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Methodenartikel

Schwere Brandverletzungen in einem Schweine-Modell zur Beurteilung der klinischen Dressing

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DOI:

10.3791/57942

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6. November 2018

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1Graduate Institute of Medical Sciences, National Defense Medical Center, 2Department and Graduate Institute of Biology and Anatomy, National Defense Medical Center, 3Department of Gerontological Health Care, National Taipei University of Nursing and Health Sciences, 4Division of Rheumatology/Immunology/Allergy, Department of Internal Medicine, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center, 5Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Tri-Service General Hospital, 6Department of Nursing, Yuanpei University, 7Department of Physiology and Biophysics; Graduate Institute of Physiology, National Defense Medical Center, 8Division of Urology, Department of Surgery, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zu eng mimischen Modus von Brandverletzungen erfordert das Zusammenspiel von klinischen Beobachtungen und Studien in Tiermodellen. In dieser Studie wurde ein Schweine-Modell der schwere Brandverletzung gegründet, um einer experimentellen Dressing in physiologische und pathophysiologische Einstellungen zu beurteilen.

Zusammenfassung

Wundheilung ist eine dynamische Reparatur-Prozess und der komplexe biologische Prozess im menschlichen Leben. Als Reaktion auf Verletzungen zu verbrennen beeinträchtigen Veränderungen biologischer Signalwege der Entzündungsreaktion, was bei der verzögerten Wundheilung. Beeinträchtigte Wundheilung tritt häufig bei Patienten mit Diabetes führt zu ungünstigen Ergebnissen wie Amputation. Daher sind Verbände haben positive Wirkung bei der Förderung von Burn Wunde Reparatur erforderlich. Studien zu brennen Wundbehandlung sind jedoch wegen des Mangels an korrekten Tiermodellen beschränkt. Unsere früheren Studie zeigte Wundheilung Leistung in Ratten und Schweine Modelle verwenden eine minimal-invasive Operationstechnik. Diese Studie zielte darauf ab, ein Schweine-Modell der schweren Brandverletzungen zu demonstrieren, die Kontraktion der Wunde beseitigt und entspricht mehr die menschlichen Prozessen der Re Epithelisierung und Gewebsneubildung. Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Anleitung für die Erstellung von konsistenten Brandwunden und Prüfungsleistung die Wundheilung unter der Behandlung von einer experimentellen Dressing in einem Schweine-Modell. Sechs Brandwunden entstanden symmetrisch auf den Handrücken, die waren bedeckt mit einer klinischen dressing aus vier Schichten: einer inneren Kontaktschicht experimentelle Materialien, einer inneren Zwischenschicht aus wasserdichten Folie, einer äußeren Zwischenschicht aus Gaze, und eine äußere Schicht der Wundpflaster. Nach Abschluss der Experimente wurden Wundverschluss, Wundbereich und Vancouver Narbe Skala Score untersucht. Die Proben der Haut von jedem Post-Tieropfer reseziert wurden histologisch vorbereitet und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin Färbung. Antibakterielle Aktivität jedes Dressing im Rahmen der Wundheilung wurde ebenfalls untersucht. Die Anwendung der klinischen Wundauflage, die Wunden in Schweine Modell ahmt die biologischen Prozesse des menschlichen Wundheilung im Hinblick auf die Prozesse der Epithelisierung, Zellproliferation und Angiogenese. Daher stellt diese Schweine-Modell eine einfach zu erlernendes, kostengünstige und robuste Methode zur Beurteilung der Wirkung von klinischen Dressings in schwere Brandverletzung.

Einleitung

Eine Brandverletzung initiiert den entzündlichen Prozess und führt zu komplexen pathologische Auswirkungen, die zahlreiche Körperfunktionen unmittelbar nach einem Unfall, was negative Auswirkungen auf die Lebensqualität der Patienten zu beeinflussen. Beeinträchtigte Wundheilung führt zu signifikanter Morbidität und Mortalität bei Patienten mit Diabetes Mellitus1,2. Die meisten Patienten mit Brandverletzungen Schmerzen während brennen Wunde Debridement, die als quälenden Prozess trotz der Verwendung von starken opioid-Analgetika3bekannt ist.

Im Gegensatz zu anderen Säugetieren teilen Schweine mehrere anatomische und physiologische Eigenschaften mit den Menschen in Bezug auf den Prozess der Epithelisierung, Zellproliferation und Angiogenese. Dadurch Schweine ein potenziell besseres Modell für bestimmte Verfahren und Studien, und häufig werden sie in späteren Studien, die vielversprechende Ergebnisse bei Mäusen nachgewiesen. Diese Eigenschaften führten zu der zunehmenden Nutzung von Schweinen als wichtige Spezies in präklinischen Erprobung. Vor kurzem wurde ein Anstieg in der biomedizinischen Forschung mit Respekt zu Herz-Kreislauf-, Harn, Hautanhangsgebilde und Verdauungssysteme4,5,6beobachtet. Diese Studie zielt auf eine Schweinegrippe-Modell der schwere Brandverletzung zu demonstrieren, die Wunde Kontraktion verhindert und bietet eine bessere Annäherung an die menschliche Wunde Heilungsprozesse und die Bildung von neuem Gewebe. Sechs Brandwunden sind symmetrisch auf der Rücken, drei auf jeder Seite der Wirbelsäule von den Schweinen entstanden. Als nächstes wurde Anexperimental Dressing in einem Schweine-Modell der schweren Brandverletzungen, untersucht die menschliche Wundheilung (Abbildung 1) replizieren angepasst werden können. Die Wunden waren bedeckt mit einem klinischen Verband, der aus vier Schichten besteht: eine Innere Kontaktschicht experimentelle Materialien, einer inneren Zwischenschicht aus wasserdichten Folie, einer äußeren Zwischenschicht aus Gaze und eine äußere Schicht der Wundpflaster. Eine wasserdichte Folie hält das Wundmilieu feucht während bakterielle Infektion zu verhindern und damit Gase, das Dressing zu durchdringen. Der äußeren Zwischenschicht aus Gaze war auf die wasserdichten Folien angewendet und gesichert durch eine äußere Schicht der Wundpflaster. Nach Abschluss der Experimente wurden Wundverschluss, Wundbereich und Vancouver Narbe Skala (VSS) Score untersucht. Die Proben der Haut von jedem Post-Tieropfer reseziert wurden histologisch vorbereitet und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung. Antibakterielle Aktivität jedes Dressing im Rahmen der Wundheilung wurde auch in diesem Modell untersucht. Unsere früheren Studie hat wundheilende Leistung in Ratten und Schweine-Modell mit einem minimal-invasive Operationstechnik7gezeigt. Da gab es sechs Wunden auf den Handrücken innerhalb jedes Schwein brennen, wurde jede experimentelle Dressing getestet und bewertet in allen Positionen, Voreingenommenheit, die im Zusammenhang mit der Heilungsprozess in verschiedenen Orten auf die Schweinegrippe Dorsum Wunde zu minimieren. Daher das Schweine-Modell der schwere Brandverletzung gegründet in dieser Studie stellt einen neuen Ansatz für die Bewertung von klinischen Dressings und erleichtert die Entwicklung von neuartigen Behandlung von Brandverletzungen. Diese Studie liefert wichtige Werkzeuge um die Pathophysiologie der Wundheilung brennen zu entdecken.

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Protokoll

Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen wurden von der Animal Care Committee am National Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C) genehmigt. Diese Studie wurde in Laboratory Animal Center an der National Defense Medical Center. Schweine mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 kg hat erfolgreich die Verwendung dieses Protokolls instrumentiert wurden.

1. Anpassung der Tiere, menschliche Behandlung

  1. Nach der Ankunft in der Anlage Haus der Tiere ist, aber lassen Sie sie miteinander interagieren.
  2. Bieten Sie den Tieren Ad Libitum Zugang zu Nahrung und Wasser.
  3. Schweinegrippe auf menschliche Handhabung und Transport von der Tierhaltung an die experimentellen Labor durch den Umgang mit dem Tier mindestens einmal täglich für eine Woche zu akklimatisieren.
  4. Schnell das Tier für mindestens 12 Stunden vor der Operation, Übelkeit, Erbrechen und Aspiration von Magen Flüssigkeiten zu verhindern.

(2) Sedierung

  1. Beruhigen Sie vor der Gründung der Wunde brennen Tiere über eine intravenöse Injektion mit Zoletil 50 (25 mg/kg).

(3) Intubation und Beatmung

  1. Legen Sie das Tier auf einem Tisch bzw. Trolley sternale Position.
  2. Öffnen Sie den Mund des Tieres mit einer mündlichen Streuer.
  3. Im Falle nicht ausreichend Entspannung des Kiefers oder Präsenz des Schluckens Reflexe behindern die Intubation, Maske die Schweine mit Isofluran, Sedierung zu induzieren.
  4. Überwachen Sie Blutdruck, Herzfrequenz und Körpertemperatur durch physiologische Signalmonitor während der Operation, mögliche Komplikationen zu verhindern.

(4) Anästhesie

  1. Induzieren und Anästhesie zu erhalten; vorzugsweise zu betäuben das Tier durch eine intramuskuläre Injektion von Tiletamin und Zolazepam (25 mg / kg + 25 mg / kg).
  2. Das Tier mit den Endotrachealtubus Intubation, wenn Muskelentspannung, zeichnet sich durch Verlust der Kiefer Ton und palpebrale zurückgebogen, wurde beobachtet.
  3. Halten alle Schweine in einer Narkose Zustand bei einem Vaporizer-Wert von 0,5 – 2,5 % (V/V) Isofluran bis zum Ende der Operation.
  4. Prüfen Sie die Tiefe der Narkose durch Tests Schmerzen Reflexe mit ein Hinterbein Zeh kneifen vor der Operation. Bei Bedarf fügen Sie zusätzliche Anästhesie oder für ein paar Minuten warten. Reflexe der Schmerzen während der Operation regelmäßig zu überprüfen.

5. die Sterilisation der Operationsstelle

  1. Rasieren Sie und reinigen Sie die Haut des Tieres auf einer Fläche von ca. 25 cm Breite von der Wirbelsäule bis hin zu der Axilla auf beiden Seiten.
  2. Schrubben Sie die befeuchtete Haut mit Povidon-Jod-Peeling (75 mg/mL) für ca. 5 Minuten.
  3. Entfernen Sie die Povidon-Jod-Seife aus der Haut mit nassen sterile Gazen.
  4. Desinfizieren Sie die Haut mit Lotion Povidon-Jod (100 mg/mL).
  5. Decken Sie das Tier mit sterilen OP-Tüchern, bakterielle Übertragung und nachträgliche Kontamination an der Operationsstelle zu reduzieren.

6. brennen Sie Wunde Schaffung

  1. Verwenden Sie eine chirurgische Markierstift, um die Mitte der sechs Brandwunden symmetrisch auf den Rücken des Schweins zu markieren. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen jeder Wunde brennen mindestens größer als der Radius der Wunde (Abbildung 1A) ist.
  2. Füllen Sie einen modifizierte Lötkolben mit 50 mL Glycerin und fügen Sie ein elektronisches Thermometer hinein, um die Temperatur zu überwachen. Das heiße Eisen besitzt eine Fläche von ca. 9 cm2 (Abbildung 1 b).
  3. Erwärmen Sie das Bügeleisen auf 137 – 139 ° C mit einer Heizplatte (Abbildung 1).
  4. Erstellen Sie sechs einheitliche Brandwunden, indem das Eisen auf den markierten Bereich ohne Kraftaufwand für 30 Sekunden (Abbildung 1).
  5. Waschen Sie die Brandwunden mit 0,9 % Kochsalzlösung (Abbildung 1).
  6. Wunde Dimensionen messen und Aufzeichnen der Wunde durch Mikrofotografie (Abbildung 1E).

7. Vorbereitung des Dressings

  1. Jede Wunde mit Kontakt Innenlage aus einem vierlagigen klinische Dressing durch den direkten Kontakt zu decken. Verwenden Sie für diesen Layer CAPS-haltigen Dressing oder alternative Materialien (Abb. 1F).
  2. Tragen Sie einen wasserdichten Film auf den klinischen Verband als eine Barriere gegen Bakterien eindringen (Abb. 1F) dienen.
  3. Decken Sie jede Wunde mit einer Gaze (0,5 cm dick) und befestigen Sie mit Papier-Klebeband, als die mittlere Schicht der Wundauflage (Abbildung 1) zu dienen.
  4. Sichern Sie die Gaze mit einer Außenschicht Wundpflaster. Verlängern Sie diese Schicht mit dem Rumpf, die Vertreibung des Verbandes zu vermeiden (Abbildung 1 H-1J).

8. nach dem Brennen Sie Pflege und Messung

  1. Injizieren Sie die Schwein mit Buprenorphin (0,1 mg/kg, IM) für die Schmerztherapie für alle 8-12 h, beginnend vor der Wiederherstellung aus der Narkose, eine Woche lang um mögliche Schmerzen zu lindern.
  2. Den Schwein freien Zugang zu Futter und Wasser zu ermöglichen.
  3. Ändern Sie die klinischen Dressings alle 2 Tage für die ersten 10 Tage und dann zweimal pro Woche für 6 Wochen zu studieren.
  4. Reinigen und Wunden vor dem erneuten klinischen Dressings zu messen. Anästhesie beim Verbandwechsel zu verwalten.
  5. Aufzeichnen die Wunde durch Mikrofotografie für den Vergleich der Wunde Heilungsrate alle 2 Tage für die ersten 10 Tage und dann zweimal pro Woche für 6 Wochen zu studieren.
  6. Berechnen Sie die Wunde Re Epithelisierung oder Kontraktion als Prozentsatz der ursprünglichen Größe der Wunde nach einer zuvor beschriebenen Methode. Die Analyse der Wundverschluss war eine doppelblinde Weise durchgeführt.
  7. Die Feuernarbe mit VSS, bestehend aus vier Variablen zu messen: Vaskularität, Höhe (Dicke), Geschmeidigkeit und Pigmentierung an Post-brennen Tagen 0, 7, 21 und 42. Jede Variable hat vier bis sechs möglichen Resultate. Insgesamt reicht von 0 bis 14, wobei eine Punktzahl von 0 spiegelt Punkten normalen Haut.

9. Bakterienwachstum Experimente nach dem Brennen Gewebe

  1. Wischen Sie die Wunde zu Testzwecken antibakterielle an Post-brennen Tagen 0, 7, 21 und 42.
  2. Legen Sie den Tupfer in 100 mL steriler Kochsalzlösung 0,9 % und sanft Wirbel um eine homogene Suspension zu erreichen.
  3. Seriell verdünnen (10−1– 10-5) das Homogenat und 100 μL jeder Verdünnung in selektive und obstructions Medien bzw. Platte.
  4. 24-72 Stunden inkubieren Sie alle Verdünnungen unter aeroben Bedingungen bei 37 ° C.
  5. Platte dreifacher Aliquote von 10 μL aus allen Verdünnungen auf Blutagar Teller mit 5 % Schafe Blut zu isolieren, aerobe grampositive Organismen ergänzt.
  6. Inkubation die Probe durch Verbreitung oder gießen die Probe gleichmäßig auf der Oberfläche einer Nährbodenplatte über Nacht zur Ermittlung der Anzahl der Koloniebildenden Einheiten (KBE).
  7. Lesen Sie die Platten nach der Inkubation über Nacht. Invertieren Sie der Schafe Blut Nährbodenplatte und unterteilen Sie den Boden der Schale in vier gleichen Quadranten mit einem Marker und kleines Lineal.
  8. Die Platte auf die Bühne eines Mikroskops Dissektion und zählen der Kolonien auf jeder Platte. Per Definition muss eine Kolonie ein Minimum von 300 KBE aufgelistet werden sollen.
  9. Zählen Sie die Bakterienkolonien in jedem der drei Wiederholungen. Berechnen Sie der Mittelwert der drei repliziert. Bestimmen Sie die KBE pro Platte mit der endgültigen Verdünnungsfaktor multipliziert den Mittelwert.

10. die Euthanasie und Gewebe Fixierung

  1. Eine Überdosierung von Natrium-Pentobarbital-Euthanasie-Lösung (80 – 120 mg/kg) intravenös zu injizieren.
  2. Führen Sie en bloc Exzision von Burn Wundgewebe, die zugrunde liegende Muskulatur und umliegende unverletzten Gewebe aufzunehmen.
  3. Fixieren Sie Gewebe mit 10 % neutral gepuffertem Formalin.
    1. Mischen Sie 10 mL Formaldehyd (37 %) in 90 mL Phosphat gepufferte Lösung (PBS) und Store bei 4 ° C.
    2. Übertragen Sie Gewebe auf Fixiermittel und wirbeln Sie den Container um sicherzustellen, dass alle Gewebe im Fixiermittel vollständig eingetaucht sind. Das Volumen des Fixiermittels muss 30mal Gewebevolumens.
    3. Beheben Sie Gewebe über Nacht bei 4 ° c.
  4. Gewebe mit Ethanol zu entwässern und Einbettung in Paraffin-Blöcke. Führen Sie die folgenden Schritte bei 4 ° c in einen Shaker geben.
    1. Für 30 Minuten zweimal mit PBS waschen.
    2. Entwässern Sie Gewebe mit 70 % igem Ethanol für 8 Stunden, 80 % Ethanol über Nacht, 95 % igem Ethanol für 8 Stunden, und dann in 100 % igem Ethanol über Nacht.
    3. Weitere 8 Stunden inkubieren Sie Gewebe in 100 % igem Ethanol.
    4. Inkubieren Sie Gewebe in drei Änderungen von Xylol jede 30 Minuten lang.
    5. Ersetzen Sie der Xylol mit frisch geschmolzene (52 ° C) Wachs und 1 Stunde bei 52 ° C in einem Ofen inkubieren.
    6. Ersetzen Sie das Wachs mit frischem Wachs und 3 Stunden, bei 52 ° C in einem Ofen inkubieren Sie nochmals zu ersetzen Sie und über Nacht bei 52 ° C inkubieren.
    7. 1 Stunde, Gewebe mit zwei weitere Änderungen des Wachses jedes inkubieren das Gewebe einbetten und Lagerung bei 4 ° C.
  5. Schneiden Sie und färben Sie die Paraffin-eingebetteten Abschnitte mit er über einem Lichtmikroskop mit 100× Vergrößerungzu visualisieren.
    1. Paraffin-Abschnitte mit einem rotierenden Mikrotom zu erstellen.
    2. Wachsentfernung Abschnitte mit drei Änderungen von Xylol jeweils für 3 Minuten.
    3. Rehydrieren Gewebe mit 100 %, 95 %, 80 % und 70 % igem Ethanol für 3 Minuten, und dann tauchen in destilliertem Wasser.
    4. Färben mit Hämatoxylin für 10 Minuten, und dann in fließendem Leitungswasser abspülen.
    5. Für 5 Minuten mit 0,1 % Salzsäure Ethanol unterscheiden Sie, und spülen Sie mit Wasser aus dem Wasserhahn.
    6. Färben Sie mit Eosin 0,5 % für 1 Minute.
    7. Entwässern Sie Gewebe mit 70 %, 80 %, 95 % und 100 % Ethanol, 2 Minuten lang.
    8. Deaktivieren Sie die Färbung mit Xylol und trocknen in Abzug.

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Ergebnisse

Brennen-Dauer von 30 Sekunden von glühenden Eisen führte zu Wunden, die mit klar definierten Rand kreisförmig und gleichmäßig blass mit einem Rand von Erythema (Abbildung 1). Innerhalb jedes Tier gab es sechs Brandwunden auf den Handrücken. Die Anordnung der Brandwunden wurde in Abbildung 1 Kdargestellt. Brandwunden wurden komplett mit Kappen-haltigen Wundauflage bedeckt und verwendet, um die Tiefe der Narbenbildung an Post-brenn...

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Diskussion

Die vorliegende Studie etabliert ein Schweine-Modell der schweren Brandverletzungen und untersucht das Modell mit einem CAPS-haltigen Dressing. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Schweine-Modell für die Überwachung der klinischen Leistung von experimentellen Dressings, einschließlich antibakterielle Eigenschaft verwendet werden kann. Wundheilung Rate, Wundverschluss und antibakterielle Aktivität wurden auch mit VSS, H & E Färbung und antibakterielle Test analysiert. Die Verwendung von tierischen brennen Mode...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Tri-Service General Hospital; National Defense Medical Center, Taiwan (TSGH-C107-042); Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (die meisten 106-2314-B-016-014); und das National Defense Medical Center (MAB-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Sedierung:
KetaminMerial2528 ESP10 mL Fläschchen
AzaperonChina chemisch & pharmazeutisch47W406100 mL Fläschchen
Atropin &Orientalische Chemie arbeitetIN1208021 mL Fläschchen
Anästhetikum:
Tiletamine+ZolazepamVirbacBC915 mL Fläschchen
IsofluranBaxterN002A225100 mL Fläschchen
Chirurgie:
HaarschneiderMoser--
Povidon-Jod-Peeling-LösungEver StarHA1612024-Liter-Fass
Modifiziertes Eisen---
0,9% ige KochsalzlösungCHI SHENGKC130500 mL Fläschchen
GazeChina Chirurgische Verbände ZentrumMO1590008010 x 10 cm
CAPSCoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipeh, Taiwan--
Papier Klebeband3MNDC-8333-1530-012,5 cm x 9,1m
Wasserfeste Folie3MNDC-8333-1600-4010 cm x 10 m
HeftpflasterJunge chemischeBH142601510 cm x 10 m
Präparierung:
Paar Standard-Schere scharf/stumpf gerade (14 cm)Shinetec InstrumenteST-S114-
Halstead-Mosquito (12,5 cm)Shinetec InstrumenteST-H012-Griff
(# 4)Shinetec InstrumenteST-H004-Chirurgische
Klinge(#21)Shinetec InstrumenteST-B021-
Post-Fixation & Lagerung: < / stark>
50 ml Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff  Falcon352070-10
% neutral gepuffertes FormalinLeica3800604EG-
bakterielle Wachstumsexperimente 
Blut-Agarplatte (BAP) (TSA mit 5% Schafsblut) CMP-90mm Mono

Referenzen

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