Methodenartikel

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

DOI:

10.3791/57978

⸱

6. Juli 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wright State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel stellt eine Paarung basierende Methode zur Überexpression Screening in der angehenden Hefe mit einer angeordneten Plasmid-Bibliothek zu erleichtern.

Zusammenfassung

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Angehende Hefe hat als Modell bei der Untersuchung von Proteinen verbunden mit menschlicher Krankheiten verbreitet. Genomweite genetisches Screening ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig in Hefe Studien verwendet. Der Ausdruck einer Reihe von neurodegenerativen Krankheit-assoziierte Proteine in Hefe verursacht Zytotoxizität und Aggregatbildung, Rekapitulation Befunde bei Patienten mit diesen Erkrankungen gesehen. Hier beschreiben wir eine Methode für das screening ein Hefe-Modell des Amyotrophic Lateral Sclerosis-assoziierten Proteins FUS für Modifikatoren von seiner Giftigkeit. Anstelle von Transformation, setzt diese neue Screening-Plattform auf die Paarung von Hefe eine angeordneten Bibliothek von Plasmiden in der Hefe-Modell einführen. Die Paarung Methode hat zwei Vorteile: Erstens ist es sehr effizient; Zweitens kann die bereits transformierte angeordneten Bibliothek der Plasmide für langfristig als ein Glycerin-Lager, und schnell auf andere Bildschirme ohne den arbeitsintensiven Schritt der Transformation in das Hefe-Modell angewendet jedes Mal gespeichert werden. Wir zeigen, wie erfolgreich diese Methode verwendet werden kann zum Bildschirm für Gene, die die Toxizität von FUS zu ändern.

Einleitung

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Die angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae hat in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung1 verbreitet, um zelluläre Prozesse, die direkt im Zusammenhang mit Krankheiten des Menschen zu verstehen. Darüber hinaus hat es als Modellorganismus verwendet worden für Studium menschlichen krankheitsassoziierten Proteine, wie diejenigen, die am häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Morbus Parkinson, Chorea Huntington und Amyotrophe verbunden Lateralsklerose (ALS)2. Ein Vorteil der Hefe-Modells ist die Leichtigkeit, mit der ein genomweite Bildschirm ausgeführt werden kann,....

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Protokoll

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Hinweis: Das hier beschriebene Protokoll eignet sich für screening-Bibliothek Plasmide in zehn 96-Well-Platten enthalten aber kann skaliert werden oben oder unten entsprechend. Das Protokoll muss wiederholt werden, um die gesamte Bibliothek Überprüfung abzuschließen. In der Regel kann Abschirmung gegen 10 Platten Bibliothek Gene jeweils bequem durch 1 Person behandelt werden.

1. Vorbereitung für 96-Well-Hefe-Transformation

Hinweis: Dieser Schritt ist wie zuvor beschrieben7,10durchgeführt.

  1. Aliquoten 5 µL (ca. 50 – 100 ng) der Plasmid-DNA aus einer angeordneten Plasmi....

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Ergebnisse

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Das ALS-assoziierten Protein FUS, eine RNA/DNA-bindendes Protein, war vorher im haploiden Hefe7,8studiert. Genetisches screening mit der Umwandlung basierende Methode entdeckte mehrere Hefe-Gene, die FUS Toxizität zu unterdrücken. Das menschliche Homolog von eines der Hefe Gene zeigte später wirksam zu unterdrücken Toxizität bei einer primären neuronale Zelle und Rattenmodell ALS13sein. Hier verwenden wir d.......

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Diskussion

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Hier beschreiben wir ein Protokoll um ein Plasmid Überexpression Bildschirm in der Hefe, die zur Einführung der Plasmid-Bibliothek in der Hefe-Modell mit Paarung durchzuführen. Mithilfe dieses Ansatzes können mehrere Hefe-Modelle der Neurodegenerative Krankheit Protein Toxizität gezeigt mit der gleichen Sammlung von Hefe mit einem Plasmid-Bibliothek umgewandelt. Der mühsame Prozess der Transformation muss nur durchgeführt werden, sobald nach dem hocheffizienten Hefe Paarung verwendet wird, um der Plasmid-Bibliothek in de.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Wir sind dankbar für die nachdenkliche Gespräche mit Mitgliedern der Ju-Labor und Zhong Labor und die finanzielle Unterstützung von der Wright State University.

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Materialien

Lachs

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Spermien-DNA (SS-DNA)Sigma-Aldbsp  D1626
YPD-BouillonResearch Products International (RPI)Y20090
Granulierter AgarFisher SciBP97445
D-(+)-GlucoseResearch Products International (RPI)G32040
D-(+)-GalactoseResearch Products International (RPI)G33000
D-(+)-Raffinose-PentahydratForschungsprodukte International (RPI)R20500
AmmoniumsulfatFisher SciA702-500
Synthetisches Ura-Drop-out-MediumClontech630416
Hefe-Aminosäure-Drop-out-Ergänzung -Histidin/-UracilClontech630422
Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren und AmmoniumsulfatForschungsprodukte International (RPI)Y20060
Dimethylsulfoxid (DMSO)Fisher SciS67496
Lithiumacetat, wasserfreiFisher SciAC268640010
Polyethylenglykol 3350 (PEG-3350)Spectrum ChemicalPO125-12KG
96-poliger ReplikatorScinomixSCI-5010-OS
Nunc OmniTrayThermo Sci140156
Corning Costar 96 Well Assay Platte, runder Boden mit DeckelFisher Sci07-200-760unbehandelt, steril
Eppendorf  Forschung plus MehrkanalpipetteEppendorfTI1369005230-300ul Volumen
Fisherbrand  Isotemp Digital Trockenbäder/BlockheizkörperFisher Sci88-860-023
Eppendorf  MixMateEppendorf21-379-00
Eppendorf 5810R ZentrifugeFisher Sci05-413-112
Avanti J-26 XPI ZentrifugeBeckman393127
MultiFlo FX Multi-Mode DispenserBioTek
Rotor HDA   Sänger Instrumente

Referenzen

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  1. Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
  2. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's ye....

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Schlagwörter

Yeast MatingPlasmid Library ScreeningFUS ToxicityYeast TransformationGlycerol Stock StorageSelective Medium GrowthRobotic SpottingAgar Plate AssayNeurodegenerative Disease ModelOverexpression Screening

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