (figur 2B); om detta är fallet i andra studier kan bero på fluorokrom valet, instrumentet konfiguration, detektorkänslighet eller ens de sjukdomstillstånd som undersöks. Här, på överlappande B cells visade högt uttryck av HLA-DR och var inte gated ut genom val av HLA-DR positiva celler i figur 1 d. Snarare att ta bort B-celler vi använde en ytterligare tomt CD14 / HLA-DR, där B-celler skilja från icke-classicals på grund av deras högre HLA-DR och låg CD14 uttryck.
Det finns också många olika sätt som utfärda utegångsförbud för av monocyter själva har dragits i litteraturen; Dessa inkluderar kvadranter (delmängder skiljs åt av kvadrant markörer) och rektangulära eller trapetsoid lådor13 (med separata lådor dras för varje delmängd) som dessutom skiljer sig i deras placering som avgränsar där en delmängd slutar och en annan börjar. Dessa skillnader sannolikt återspeglar det faktum att monocyter existerar som ett kontinuum av celler, att skilja från klassiskt till icke-klassiska, snarare än klart skilda populationer. Men eftersom variationer i tekniker för att identifiera delmängder själva kan leda till skillnader i de beräkna monocyt delmängd proportionerna, blir det viktigt att metoden Usenets är någorlunda objektiva, snarare än subjektiva, som detta kommer att göra metoden mer robust och reproducerbara. Vissa studier använder en isotypen kontroll för CD16 för att bestämma gränsen mellan klassiskt och mellanliggande delmängder30. Däremot, om du vill definiera separationen mellan intermediärer och icke-classicals, har det föreslagits att gränsens kan vara lodrät eller sned, med valet upp till utredarna, förbehållet att det ska vara reproducerbara, men en rektangulär grind har rekommenderats för att underlätta jämförelser mellan studier13,30,31. Här, erhölls ökad objektivitet genom att plotta data på en zebra tomt och tillämpa objektiva visuella regler, eftersom zebra tomter ger en ytterligare visualisering cue genom att blanda färgövertoning till varje lika sannolikhet bin över en traditionell kontur tomt. Den högra kanten av den klassiska delmängden drogs så att befolkningen var jämnt fördelade runt befolkningen medianen. Uppdelningen mellan intermediärer och icke-classicals standardiserades också genom att ha basen av intermediärer justera med botten av de koncentriska cirklarna inom klassisk befolkningen (dvs. mellanliggande befolkningen tydligt uttrycker höga nivåer av CD14, enligt Standardnomenklatur1).
Medan vissa studier har föreslagit användning av ytterligare markörer, såsom C-C chemokine receptorn typ 2 (CCR2) eller 6-sulfo LacNAc (SLAN) för att få framgångsrika uppräkning av monocyter och avslöja deras kliniska betydelse32,33 , i våra händer uttryck för många monocyt funktionella markörer varierar kraftigt mellan individer14. Sådan variation kan begränsa användbarheten av dessa markörer att definiera grupper baserat på deras uttryck. Automatiserad beräkningsvetenskapliga metoder har också använts för att visualisera och kluster monocyt delmängder inklusive visuella interaktiva stokastiska granne inbäddning (viSNE), t-fördelad stokastisk granne inbäddning (tSNE) eller Spanning-tree Progression Analys av densitet-normaliserade händelser (SPADE)34,35, som kan ge visuell representation av cellerna utifrån uppsättningen flera markörer används. Medan detta har visat sig öka noggrannheten för Usenets strategin i monocyt delmängd klassificering, är det känt att en nackdel är antalet antikroppar (och motsvarande fluorophore kanaler) krävs. Dess användbarhet beror på de frågor som ställs; den extra komplexiteten kan inte vara motiverat, exempelvis i uppräkning studier.
Monocyter gated med vår teknik visar proportioner i linje med litteraturen och uttrycket av yta markörer av tre delmängder lätt kan fastställas. Sammantaget ger den teknik och metodik som beskrivs här en standardiserad och okomplicerad metod för uppräkning av monocyt delmängd proportioner och bedömningen av surface markör uttryck, som kan utökas till att omfatta andra markörer samt, därmed validera deras funktionella roller i olika andra villkor.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Flödescytometri utfördes i den flöde flödescytometri Core Facility som stöds av Westmead Institutet för medicinsk forskning, Westmead Research Hub, Cancer Institute New South Wales, och nationella hälsa och medicinska forskningsrådet. Denna studie stöddes av klinisk kemi forskning och utbildningsfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
| BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 mL | Becton Dickinson | 7128959 | |
| Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
| 5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 mm x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
| V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
| APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
| Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
| PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
| PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
| PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
| PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
| PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
| PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
| PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
| PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
| PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
| PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
| PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
| PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
| OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
| Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
| Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
| Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |
References
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).
- Wildgruber, M., et al. The "Intermediate" CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans. Scientific Reports. 6, 39483 (2016).
- Heine, G. H., et al. Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease. Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography. Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Bories, G., et al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects. Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).
- Fadini, G. P., et al. An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy. Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).
- Satoh, N., et al. Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone. Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).
- Chen, X., Devaraj, S. Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).
- Williams, H., et al. Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease. International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. Phenotypic characterization of human intermediate monocytes. Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).
- Zawada, A. M., et al. Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study. Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).
- Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels. Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).
- Szaloki, G., Goda, K.
- Abeles, R. D., et al. CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure. Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).
- Mukherjee, R., et al. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Scientific Reports. 5, 13886 (2015).
- Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).
- Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).
- Dagur, P. K., McCoy, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current protocols in cytometry. Robinson, J. P. 73, 5.1.1-5.1.16 (2015).
- Einwallner, E., et al. Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts. Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).
- Tsujioka, H., et al. Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction. Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity. Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).
- Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood. Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).
- Zawada, A. M., et al. Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease. Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).
- Zawada, A. M., et al. SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset. Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).
- Heimbeck, I., et al. Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females. Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets. Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).
- Weber, C., et al. Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis & Vascular Biology" and "Thrombosis". Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).
- Shantsila, E., et al. Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).
- Hofer, T. P., et al. slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation. Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).
- Thomas, G. D., et al. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).
