Methodenartikel

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

DOI:

10.3791/57978

⸱

6. Juli 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wright State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel stellt eine Paarung basierende Methode zur Überexpression Screening in der angehenden Hefe mit einer angeordneten Plasmid-Bibliothek zu erleichtern.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Angehende Hefe hat als Modell bei der Untersuchung von Proteinen verbunden mit menschlicher Krankheiten verbreitet. Genomweite genetisches Screening ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig in Hefe Studien verwendet. Der Ausdruck einer Reihe von neurodegenerativen Krankheit-assoziierte Proteine in Hefe verursacht Zytotoxizität und Aggregatbildung, Rekapitulation Befunde bei Patienten mit diesen Erkrankungen gesehen. Hier beschreiben wir eine Methode für das screening ein Hefe-Modell des Amyotrophic Lateral Sclerosis-assoziierten Proteins FUS für Modifikatoren von seiner Giftigkeit. Anstelle von Transformation, setzt diese neue Screening-Plattform auf die Paarung von Hefe eine angeordneten Bibliothek von Plasmiden in der Hefe-Modell einführen. Die Paarung Methode hat zwei Vorteile: Erstens ist es sehr effizient; Zweitens kann die bereits transformierte angeordneten Bibliothek der Plasmide für langfristig als ein Glycerin-Lager, und schnell auf andere Bildschirme ohne den arbeitsintensiven Schritt der Transformation in das Hefe-Modell angewendet jedes Mal gespeichert werden. Wir zeigen, wie erfolgreich diese Methode verwendet werden kann zum Bildschirm für Gene, die die Toxizität von FUS zu ändern.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae hat in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung1 verbreitet, um zelluläre Prozesse, die direkt im Zusammenhang mit Krankheiten des Menschen zu verstehen. Darüber hinaus hat es als Modellorganismus verwendet worden für Studium menschlichen krankheitsassoziierten Proteine, wie diejenigen, die am häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Morbus Parkinson, Chorea Huntington und Amyotrophe verbunden Lateralsklerose (ALS)2. Ein Vorteil der Hefe-Modells ist die Leichtigkeit, mit der ein genomweite Bildschirm ausgeführt werden kann, um zelluläre Signalwege, die im Zusammenhang mit der Toxizität von krankheitsbezogenen Proteine, wodurch Einblicke in den Mechanismus der Toxizität zu identifizieren. Ein solcher Bildschirm nennt einen Überexpression Bibliothek Bildschirm, in dem jedes 5.500 Hefe-Gene in einer angeordneten Bibliothek umgewandelt ist ein Hefe-Modell zu identifizieren, welche Gene Toxizität bei überexprimiert ändern können. Dieses Screening-Methode wurde erfolgreich in den Hefe-Modellen der mehrere Neurodegenerative Krankheit-verbundenen Proteine, einschließlich Huntingtin für Chorea Huntington3, α-Synuclein für Parkinson-Krankheit4,5 angewendet , Aβ für Alzheimer-Krankheit6, und FUS und TDP-43 ALS7,8,9. Während es in der Regel in einer Weise Hochdurchsatz-10erfolgt, ist die aufwändigste Schritt des Bildschirms individuell 5.500 Hefe-Gene aus einer angeordneten Bibliothek verändern. Dieser Schritt muss jedes Mal, wenn das Screening wiederholt durchgeführt werden, und wenn ein neu gegründeten Hefe-Modell untersucht werden muss. Es ist wichtig, einen effizienteren Weg, um diese Aufgabe zu finden.

Hefezellen können stabil in haploide und diploide Formen existieren. Es gibt zwei gegenüberliegende Paarung Arten von haploiden Zellen, Paarung Typ ein und α. haploiden Zellen von jeder Paarung produzieren und sezernieren ihre eigenen spezifischen Paarung Pheromon, auf die nur die entgegengesetzte Paarung Typ Zellen reagieren. Dies ermöglicht die Paarung zwischen ein und α Zellen, stabile diploide Zellen, a/α zu produzieren. Dieser Prozess ist spontan und hocheffiziente11. Wir profitieren von dieser einzigartigen Lebenszyklus von S. Cerevisiae , Plasmid-Bibliothek einzuführen. Genauer gesagt, wird jedes Gen in der angeordneten Plasmid-Bibliothek in haploiden Zellen eine Paarung Art, d. h., α Zellen umgewandelt werden. Diese Zellen mit den Genen der Bibliothek werden dann auf Glycerin Lager in einem angeordneten 96-Well-Format gespeichert werden. Für jedes Modell der Hefe, die untersucht werden muss, können Hefezellen mit den Bibliothek-Genen aus dem Glycerin bestand aufgetaut werden und das Screening kann erfolgen durch Paarung mit dem Hefe-Modell des Interesses an der gegenüberliegenden Paarung Typ, d.h.Paarung ein. Diese Idee der Verwendung Paarung von zwei Gene in der Hefe zusammenzubringen ist nicht neu. Es wurde erfolgreich in der Hochdurchsatz-Hefe angewendet, die zwei-Hybrid-Screening, in dem ein Köder zu konstruieren (d.h.Gal4 DNA-bindende Domäne Fusionen) in einer Paarung zusammen gebracht wird, durch Paarung mit einer Beute-Konstrukt aus einer angeordneten Bibliothek 12. jedoch wurde diese Strategie nie in Überexpression Bibliothek Vorführungen, derer immer traditionelle Transformationsmethoden angewendet.

Unser Labor gegründet zuvor ein Hefe-Modell von ALS-assoziierten Protein FUS7. Durch Überexpression Bibliothek Screening mit der Transformationsmethode entdeckten wir fünf Hefe-Gene (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1und VHR1), die Toxizität von FUS bei überexprimiert zu retten. Diese Ergebnisse waren unabhängig von einer anderen Gruppe8mit einer ähnlichen Studie bestätigt. hUPF1, eine menschliche Homolog des ECM32, wurde später gezeigt, Toxizität in primären Nervenzellen13 und im Tiermodell ALS14 sowie zu unterdrücken. Mit diesen fünf Gene als Kaufnachweis Prinzip, zeigen wir, dass alle fünf Gene ebenso FUS Toxizität zu retten, wenn sie bei der Paarung in die FUS-Hefe-Modell eingeführt werden. Da Hefezellen mit den Bibliothek-Genen können dauerhaft in Glycerin Lager gespeichert und wiederbelebt, wenn nötig, wird diese Paarung basierende Methode den zeitaufwendigsten Schritt der Transformation jedes Mal entfernen braucht die Bibliothek gegen untersucht werden. Da die Paarung hocheffiziente ohne Plasmid Transformation beteiligt ist, verringert sich diese Strategie auch erheblich die Kosten für Reinigung und Transformation einer großen Plasmid-Bibliothek. Wir wenden diese Methode erfolgreich zu einer Bibliothek screening gegen Hefe Modell des FUS.

Das Verfahren für die Paarung-basierten Screening ist in Abbildung 1kurz beschrieben. Zunächst die angeordneten Plasmid-Bibliothek verwandelt sich in einen haploiden Hefe-Stamm der Paarung Typ α mit einem Hochdurchsatz-Hefe Umwandlung Protokoll, in dem jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer bestimmten Bibliothek Plasmid transformiert Hefe enthält. Diese Sammlung von transformierten Hefe wird als Glycerin Stapel gespeichert, die aufgetaut und für den Einsatz später wiederbelebt werden kann. Das Hefe-Modell von Interesse, in diesem Fall FUS Toxizität muss in einem haploiden Hefestamm mit der gegenüberliegenden Paarung Art erzeugt werden (Typ Paarung ein). In gewissem Hochdurchsatz-mit sterilen 96-poligen Replikatoren die FUS Belastung und Hefestämme mit Plasmid-Bibliothek auf 96-Well-Platten mit rich-Media übertragen und erlaubt zu Paaren. Folgende Paarung, ein kleines Volumen von jedem Brunnen der Paarung Kultur wird in 96-Well-Platten mit synthetischen ausfallende Medien in welche nur diploid Hefe enthält sowohl die FUS übertragen und Bibliothek Gene wachsen können. Eine Roboter-spotting Maschine dient dann Hefekultur von jedem Bohrloch auf Agarplatten zu übertragen, wo der Ausdruck der FUS und die Bibliothek Gene induziert wird.  Darüber hinaus ist Hefekultur gesichtet, um Agarplatten zu steuern, wo FUS und die Bibliothek Gene nicht zum Ausdruck kommen. Nach einem Wachstum auf Agarplatten werden Gene, die zu retten oder verschlimmern FUS Toxizität identifiziert werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hinweis: Das hier beschriebene Protokoll eignet sich für screening-Bibliothek Plasmide in zehn 96-Well-Platten enthalten aber kann skaliert werden oben oder unten entsprechend. Das Protokoll muss wiederholt werden, um die gesamte Bibliothek Überprüfung abzuschließen. In der Regel kann Abschirmung gegen 10 Platten Bibliothek Gene jeweils bequem durch 1 Person behandelt werden.

1. Vorbereitung für 96-Well-Hefe-Transformation

Hinweis: Dieser Schritt ist wie zuvor beschrieben7,10durchgeführt.

  1. Aliquoten 5 µL (ca. 50 – 100 ng) der Plasmid-DNA aus einer angeordneten Plasmid-Bibliothek in jede Vertiefung ein Rundboden-96-Well-Platte.
    Hinweis: Ein Beispiel für solch eine Bibliothek wäre eine Hefe gen Überexpression Bibliothek10.
  2. Impfen Sie 150 mL Hefe Pepton Traubenzucker (YPD) Medien in eine 500 mL-Flasche mit einer Kolonie (2 – 3 mm Durchmesser) von der haploiden Hefe-Stamm W303α. Brüten sie über Nacht bei 30 ° C mit schütteln (200 u/min).
  3. Am nächsten Morgen messen die OD600 der Übernacht-Kultur und verdünnen die Hefekultur OD600 = 0,1 (bis zu) 2 l YPD. Inkubieren sie bei 30 ° C mit schütteln (200 u/min) ~ 5 h bis die Kultur OD600 erreicht = 0,4 – 0,6.

2. Hefe-Transformation

  1. Ernte die Hefekultur 8 sterile 250 mL Zentrifuge Flaschen füllen und Zentrifugieren sie bei Raumtemperatur bei 3.000 X g für 10 Minuten abgießen der Überstand ohne Unterbrechung das Pellet.
    Hinweis: Führen Sie alle Schritte der Zentrifugation bei Raumtemperatur.
  2. Waschen Sie die Hefe mit sterilem destilliertem H2O. 100 mL sterilen H2O hinzufügen, jede Flasche Zentrifuge und Wirbel um die Zelle Pellet aufzuwirbeln. Kombinieren Sie die gewaschenen Zellen in 2 Flaschen und Zentrifuge auf 3.000 X g für 5 min. Weg des Überstands Gießen.
  3. Waschen Sie die Zellen in jeder Flasche in 100 mL der 0,1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc, 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) und Zentrifugieren sie 3.000 x g für 5 min. Gießen aus der Überstand.
  4. Beim Zentrifugieren, 5 mL Lachs Samenzellen DNA (10 mg/mL) bei 100 ° C mit einem Block Heizung für 3 min. Kochen und dann abkühlen auf Eis.
  5. Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellets in 25 mL 0,1 M LiOAc/1XTE in jeder Flasche, kombinieren Sie die resuspendierte Zellen und übertragen Sie sie auf eine 150 mL Flasche. 5 mL der vorgekühlten Lachsen Samenzellen DNA und bei 30 ° C mit schütteln (225 u/min) für 30 min inkubieren.
  6. Den Teig Zelle in eine sterile Einweg-Reagenz-Reservoir und mit einer Mehrkanal-Pipette, 35 µL der Zelle Mischung in jede Vertiefung der Rundboden-96-Well-Platte, enthält die Bibliothek Plasmid DNA übertragen. Wirbel der 96-Well-Platten mit einer Platte Vortexer für 1 min bei 1.000 u/min. Inkubieren Sie die Platten für 30 min bei 30 ° C ohne schütteln.
    Hinweis: Stapeln Sie die Platten nicht, so kann die Wärme effizienter übertragen. Wir haben festgestellt, dass aufschütteln der 96-Well-Platten bei 1.000 u/min verursacht keine Flüssigkeit, aus dem Brunnen zu verschütten, aber eine sichere Wirbel Geschwindigkeit getestet werden, sollte bevor Sie den Schritt ausführen.
  7. Bereiten Sie in einem Kolben 200 mL des Puffers Transformation, eine Endkonzentration von 40 % PEG3350, 10 % DMSO und 0,1 M LiOAc enthält. Vorbereitung des Umwandlung Puffers unmittelbar vor der Anwendung und durch Schütteln mischen.
  8. Entfernen Sie 96-Well-Platten aus dem Inkubator 30 ° C und mischen sie für 30 s bei 1.000 u/min mit der Platte Vortexer. Hinzu kommen 125 µL des Puffers Transformation jedes gut und dann Wirbel die Platten für 1 min bei 1.000 u/min.
  9. Die Platten bei 30 ° C für 30 min inkubieren und dann Hitze Schock die Hefe indem man die Platten in einem Inkubator 42 ° C für 15 Minuten.
    Hinweis: Stapeln Sie die Platten nicht.
  10. Zentrifugieren Sie die Platten für 5 min bei 3.000 X g. Entfernen des Transformation-Puffers aus den Vertiefungen durch invertieren die Platten in einem Abfallbehälter und mit Nachdruck dumping des Puffers von den Platten. Beflecken Sie schnell die invertierten Platten auf einem sauberen Papiertuch, keine Flüssigkeit auf die Oberseite der Platten zu entfernen.
  11. Spülen Sie die Zellen, indem Sie die Platten 200 µL des minimalen Dropout mittlere entspricht die auswählbare Markierung auf dem Plasmid Bibliothek hinzufügen.
    Hinweis: Wir haben ein synthetisches Ura-Medium.
  12. Die Platten für 5 min bei 3.000 X g Zentrifugieren und den überstand über einem Abfallbehälter wie in Schritt 2.10 entfernen.
  13. Fügen Sie 160 µL minimal Ura-Medium enthält 2 % Glukose. Wirbel die Platten für 1 min bei 1.000 u/min und inkubieren sie bei 30 ° C für 48 h ohne schütteln. Beachten Sie nach 48 h, dass ein Pellet transformierte Hefe am unteren Rand jedes gut sichtbar ist.
  14. Fügen Sie mithilfe eines liquiden Dispensers 100 µL der Ura-Medien mit Glukose in jede Vertiefung einen neuen Satz von 96-Well Platten.
  15. Wirbel der Platten, die die transformierte Hefe (aus Schritt 2.13) bei 1.000 u/min für 30 s. mit einem sterilen Kunststoff 96-poligen Replikator, legen Sie die Stifte in die Vertiefungen der transformierten hefehaltigen und dann in die entsprechenden Vertiefungen der neuen Platten zu impfen gefüllt mit Medien. Inkubieren Sie die neuen Platten bei 30 ° C für 24 h.
    Hinweis: Wenn mit 10 Platten arbeiten, kann das Medium auch verzichtet werden manuell mit Mehrkanal-Pipetten.
  16. Nach 24 Stunden sollte ein Pellet Hefe im unteren Teil jedes erfolgreich transformierten hefehaltigen gut sichtbar sein. Um diese Hefestämme Glycerin Vorrat zu speichern, fügen Sie 50 µL 50 % Glycerin in jede Vertiefung Wirbel die Platten für 30 s bei 1.000 u/min, die Platten mit Dichtungsband Abdichten und frieren sie bei-80 ° C.
    Hinweis: Die oben genannten Schritte müssen nur einmal durchgeführt werden. Zukünftige Vorführungen von verschiedenen Hefe Modelle gegen die gleiche Bibliothek Einweg-Reagenz Reservoir aus Glycerin-Aktien starten und sofort aus den folgenden Schritten fortfahren.

3. Paarung zwischen Zellen, die Bibliothek Gene und Abfrage Hefe

  1. Um die Bibliothek Stämme aus dem Glycerin bestand wieder zu beleben, nimm die 96-Well-Platten aus dem-80 ° C Gefrierschrank, entfernen die Abdichtung Band, und lassen Sie die Hefe bei etwa 30 min bei Raumtemperatur Auftauen.
  2. Einmal die Hefe aufgetaut hat, können Sie einen sterilen Kunststoff 96-poligen Replikator impfen zu frischen Ura-Medien mit 2 % Glukose in 96-Well Platten 160 µL Glycerin Aktien und inkubieren sie bei 30 ° C für 24 h, sofort nachdem die Bibliothek Stämme verwendet werden , die Platten mit Dichtungsband abdichten, und wieder in die-80 ° C Gefrierschrank.
  3. Am selben Tag die Bibliothek Stämme (W303α) aufgetaut, impfen die Abfrage Hefestamm (hier der FUS in W303a), 50 mL YPD und wachsen sie über Nacht bei 30 ° C mit schütteln bei 250 u/min.
  4. Am nächsten Morgen Gießen Sie den Abfrage-Hefe-Stamm zu einem sterilen Einweg-Reagenz-Reservoir und aliquoten 160 µL der Abfrage Belastung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette.
  5. Mit dem liquid Dispenser, 160 µL YPD Medien verzichten Sie in jede Vertiefung der zehn 96-Well-Platten. Verwenden Sie diese Platten später für die Paarung der Abfrage-Hefe-Stamm mit der Bibliothek Hefe.
  6. Kurz Wirbel der 96-Well-Platte mit dem Abfrage-Stamm und dann mit einem sterilen 96-poligen Replikator um die Abfrage zu übertragen, die YPD-Platten belasten.
  7. Wirbel der Bibliothek kurz belasten Platten und für jede Bibliothek Stamm Platte verwenden einen neue sterilen 96-poligen Replikator übertragen die Bibliothek Stämme auf die YPD-Platten, die mit dem Abfrage-Stamm geimpft worden.
    Hinweis: Zellen in Glycerin verlieren ihre Keimfähigkeit nach mehreren Zyklen der Tauwetter-Freeze. Rückkehr der Bibliothek-Stämme in die Langzeitspeicherung (-80 ° C Gefrierschrank) so bald wie möglich halten Sie die Bibliothek in guter Qualität und für eine spätere Verwendung bereit. Richtig gepflegt, können Sie die Glycerin-Aktie eingefroren und wieder aufgetaut mindestens 10 mal. Wir empfehlen außerdem, eine Arbeitskopie und backup-Kopien von Glycerin-Lager zu halten. Bei der Arbeit bestand nicht funktioniert, sofort eine neue Arbeitskopie aus der Sicherungskopie.
  8. Inkubieren Sie die YPD-Platten bei 30 ° C für 24 h. Beachten Sie, dass ein Pellet Hefe nach 24 h im unteren Teil jeder gut sichtbar sein wird.
  9. Füllung-96-Well-Platten mit einem minimalen Dropout-Medium mit 2 % Raffinose, entspricht die wählbaren Markierungen auf dem Plasmid in der Abfrage-Belastung sowie auf die Bibliothek Plasmid (z. B.- seine - hier Ura).
  10. Verwenden Sie einen sterilen 96-poligen Replikator Hefe von der YPD Paarung Kulturen zu den selektiven Medien übertragen. Die 96-Well-Platten bei 30 ° C für 48 h Inkubation; nur Hefezellen gedeckt haben und gebildeten diploiden Zellen und daher sowohl die Abfrage Plasmid enthalten und die Bibliothek Plasmid werden sich in diesem Medium wachsen. Feststellen Sie nach 2 Tagen, dass ein Pellet auf dem Boden der Näpfchen sichtbar ist.

(4) Schmierblutungen Assay

  1. Nach 48 h des Wachstums in der Raffinose-haltigen selektivmedien vor Ort die Hefe auf Agarplatten.
    1. Bereiten Sie 2 Sets von Ura seine ausfallende Platten mit 2 % Agar mit klaren Polystyrol-Platten, eine mit 2 % Galaktose und das andere mit 2 % Glukose.
    2. Wirbel der 96-Well-Platten für 1 min bei 1.000 u/min, dann vor Ort die Hefe, die Ura-His-Dropout-Platten mit 2 % Galaktose und 2 % Agar (FUS und Bibliothek Gene induziert) und die Ura-His-Dropout-Platten mit 2 % Glukose und 2 % Agar (FUS und Bibliothek Gene unterdrückt) mit einem Roboter-spotting Maschine, durch die die Kultur in den einzelnen gut auf Agarplatten in vervierfacht fleckig ist (d. h., die Kultur in 1 gut ist gesichtet um 4 Punkte auf der Agarplatte).
    3. Lassen Sie nach dem Absetzen die Agarplatten trocknen, und dann legen Sie sie kopfüber in einem 30 ° C Brutschrank. Fotografieren Sie die Agarplatten alle 24 h eine schneller/mehr Hefe Wachstum verzeichnen, in der die Toxizität der Abfrage Dehnung gerettet wird, oder eine langsamer/weniger Wachstum verzeichnen, in der die Toxizität der Abfrage Dehnung noch verstärkt wird. 4 Tage inkubieren Sie die Platten.
      Hinweis: Die Kultur in jedem kann gut auf Agarplatten 1-zu-1 gesichtet werden, wie in einer vorherigen Umwandlung basierende Methode10gezeigt. Jedoch, die 1 bis 4 hier Schmierblutungen (die bequem aufgestellt werden kann der Roboter spotting maschinenbenutzung) deutlich erhöht die Robustheit des Tests durch die Reduzierung von Fehlalarmen. Positive Treffer gelten nur, wenn alle 4 Kolonien aus der gleichen nun einen ähnlichen Phänotyp zeigen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das ALS-assoziierten Protein FUS, eine RNA/DNA-bindendes Protein, war vorher im haploiden Hefe7,8studiert. Genetisches screening mit der Umwandlung basierende Methode entdeckte mehrere Hefe-Gene, die FUS Toxizität zu unterdrücken. Das menschliche Homolog von eines der Hefe Gene zeigte später wirksam zu unterdrücken Toxizität bei einer primären neuronale Zelle und Rattenmodell ALS13sein. Hier verwenden wir d...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir ein Protokoll um ein Plasmid Überexpression Bildschirm in der Hefe, die zur Einführung der Plasmid-Bibliothek in der Hefe-Modell mit Paarung durchzuführen. Mithilfe dieses Ansatzes können mehrere Hefe-Modelle der Neurodegenerative Krankheit Protein Toxizität gezeigt mit der gleichen Sammlung von Hefe mit einem Plasmid-Bibliothek umgewandelt. Der mühsame Prozess der Transformation muss nur durchgeführt werden, sobald nach dem hocheffizienten Hefe Paarung verwendet wird, um der Plasmid-Bibliothek in de...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir sind dankbar für die nachdenkliche Gespräche mit Mitgliedern der Ju-Labor und Zhong Labor und die finanzielle Unterstützung von der Wright State University.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Lachs

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Spermien-DNA (SS-DNA)Sigma-Aldbsp  D1626
YPD-BouillonResearch Products International (RPI)Y20090
Granulierter AgarFisher SciBP97445
D-(+)-GlucoseResearch Products International (RPI)G32040
D-(+)-GalactoseResearch Products International (RPI)G33000
D-(+)-Raffinose-PentahydratForschungsprodukte International (RPI)R20500
AmmoniumsulfatFisher SciA702-500
Synthetisches Ura-Drop-out-MediumClontech630416
Hefe-Aminosäure-Drop-out-Ergänzung -Histidin/-UracilClontech630422
Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren und AmmoniumsulfatForschungsprodukte International (RPI)Y20060
Dimethylsulfoxid (DMSO)Fisher SciS67496
Lithiumacetat, wasserfreiFisher SciAC268640010
Polyethylenglykol 3350 (PEG-3350)Spectrum ChemicalPO125-12KG
96-poliger ReplikatorScinomixSCI-5010-OS
Nunc OmniTrayThermo Sci140156
Corning Costar 96 Well Assay Platte, runder Boden mit DeckelFisher Sci07-200-760unbehandelt, steril
Eppendorf  Forschung plus MehrkanalpipetteEppendorfTI1369005230-300ul Volumen
Fisherbrand  Isotemp Digital Trockenbäder/BlockheizkörperFisher Sci88-860-023
Eppendorf  MixMateEppendorf21-379-00
Eppendorf 5810R ZentrifugeFisher Sci05-413-112
Avanti J-26 XPI ZentrifugeBeckman393127
MultiFlo FX Multi-Mode DispenserBioTek
Rotor HDA   Sänger Instrumente

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
  2. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
  3. Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
  4. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
  5. Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
  6. Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
  7. Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052(2011).
  8. Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614(2011).
  9. Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
  10. Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836(2011).
  11. Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
  12. Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
  13. Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
  14. Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Yeast MatingPlasmid Library ScreeningFUS ToxicityYeast TransformationGlycerol Stock StorageSelective Medium GrowthRobotic SpottingAgar Plate AssayNeurodegenerative Disease ModelOverexpression Screening

Verwandte Artikel