Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57982
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

Summary

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Abstract

Global gebreken in RNA polymerase II transcriptie kunnen worden overzien door transcriptomic studies analyseren steady-state RNA. Inderdaad, de globale daling in mRNA-synthese is aangetoond te worden gecompenseerd door een gelijktijdige afname van de aantasting van het mRNA om te herstellen van de normale niveaus van de stationaire toestand. De genoom-brede kwantificering van mRNA-synthese, onafhankelijk van mRNA verval, is dus de beste directe reflectie van RNA polymerase II transcriptionele activiteit. Hier bespreken we een methode met behulp geen storing veroorzaakt metabole labeling van ontluikende RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). In het bijzonder de cellen worden gekweekt voor 6 min met een uracil analoge 4-thiouracil en de gelabelde nieuw getranscribeerde RNAs worden gezuiverd en gekwantificeerd om te bepalen van de tarieven van de synthese van alle individuele mRNA. Bovendien, met behulp van label Schizosaccharomyces pombe cellen als interne standaard dit toelaat vergelijken van mRNA-synthese in verschillende S. cerevisiae stammen. Met behulp van dit protocol en de gegevens met een dynamisch kinetische model passend, kunnen de bijbehorende mRNA verval tarieven worden bepaald.

Introduction

Cellen reageren op signalen van endogene en exogene, via de dynamische wijziging van hun gen expressie programma. In de afgelopen jaren kunt een enorme ontwikkeling van genoom-brede methodologieën de nauwkeurige en uitgebreide beschrijving van transcriptome wijzigingen in verschillende omstandigheden. In de meeste studies van de transcriptomic, microarray kruising of high-throughput sequencing worden gebruikt om RNA niveaus van een totale breuk van de stationaire toestand RNA te kwantificeren. Transcriptionele wijzigingen onder een specifieke perturbation kunnen een breed scala van mogelijke uitkomsten, met specifiek gen expressie veranderingen of een groot spectrum van genen up - of werden weergegeven. Genexpressie is het resultaat van een verfijnd evenwicht — of stationaire toestand — tussen RNA synthese van RNA polymerase en andere processen op het gebied van RNA niveaus. RNA polymerase II transcriptie, met inbegrip van haar drie verschillende fasen (initiatie, rek, en beëindiging), is zeer en ingewikkeld gekoppeld mRNA verwerking, cytoplasmatische export, vertaling en afbraak.

Verscheidene recente studies aangetoond dat mRNAs synthese en verval gekoppelde mechanismen en toonde dat transcriptionele effecten bij mutatie of onder prikkels worden over het hoofd gezien kunnen wanneer de totale steady-state RNA te kwantificeren. Ten eerste hangt de detectie van transcriptionele veranderingen door de analyses van de stationaire toestand niveaus van mRNA altijd mRNAs half-life. Zodra de verstoring wordt ingevoerd, zal de steady-state niveaus van mRNAs met lange halfwaardetijd veel minder dan die van mRNAs met korte halfwaardetijd worden beïnvloed. De detecteerbaarheid van de veranderingen in RNA-synthese is daarom sterk bevooroordeeld ten gunste van kortstondige afschriften, terwijl de analyse van langduriger mRNA soorten mislukken te onthullen van dynamische veranderingen in de transcriptie tarief. Ten tweede, verschillende rapporten is gebleken dat zowel in gist en zoogdieren, mondiale veranderingen in de transcriptie worden over het hoofd gezien kunnen bij het analyseren van de niveaus van de stationaire toestand van mRNA. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de mechanismen die link mRNA-synthese en degradatie resulterend in mRNA bufferen. Dit leidde tot de ontwikkeling van nieuwe protocollen te kwantificeren van mRNA-synthese rekken van degradatie, door de analyse van nieuwe getranscribeerde mRNA. In de afgelopen jaren zijn diverse alternatieven ingediend, met inbegrip van mondiale run-on sequencing (GRO-seq)1en inheemse rek transcript sequencing (NET-seq)2,3. Hier, presenteren we een protocol oorspronkelijk is ontwikkeld in zoogdiercellen4,5,6 en vervolgens aangepast aan gist7,8,9,10, 11, die is gebaseerd op RNA labelen met een thiolated nucleoside of base analoog, 4-thiouridine (4sU) of 4-thiouracil (4tU), respectievelijk.

Deze methode specifiek zuivert nieuw getranscribeerde RNA van cellen in welke RNA zijn pols-aangeduid met 4sU met vrijwel geen inmenging in de homeostase van de cel. Zodra de cellen worden blootgesteld aan 4sU, is het molecuul dus snel uptaken, phosphorylated aan 4sU-trifosfaat, en opgenomen in de RNAs wordt getranscribeerd. Als puls-label, is het mogelijk om uit te pakken van totale cellulaire RNA (overeenkomend met de steady-state niveaus van RNA) en vervolgens de 4sU-geëtiketteerden RNA breuk thiol-specifiek is gewijzigd, wat leidt tot de vorming van een Zwavelbrug tussen Biotine en de nieuw Getranscribeerd RNA4,5. 4sU kunnen echter alleen uptaken door de uiting van een nucleoside-vervoerder, zoals de menselijke equilibrative nucleoside vervoerder (hENT1), voorkomen van het directe gebruik ervan in de ontluikende of kernsplijting gist cellen. Terwijl men kon hENT1 S. pombe of S. cerevisiaeexpress, kan een eenvoudiger aanpak worden bereikt met behulp van de gewijzigde basis 4tU, aangezien de gistcellen kunnen duren van 4tU, zonder de behoefte aan expressie van een nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. In feite, het metabolisme van 4tU de activiteit van het enzym uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) vereist. In verschillende organismen, met inbegrip van gist maar niet zoogdieren, is UPRT essentieel voor een pyrimidine berging traject, uracil aan uridine monofosfaat recycling.

Een belangrijke vertekening in transcriptomic studies kan worden ingevoerd door de normalisatie tussen verschillende monsters geanalyseerd in parallel. Inderdaad, de vele afwijkende factoren kunnen invloed hebben op de vergelijkende analyse van de transcriptome van mutant en wild-type stammen: de efficiency van lysis van de cel, verschillen in de extractie en het herstel van RNA, en afwijkingen in de kalibratie van de scanner voor microarray analyse , onder anderen. Zoals hierboven besproken, kunnen dergelijke variaties vooral misleidend zijn als globale effecten op RNA polymerase II transcriptie worden verwacht. Een elegante betekenen voor het nauwkeurig vergelijken van mRNA synthese tarieven tussen de verschillende monsters werd ontworpen met behulp van de verte verwante kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe als een interne standaard. Daarvoor een vast aantal label S. pombe cellen wordt toegevoegd aan de S. cerevisiae monsters, wild-type of gemuteerde cellen, voorafgaand aan cellysis en RNA extractie10. Vervolgens worden zowel stationaire als nieuw samengestelde RNAs van S. pombe en S. cerevisiae gekwantificeerd door RT-qPCR of via het gebruik van spaanders microarray of high-throughput sequencing10. Het combineren van deze gegevens met kinetische modellering, kan absolute van mRNA-synthese en verval in de ontluikende gist worden gemeten.

In het kader van dit manuscript, zullen we laten zien hoe de analyse van nieuwe getranscribeerde RNA toegestaan te onthullen van een mondiale rol voor de coactivator complexen SAGA en TFIID in RNA polymerase II transcriptie in ontluikende14,15gist, 16. Bovenal afgelopen studies gekwantificeerd steady-state mRNA niveaus in S. cerevisiae en gesuggereerd dat SAGA speelt een overheersende functie op een beperkt aantal gist genen die sterk beïnvloed door mutaties in SAGA, maar relatief resistent tegen TFIID mutaties17,18,19. Verrassend, werden de SAGA enzymatische activiteiten getoond om op te treden op het hele getranscribeerde genoom, suggereren een bredere rol voor deze co activator in RNA polymerase II transcriptie. Verminderde RNA polymerase II recruitment meest uitgedrukte genen werd waargenomen op de inactivering van SAGA of TFIID, suggereren dat deze coactivators samen op de meeste genen werken. Vandaar, de kwantificering van nieuw getranscribeerde mRNA geopenbaard dat SAGA en TFIID nodig voor de transcriptie van bijna alle genen door RNA polymerase II14,15,16 zijn. De toepassing van compenserende mechanismen komt naar voren als een manier voor de cellen om te gaan met een algemene afname van de mRNA-synthese die door een gelijktijdige wereldwijde afname van de aantasting van het mRNA is gebufferd. SAGA toegevoegd aan de lijst van factoren die een globaal effect op RNA polymerase II transcriptie, zoals RNA Pol II subeenheden10, de bemiddelaar coactivator complexe20, de algemene transcriptie factor TFIIH21,22 , en indirect, elementen van de mRNA afbraak machines9,10,23. Dergelijke compenserende evenementen werden universeel waargenomen in SAGA mutanten, administratieve verwerking van de bescheiden en beperkte veranderingen in stationaire toestand mRNA niveaus ondanks een globale en ernstige daling in mRNA synthese14. Soortgelijke analyses werden ook uitgevoerd in een BRE1 schrapping stam, wat resulteert in een volledig verlies van Histon H2B ubiquitination. Interessant is dat kon een veel mildere maar consistent globaal effect op RNA polymerase II transcriptie worden opgespoord in de afwezigheid van Bre1, die aangeeft dat metabole labeling van nieuw getranscribeerde RNA in gist kan detecteren en kwantificeren van een breed scala van veranderingen in mRNA synthese tarieven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cel kweken en Rapamycin uitputting van een Subunit SAGA

  1. Voor elke S. cerevisiae stam en repliceren enten met inbegrip van wild-type of control stammen, een één kolonie van een verse plaat op 5 mL van YPD medium (2% pepton, gistextract 1% en 2% glucose).
  2. S. cerevisiae cellen 's nachts bij 30 ° C met constante agitatie (150 rpm) groeien.
  3. Meten van de extinctie op 600 nm (OD600) en Verdun de cultuur op een600 van de OD van ongeveer 0.1 in 100 mL van YPD medium en laten groeien tot de OD600 rond 0,8 is.
  4. Parallel, enten een één kolonie van S. pombe cellen uit een verse plaat op 50 mL van Ja medium (0,5% gistextract; 250 mg/L adenine, histidine, uracil, leucine en lysine; 3% glucose) en groeien de cellen 's nachts bij 32 ° C, met constante agitatie (150 rpm).
  5. Meten van de OD600 van de S. pombe overnachting cultuur en verdunnen van de cultuur op een600 van de OD van ongeveer 0.1 in 500 mL ja voedingsbodem en laten groeien tot de OD600 ongeveer is 0,8.
  6. Voor elke S. cerevisiae anker-away stam en repliceren enten met inbegrip van wild-type of control stammen, een één kolonie van een verse plaat op 5 mL van YPD medium (2% pepton, gistextract 1% en 2% glucose).
  7. Groeien de cellen 's nachts bij 30 ° C met constante agitatie (150 rpm).
  8. De volgende ochtend, meten van de OD600, Verdun de cultuur op een600 van de OD van ongeveer 0.1 in 100 mL van YPD medium en laten groeien tot de OD600≈ 0.8.
  9. Voeg 100 µL van rapamycin aan de cultuur van een stamoplossing van 1 mg/mL (laatste rapamycin concentratie 1 µg/ml) en laat de cellen Incubeer bij 30 ° C met constante agitatie voor de tijd die nodig is voor de proteïne van belang worden voorwaardelijk uitgeput van de nucleus ( 30 min is meestal voldoende). Voor het besturingselement, gebruiken een soortgelijke gist-cultuur, maar in plaats van toe te voegen rapamycin, voeg de gelijkwaardige hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO).

2. 4tU labelen met S. pombe als een Spike (Counting)

  1. Bereid een verse oplossing van 2 M 4-thiouracil. Zodra voorbereid, houd het op kamertemperatuur en weg van licht.
    1. Nauwkeurig wegen 64.1 mg 4-thiouracil voor elke cultuur S. cerevisiae en los het dan op in 250 µL van dimethylformamide (DMF) of 250 µL van DMSO.
    2. Voor de cultuur van de S. pombe moet worden gebruikt als spike, weeg 320.5 mg 4-thiouracil en los het in 1250 µL van DMSO.
  2. De 4-thiouracil-oplossing toevoegen aan S. cerevisiae en S. pombe culturen voor een eindconcentratie van 5 mM en uit te broeden ze voor 6 min met constante agitatie bij 30 ° C en 32 ° C, respectievelijk.
  3. Verwijder na 6 min, een kleine hoeveelheid van elke cultuur voor het tellen van de cel. Met behulp van een automatische cel teller of een kamer Neubauer cellen tellen.
  4. Verzamelen van de cellen door middel van centrifugeren (2.500 x g) gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  5. Verwijder het supernatant, wassen van de cellen met ijskoude 1 x PBS en centrifuge opnieuw (2.500 x g, 4 ° C, 5 min).
  6. Bereken het totale aantal cellen in elk van de monsters S. cerevisiae en S. pombe .
  7. Resuspendeer de cellen in 5 mL ijskoud 1 x PBS en S. cerevisiae meng met S. pombe cellen met een 3:1 verhouding.
  8. Centrifugeer de cellen (2.500 x g, 4 ° C, 5 min), verwijderen de PBS, flash-freeze de cellen in vloeibare N2en bewaren van het monster bij-80 ° C tot verder gebruik.

3. RNA extractie en DNase behandeling

  1. Ontdooi de cellen op het ijs voor ongeveer 20-30 min.
  2. Ga verder met de RNA extractie met behulp van een gist-RNA extractie kit (Tabel of Materials) met een paar aanpassingen.
  3. Per elk monster, giet u 750 µL van ijskoude Zirkonia kralen in een buis van de 1.5-mL schroefdop die bij de kit geleverd. Houd in gedachten dat per elke buis, RNA van maximaal 109 cellen efficiënt kan worden geëxtraheerd. Daarom bereid het aantal buisjes nodig voor elk monster. Bijvoorbeeld, een cultuur van S. cerevisiae van 100 mL (OD600≈ 0.8) kan ertoe leiden dat ongeveer 2 x 10,9 tot en met 3 x 109 cellen, aanloop naar een totaal van 2,7 x 109 tot en met 4 x 109 cellen in totaal (na de piek-in met een derde van de S. pombe cellen). In dit geval zou maximaal 3-4 reactie buizen per elk monster/conditie/mutant/repliceren nodig.
  4. Per elke 1 x 109 cellen, 480 µL van de lysis-buffermengsel voorzien van de kit, 48 µL van 10% SDS en 480 µL van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, v/v/v) toevoegen.
  5. Meng de cellen met behulp van een vortex-mixer en hen overbrengen in de buizen met de ijskoude Zirkonia kralen.
  6. Geschikt voor de buizen op een vortex-mixer adapter, draai de vortex op maximale snelheid en verslaan voor 10 min Lyse de gistcellen (in een kamer bij 4 ° C). Als alternatief, voer lysis van de cellen in een automatische kraal-beater.
  7. Centrifugeer buizen bij 16.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zorgvuldig verzamelen de bovenste fase (RNA-bevattende) voor een tube van de falcon vers 15 mL. Het volume per elke buis hersteld is meestal rond 500-600 µL.
  8. Toevoegen aan de 15 mL tubes met de gedeeltelijk gezuiverde RNA, de bindende buffer voorzien van de kit en meng grondig. Per elke 100 µL van RNA oplossing, Voeg 350 µL van bindende buffer (dat wil zeggen, wanneer het volume van de waterfase oplossing 600 µL, 2.1 mL van de buffer bindend is moeten worden toegevoegd).
  9. Aan het voorgaande mengsel, het toevoegen van de 100% ethanol en meng. Per elke 100 µL van RNA oplossing, voeg 235 µL van 100% ethanol (dat wil zeggen, wanneer het volume van de waterfase oplossing is 600 µL, 1.41 mL ethanol toevoegen).
  10. Breng maximaal 700 µL van het mengsel uit stap 3.9 een filterpatroon geassembleerd in een collectie buis, beide voorzien van de kit.
  11. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 16.000 x g. Als het centrifugeren duur niet genoeg voor het totale volume was aan het filter passeren, herhaalt u het centrifugeren voor 30 s.
  12. Negeren de doorstroming en hergebruiken van de dezelfde collectie buis. Voeg een andere 700 µL van RNA-bindende buffer-ethanol oplossing aan de filter en centrifuge weer bij 16.000 x g voor 1 min.
  13. Negeren de doorstroming en herhaal stap 3.11 en 3.12 totdat de RNA-oplossing is voltooid.
  14. Was het filter 2 x met 700 µL oplossing 1 te wassen. Verzamel oplossing via centrifugeren in de wasmachine bij 16.000 x g gedurende 1 minuut en houd altijd de collectie buis.
  15. Was het filter 2 x met 500 µL oplossing 2 te wassen. Verzamel oplossing via centrifugeren in de wasmachine bij 16.000 x g gedurende 1 minuut en houd altijd de collectie buis.
  16. Centrifugeer de buizen nogmaals bij 16.000 x g gedurende 1 minuut volledig drogen het filter.
  17. Het filterelement overbrengen in de laatste collectie buis (RNA-geschikte buis) en elueer RNA met 50 µL van DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O (voorverwarmd tot 100 ° C).
  18. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 16.000 x g.
  19. Elueer RNA weer (aan de dezelfde buis) met 50 µL voorverwarmde DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O. ervoor dat al het volume heeft doorgegeven door het filter; anders, Centrifugeer gedurende langere periodes.
  20. Als meerdere buizen voor één enkel monster worden gebruikt, bundelen ze allemaal in één buis.
  21. Kwantificeren en controleer de zuiverheid van het monster met behulp van de juiste apparatuur.
    Opmerking: Terwijl 4tU alleen in nieuw samengestelde RNA opgenomen is, is er een kans van secundaire besmetting met DNA. Om die reden, het is altijd aan te raden voor de behandeling van de monsters met DNase ik. Gebruik daarvoor de reagentia voorzien van de RNA-extractie kit (Tabel of Materials) na de aanbevelingen van de fabrikant.

4. thiol-specifieke Biotinylation van nieuw samengestelde RNA

  1. Aanpassen van de concentratie van het RNA verkregen met punt 3 van het protocol tot 2 mg/mL. Aliquoot 200 µg totaal RNA, het gedurende 10 minuten bij 60 ° C verwarmen en koelen het onmiddellijk op het ijs gedurende 2 minuten.
  2. Toevoegen aan het RNA afgepipetteerde deel, de reagentia die hieronder vermeld in de volgende volgorde: 600 µL van DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O, 100 µL van biotinylation buffer (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] en 10 mM EDTA, DEPC-op dezelfde manier afgehandeld, RNase-vrije H2O), en 200 µL van Biotine-HPDP uit een voorraad van 1 mg/mL Biotine-HPDP in DMSO of DMF.
    1. In sommige situaties neiging de Biotine-HPDP-oplossing te precipiteren, waarschijnlijk als gevolg van zijn lage oplosbaarheid in water. In deze situatie, Verhoog het volume van DMSO/DMF tot 40% van het volume van de reactie (aan het RNA-monster, toevoegen 400 µL van DEPC-behandelde H2O, 100 µL biotinylation buffer en 400 µL van biotine-HPDP uit een voorraad van 0,5 mg/mL).
  3. Incubeer het monster bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht voor 3 h, met zachte agitatie.
  4. Na incubatie, toevoegen van een ongeveer gelijke volume van chloroform om de buizen en krachtig mengen.
  5. Draai het monster bij 13.000 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C. Deze stap kan het verwijderen van overtollige Biotine dat deed niet biotinylate de RNA. Als alternatief, voer deze stap met behulp van fase-lock buizen (zware). Daarvoor, spin down de fase-lock buizen voor 1 min bij 13.000 x g, voeg het mengsel van RNA en een gelijke hoeveelheid van chloroform, meng ze krachtig en centrifugeer ze bij 13.000 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
  6. Breng zorgvuldig de bovenste fase in nieuwe 2 mL buizen.
  7. Voeg een tiende van het volume van 5 M NaCl en meng van het monster.
  8. Voeg een gelijke hoeveelheid isopropanol toe, meng het monster en draai het bij 13.000 x g gedurende ten minste 30 minuten, bij 4 ° C.
  9. Voeg voorzichtig het supernatant verwijderen en voeg 1 mL ijskoud 75% ethanol.
  10. Draaien op 13.000 x g gedurende 10 minuten, bij 4 ° C.
  11. Zorgvuldig Verwijder supernatant, quick-spin de buis, en de resterende ethanol-oplossing. Zorg ervoor dat de RNA-pellet niet droogt.
  12. Opschorten van de RNA in 100 µL DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O.

5. reiniging van nieuw samengestelde breuk van totale en labelloze RNA met streptavidine beklede magnetische kralen

  1. Verhit de biotinyleerd RNA gedurende 10 minuten bij 65 ° C en vervolgens koelen de monsters op ijs gedurende 5 minuten.
  2. Voeg 100 µL van daar beklede magnetische kralen aan de biotinyleerd RNA (bij een eindvolume van 200 µL). Specifiek, is het aanbevolen om het gebruik van de kralen die is aangegeven in de Tabel van materialen, sinds, na gesprekken met andere laboratoria, deze leek het meer consistent en betrouwbaar.
  3. Incubeer het monster met lichte schudden voor 90 min, bij kamertemperatuur.
  4. Plaats de kolommen de kit (Tabel van materialen) in de magnetische standaard voorzien.
  5. Voeg 900 µL van kamertemperatuur wassen buffer (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl, en 0,1% Tween 20, DEPC-op dezelfde manier afgehandeld, RNase-vrije H2O) naar de kolommen (vooraf uitvoeren en equilibreer).
  6. Kralen/RNA mengsel (200 µL) toepassen op de kolommen.
  7. Verzamel de doorstroming in 1.5-mL buizen en opnieuw toepassen op dezelfde magnetische kolom. Indien nodig, houden deze doorstroomtest zoals het vertegenwoordigt de labelloze RNA-Fractie.
  8. Was de kolommen 5 x met toenemende volumes buffer te wassen (600, 700, 800, 900 en 1000 µL).
  9. Elueer de nieuw samengestelde RNA met 200 µL van 0,1 M DTT.
  10. Een tweede elutie, 3 min later, met een gelijk volume van 0,1 M DTT uitvoeren.
  11. Na eluerende RNA, toevoegen van 0.1 volumes van 3 M NaOAc (pH 5.2), 3 volumes ijskoude 100% ethanol en 2 µL van 20 mg/mL glycogeen (RNA-grade) en laat de RNA overhaaste overnachting, bij-20 ° C.
  12. Herstellen van het RNA door centrifugeren (13.000 x g gedurende 10 minuten, bij 4 ° C) en resuspendeer het in 15 µL van DEPC-behandeld, RNase-vrije H20. Het aandeel van de label-naar-totaal RNA naar ongeveer 2-4% (meestal meer richting de onderkant), waardoor ongeveer 2,0 µg nieuw samengestelde RNA verwachting. Deze hoeveelheid is genoeg te doen verschillende experimenten van de qPCR, evenals voor microarray/sequencing analyses.

6. RT-qPCR validatie van de verschillende fracties

  1. Synthetiseren cDNA van 2 µg totaal RNA of 10 µL van gelabelde RNA met willekeurige hexamers en de reverse-transcriptase van keuze, volgens de instructies van de fabrikant (Tabel van materialen).
  2. CDNA versterken door real-time qPCR met behulp van een standaard protocol (Tabel van materialen).
    Opmerking: Alle monsters moeten in drievoud met een minimum van twee biologische replicatieonderzoeken worden uitgevoerd. Corrigeer alle ruwe waarden voor de uitdrukking van S. pombe tubuline.

7. de Microarray kruising

  1. RNA monsters op de spaanders van de voorkeur microarray volgens de instructies van de fabrikant te vermengen (Zie Tabel van materialenvoor dit specifieke protocol). Kort, bereiden biotinyleerd cRNA doelstellingen van 150 ng van RNA met behulp van de Premier RNA amplificatie Kit (Tabel of Materials), volgens de instructies van de fabrikant. 4 mg versnipperde cRNAs voor 16 h bij 45 ° C en 60 rpm op spaanders microarray te vermengen.
  2. Wassen, vlekken en scan de chips met behulp van het opgegeven station en de scanner (Tabel van materialen). Pak de onbewerkte gegevens (CEL intensiteit bestanden) van de gescande beelden met behulp van de opdrachtenconsole (AGCC, versie 4.1.2).
  3. De bestanden van de CEL met expressie Console softwareversie 1.4.1 om te berekenen sonde signaal intensiteit, met behulp van de statistische gegevens gebaseerde algoritmen MAS 5.0 met standaardinstellingen en wereldwijde geschaalde uitbreiding als normalisatie methode verder te verwerken.
    Opmerking: De intensiteit van de bijgesneden gemiddelde doel van elke chip was willekeurig ingesteld op 100. Het uitvoeren van alle experimenten met behulp van ten minste twee onafhankelijke biologische wordt gerepliceerd. Normaliseren van onbewerkte gegevens aan de S. pombe signaal en vouw veranderingen in totale en nieuw samengestelde RNA te berekenen.

8. de data-analyse met behulp van een bestaande R-pijpleiding

  1. Berekenen van synthese en verval tarieven met behulp van een pijplijn en R/Bioconductor pakket openbaar toegankelijk is, als eerder beschreven8,10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bij het uitvoeren van metabole labeling van nieuw getranscribeerde RNA, verschillende aspecten moeten worden gecontroleerd: de tijd en de efficiëntie van de etikettering, de spike-in verhouding, het protocol van de extractie en de doeltreffendheid van de biotinylation (inclusief signal-to-noise verhouding), onder anderen. Deze voorwaarden zijn uitgebreid en methodisch aangetoond door anderen7,10,11. Hier zijn wij vooral gericht op de interpretatie en de onmiddellijke analyses die kunnen worden uitgevoerd zodra de monsters zijn afgehandeld, ofwel door RT-qPCR, microarray of rangschikken. De analyses van verschillende gemuteerde stammen tonen de kracht van de methode voor het detecteren van niet alleen een dramatische globale daling in mRNA-synthese, zoals in het geval van SAGA mutant S. cerevisiae stammen, maar ook een zeer milde vermindering van RNA polymerase II activiteit op onderdrukking van Histon H2B monoubiquitination.

Onze analyses van SAGA enzymatische activiteiten voorgesteld een brede werving chromatine15, die niet werd geopenbaard door de analyse van de stationaire toestand mRNA niveaus in SAGA gemuteerde stammen. Zoals RNA polymerase II aanwerving verminderde na inactivatie van de SAGA was, besloten hebben we om te analyseren of mRNA synthese tarieven wereldwijd zou worden beïnvloed. Vandaar, wild-type of gemuteerde stammen van S. cerevisiae werden blootgesteld aan 4tU voor een periode van 6 min naar nieuw getranscribeerde RNAs label. Na het mengen met de Prikker-gelabelde cellen (S. pombe) in een verhouding van 3:1, totaal RNA is uitgepakt, en nieuw samengestelde RNA was biotinyleerd en gezuiverd volgens het protocol gepresenteerd hier, net als in de chronogram afgebeeld in Figuur 1. Gelabelde RNAs werden gezuiverd van een totaal van 200 µg van RNA, ervoor te zorgen dat de hoeveelheid gezuiverde product zou voldoende zijn voor alle downstream-toepassingen. Als een eerste en systematische stap vóór elke genoom-brede analyse, werd nieuw samengestelde RNA zuivering gevalideerd door RT-qPCR. Genen uitgekozen volgens verschillende parameters, met inbegrip van een niveau van meningsuiting, regelgevende trajecten en een afhankelijkheid van verschillende RNA polymerase.

Om te bevestigen dat dit protocol specifiek gelabelde RNA zuivert, gekwantificeerd wij de niveaus van afschriften in breuken gezuiverd uit wild-type cellen die werden gekweekt met of zonder 4tU. Te verwaarlozen achtergrondniveaus van de geanalyseerde RNAs werden ontdekt uit cellen die niet werden blootgesteld aan 4tU(Figuur 2). Nieuw getranscribeerde RNA zuivering werd verder gevalideerd door de waargenomen verrijking van de intron-bevattende ACT1 pre-mRNA (gegevens niet worden weergegeven). Na validatie van de kwaliteit van de monsters, of wij getest mRNA-synthese op verwijdering van SPT20, waarvan bekend is dat het verstoren van de SAGA complexe vergadering zou worden beïnvloed. Zoals gemeld door anderen, geopenbaard mRNA kwantificering uitgevoerd op totale (stationaire toestand) RNA van de stam van de Δ spt20meestal ongewijzigd of enigszins lagere niveaus voor de geteste genen (Figuur 2B). Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor stammen verwijderd voor BRE1 (Figuur 2B). In tegenstelling, het onderzoek van nieuwe getranscribeerde RNA van de stam van de Δ spt20bleek een dramatische daling in mRNA-synthese door drie-tot vijfvoud is al getest genen (Figuur 2C). Het verlies van Bre1 geleid tot een daling van het meer discreet maar nog steeds zichtbaar in nieuw samengestelde mRNA niveaus voor de bestudeerde genen (Figuur 2C). In goede overeenkomst met een rol van SAGA en Bre1 in RNA polymerase II transcriptie, het verlies van Spt20 of Bre1 beïnvloedde niet de expressie van genen die RDN25 of snR6 , getranscribeerd door RNA-polymerase I en RNA polymerase III, respectievelijk ( Figuur 2C).

Echter weergeven stammen verwijderd voor structurele subeenheden van de SAGA complex, zoals SPT7 of SPT20, ernstige zacht-groei fenotypen die goed zijn voor de waargenomen transcriptionele wijzigingen Om uit te sluiten ongewenste neveneffecten, dat we uitgeput voorwaardelijk Spt7 van de kern, met behulp van anker-away S. cerevisiae stammen14,24. Op 60 min van rapamycin behandeling, voorafgaand aan de pols-labelen met 4tU (Zie Figuur 1 voor een schematische voorstelling), nieuw getranscribeerde mRNA niveaus werden teruggebracht tot een vergelijkbare mate als die is waargenomen in de schrapping stam (figuur 2D en 2E ). Deze analyse, dus onze voormalige resultaten bevestigd en het protocol voor dit systeem afleidbare uitputting gevalideerd. In een tijdsverloop analyse, waar cellen werden blootgesteld aan rapamycin voor een tijd, variërend van 0 tot 240 min, was verminderde expressie blijkt onmiddellijk na 15 min van blootstelling aan de drug. Meer interessant, steady-state mRNA niveaus de neiging om in eerste instantie verminderen maar keerde terug naar normale niveaus na 60 min, een indicatie dat een compensatieregeling in de tussentijd(Figuur 2 plaatsvindt).

Over het geheel genomen toegestaan de etikettering en de kwantificering van de nieuw samengestelde RNA onthullen nieuwe regelgevende taken voor de SAGA-complex. De beschreven protocol ook matige effecten op RNA polymerase II activiteit kan onthullen en werd met succes toegepast op voorwaardelijke uitputting giststammen.

Een van de downstream toepassingen voor het gezuiverde nieuw samengestelde RNA is een genoom-brede kwantificering van afschriften gebruiken microarray kruising of rangschikking (4tU-seq). Terwijl hoge gegevensdoorvoer rangschikken meer kwantitatieve, gevoelige en informatief is, kunnen microarray kruising zeer nuttig zijn om te bepalen of de globale mRNA niveaus worden gewijzigd. In deze context waar normalisatie cruciaal is, we een organisme spike-in toegevoegd aan het monster dat we gericht om te analyseren. Specifiek, we gemengd S. cerevisiae cellen naar S. pombe cellen in een verhouding van 3:1, beide eerder blootgesteld aan 4tU. Wanneer de RNAs gezuiverd, gelabeld zijn onderworpen aan high-throughput sequencing, kan standaard bibliotheek voorbereiding protocol worden gebruikt, meestal na uitputting van ribosomaal RNA. Normalisatie tussen 4tU-seq gegevens van verschillende steekproeven is verricht door toe te voegen of het label van RNA uit een verschillende soorten (dat wil zeggen, mengen S. cerevisiae en S. pombe als boven cellen)22 of in vitro- ««««getranscribeerd, thiolated spike-in RNA12,25,26,27. Verkrijgbare microarray chips bevatten sondes voor hele transcriptome van zowel beginnende als kernsplijting gist, waardoor de kwantificering van mRNA uit beide organismen in één enkele experiment. Microarray kruisingen werden uitgevoerd met totale en nieuw samengestelde RNA gevalideerd door RT-qPCR zoals hierboven (wild-type, spt20Δ en bre1Δ). Bovendien omvatten wij een spanning die geen monoubiquitination van Histon H2B, via punt mutatie van het residu van de ubiquitinable (K123R ondersteunt). Omdat de exacte hetzelfde aandeel van S. pombe cellen werden gebruikt in de verschillende monsters en replicaten, is het mogelijk om deze lineair de arrays intensiteiten zodat de totale en gelabelde S. pombe sondes hebben dezelfde gemiddelde intensiteit. Deze normalisatie, of herschalen, kan worden uitgevoerd met behulp van een Bioconductor -pakket ontwikkeld door het laboratorium van Patrick Cramer en is gebruikt in parallel in alle geanalyseerde monsters, totale en het label van breuken en wild-type en mutanten stammen8. Kortom, de inbreng van deze pijpleiding is een Excel-bestand met de sondes en hun intensiteit (MAS5 of RMA) voor alle monsters en breuken. Na uitsluiting van sondes die buiten het bereik van de opsporing, de signaalsterkte is schaal gebracht weglating, rekening houdend met de intensiteitswaarden van de S. pombe sondes. Ten slotte kunt u toewijzen de sondes aan de ontluikende en kernsplijting gist genoom, eindigend met een matrix met de waarden van de expressie voor de spike genormaliseerd. Deze waarden verder kunnen worden verwerkt (zie volgende sectie) of gebruikt als is. In het volgende voorbeeld vastbesloten wij dat de vouw wijzigen van elke transcript tussen de mutant en de stam van de wild-type.

De analyses werden uitgevoerd voor beide steady-state of nieuw gesynthetiseerd niveaus van RNA en uitgezet tegen hun statistische significantie (p-waarde) (Figuur 3). In overleg met andere studies, wanneer de totale RNA niveaus werden geanalyseerd, alleen een paar genen had hun uitdrukking gewijzigd, up- of werden (figuur 3A-3 C). De analyse van nieuwe getranscribeerde RNA leidde echter tot opvallend verschillende conclusies. De nieuwe getranscribeerde mRNA niveaus van meer dan 4.000 genen werden aanzienlijk verlaagd door minstens tweeledig op verwijdering van SPT20, hetgeen wijst op een globale positieve effect van SAGA op RNA polymerase II transcriptie in ontluikende gisten (Figuur 3D ). Bovendien, in de bre1Δ en K123R mutanten, de resultaten waren meer discreet: meeste genen leek te hebben van hun uitdrukking verminderd, maar de omvang van Downregulatie en het aantal aanzienlijk betrokken genen (≈ 300-500) was inderdaad meer beperkt (figuur 3E en 3F).

Zoals eerder vermeld, steady-state of totale niveau van mRNA worden gedicteerd door het strakke evenwicht tussen synthese en verval (Figuur 4A). RNA polymerase II transcriptie wordt wereldwijd bijzondere waardevermindering heeft ondergaan, twee scenario's kunnen worden geschetst: (i) hetzij de totale mRNA niveaus dalen wereldwijd, als een reactie op de verminderde synthese maar constante verval, of (ii) mRNA afbraak wordt verlaagd in dezelfde mate, resulterende in meestal onveranderd steady-state mRNA niveaus. Het tweede scenario is gemeld voor verschillende aandoeningen, met inbegrip van in het kader van SAGA of TFIID verstoring9,10,14,16,22. Een procedure genaamd vergelijkende dynamische transcriptome analyse (cDTA) op basis van 4tU labeling en dynamische kinetische modellen kan we afleiden van de verval-tarieven voor elke transcript8,10te bepalen van mRNA-synthese. Nogmaals, profiteerde we van de gegevens die worden verzameld voor de eerder genoemde stammen (wild-type, spt20Δ, bre1Δ en K123R). Zoals verwacht, na schrapping van SPT20, zien we een gelijktijdige afname van de mRNA synthese en degradatie tarieven in vergelijking met de wild-type stam. In dit gemuteerde stam, de compensatie was bijna optimaal, met een gemiddelde afname synthese van 3.8-fold en een gemiddelde afname van verval van het 4.1-fold (Figuur 4B), ondersteunend waarom slechts in beperkte mate transcriptionele wijzigingen zou gevonden op totale mRNA niveaus (Figuur 3A). In de twee andere gemuteerde stammen (bre1Δ en K123R), werden de daarmee gepaard gaande wijzigingen in mRNA-synthese en verval ook waargenomen, maar de veranderingen waren op een veel kleinere schaal en meer verspreide (figuur 4C en 4 D).

Figure 1
Figuur 1 : Schematische weergave van de metabole labeling van RNA met behulp van 4tU. Vers bereide 4tU wordt toegevoegd aan het kweekmedium en cellen zijn gelabeld voor 6 min. Labeled S. cerevisiae en S. pombe cellen zijn gemengd in een verhouding van 3:1 en totaal RNA wordt geëxtraheerd. Daarna nieuw gesynthetiseerd RNA is biotinyleerd en gezuiverd kan worden met behulp van magnetische kralen daar beklede. Ten slotte, totaal (stationaire toestand) RNA en nieuw samengestelde label RNA kan worden gebruikt in een verscheidenheid van downstream toepassingen, inclusief RT-qPCR en microarray kruising of volgorde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Analyse beeltenis van transcriptionele veranderingen in beide steady-state en nieuw Getranscribeerd RNA bepaald door RT-qPCR. (A) RNA niveaus van vijf verschillende genen uit de gelabelde RNA afvalfractie gezuiverd van wild-type cellen die werden of blootgesteld of niet naar 4tU werden gekwantificeerd. De volgende twee panelen tonen (B) totale en (C) nieuw gesynthetiseerd kwantificering van het RNA door RT-qPCR voor wild-type (WT), spt20Δ en bre1Δ gistcellen. Spt7 anker-away stammen, onbehandeld of behandeld met rapamycin voor 60 min, werden aangeduid met 4tU, en (D) totaal of (E) nieuw Getranscribeerd RNA werd gekwantificeerd door RT-qPCR. (F) dit paneel toont dat de tijd-cursus analyse van veranderingen in de stationaire toestand en nieuw gesynthetiseerd mRNA op Spt7 nucleaire uitputting. Voor alle monsters, werden mRNA niveaus voor vijf RNA polymerase II genen gekwantificeerd door RT-qPCR. RNA polymerase I en RNA polymerase III genen (RDN25 en snR6, respectievelijk) werden gebruikt als controle. Expressie waarden (bedoel ± SD van drie onafhankelijke experimenten) waren genormaliseerd naar de spiked-in S. pombe signaal en ingesteld op 1 in de controlemonster. Panelen- D-F zijn van Baptista et al. gewijzigd 14. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Genoom-brede analyse van mRNA niveaus met behulp van totale of gelabelde RNA breuken. Deze panelen Toon vulkaan percelen weergegeven: Vouw veranderingen in de (A-C) steady-state mRNA niveaus of (D-F) nieuw gesynthetiseerd mRNA niveaus ten opzichte van hun betekenis (p-waarde). De wijzigingen van de vouw (FC) werden berekend als de log2 van de verhouding van de waarde van de expressie van elk gen na normalisatie aan de S. pombe signaal in de (A en D) spt20Δ, (B en E) bre1-Δ, of () C en F) K123R ten opzichte van de waarde van de expressie van hetzelfde gen in wild-type S. cerevisiaestam. Een totaal van 5,385 genen werden geanalyseerd en drempels van tweeledig wijzigen (blauwe stip: meer dan een tweeledig verkleint en met een gele stippen: meer dan een dubbele verhoging) en 0,05 p-waarden werden beschouwd. Panelen A en D zijn gewijzigd van Baptista et al. 14. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Parallelle wijzigingen in mRNA-synthese en mRNA verval resultaten in mRNA bufferen. (A) dit paneel een schematische voorstelling afgebeeld van de uitkomst van RNA synthese perturbation op stationaire RNA niveaus. (B-D) Deze panelen tonen de berekening van mRNA-synthese en de tarieven van het verval van de analyses van totale en nieuw samengestelde RNA. De synthese en verval tarieven werden bepaald voor elke S. cerevisiae transcript in (B) spt20Δ, (C) bre1Δ en (D) K123R. Veranderingen (berekend als de log2 van de verhouding tussen de mutant en wild-type) in synthese tarieven werden uitgezet tegen veranderingen in verval tarieven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Terwijl genoom-brede tools om te analyseren van wijzigingen in de transcriptie nog steeds verbeteren zijn, kan de enige analyse van transcriptome door middel van de kwantificering van de stationaire toestand niveaus van RNA niet nauwkeurig overeen wijzigingen in RNA polymerase II activiteit. Inderdaad, mRNA niveaus worden geregeld, niet alleen door RNA-synthese, maar ook door hun rijping en afbraak. Voor het meten van mRNA-synthese rekken van mRNA afbraak, zijn verschillende protocollen ontwikkeld in de afgelopen jaren voor de analyse van ontluikende transcriptie in zowel de gist en de zoogdieren.

Een van de meest gebruikte protocollen voor de kwantificering van de ontluikende transcriptie is GRO-seq1. Terwijl de belangrijkste voordeel GRO-seq haar vermogen om te onthullen transcriptionally betrokken en actieve polymerase op hoge resolutie en lage achtergrond is, heeft twee verschillende punten die de aantrekkelijkheid te verminderen: (i) het is technisch uitdagende en vereist de isolatie van kernen en (ii) kernen manipulaties voeren sommige verstoringen op de systeem-28. Een ander alternatief is NET-seq, die gebaseerd op de volgorde van de 3' einden van afschriften bij immunoprecipitation van het extreem stabiel ternaire complex gevormd tussen ontluikende RNA, sjabloon DNA en RNA polymerase II verkregen is. Deze aanpak maakt het mogelijk de karakterisatie van ontluikende RNAs bij een basenpaar resolutie en vindt mRNA verwerking evenementen door middel van immunoprecipitation van gemodificeerde RNA polymerase II (serine-5 fosforylatie, bijvoorbeeld)2,3 , 29. toch presenteert het sommige obstakels, waaruit wij aandacht vestigen op drie. Eerst, terwijl antilichamen gericht op RNA polymerase II meestal zeer specifiek zijn, het hangt antilichaam efficiëntie. Ten tweede, RNA misschien wel gevoelig voor afbraak tijdens de incubatie periodes, waardoor ons terug naar het vorige punt (minder efficiënt antilichamen wellicht langer incubatie tijden, waardoor het RNA gevoeliger voor aantasting)29. Derde, en met name in zoogdieren, de MNase spijsvertering en maat keuze kunnen uitsluiten unieke reeks uitlijning29,30.

Hier voorgesteld hebben we een gedetailleerd protocol voor de metabole etikettering van nieuw samengestelde RNA 4tU met S. cerevisiae , dat verschillende voordelen in vergelijking met andere beschikbare benaderingen heeft. Omdat transcriptie zeer gevoelig voor verstoringen is, moeten de cellen onder de meeste fysiologische omstandigheden worden gehandhaafd. GRO-seq impliceert bijvoorbeeld de arrestatie van transcriptionally betrokken RNA polymerase II via Gasbedwelming met behulp van de cellen/kernen sarkosyl. Sarkosyl behandeling is echter bestempeld als remmende voor diverse cellulaire processen11. In dit geval, metabole labelen met 4tU of 4sU op de beschreven concentratie is geen storing veroorzaakt en heeft geen zichtbaar invloed op de cel homeostase, vooral voor korte periodes van blootstelling. In tegenstelling tot andere methoden met behulp van remming van de transcriptie voor het meten van de mRNA halfwaardetijd, bepaalt cDTA of 4tU-seq en montage met dynamische modellering afbraak tarieven van elke één mRNA in onverstoorbaar cellen. Één enkele methode kan dus gelijktijdig worden aangepakt zowel de synthese en de tarieven van verval van de hele transcriptome op een specifieke celtype. Aangezien cDTA of 4tU-seq gebruik van zeer betrouwbare normalisatie methoden maakt, namelijk door het gebruik van piek-, kan verschillende datasets worden geanalyseerd samen en rechtstreeks met elkaar vergeleken. Ten slotte, metabole labeling en kwantificering van de nieuw samengestelde RNA is een techniek die eenvoudig kan worden geïmplementeerd in een laboratorium voor moleculaire biologie zoals op niet ieder specifieke apparatuur vergen doet. Dit verklaart waarschijnlijk de vrij grote verspreiding van deze techniek, die de neiging om meer en meer systematisch worden gebruikt om RNA productie en afbraak in gisten en hogere eukaryoten te verkennen.

RNA kan worden aangeduid in levende cellen met behulp van andere nucleoside analogen, namelijk 5-bromouridine (BrU)31,32 of 5-ethynyluridine (EU)33,34. Het isolement van BrU pulse-geëtiketteerden RNA is afhankelijk van anti-BrdU antilichaam zuivering die verschillende efficiëntie tussen experimenten kan hebben. EU-geëtiketteerden RNA kan covalent zijn geconjugeerd met biotine Klik chemie leidt tot een onherroepbaar vervoeging in tegenstelling tot thiol wijziging, die kan worden teruggedraaid met reductoren gebruiken. BrU en labelen van de EU hebben in zoogdiercellen is gebruikt om te bepalen van genoom-brede RNA verval tarieven31,32 , of om te beoordelen van de ontluikende RNA-synthese-34,35. Echter, BrU of EU labeling is niet beschreven in S. cerevisiae. Inderdaad, opname van nucleoside-analogen vereist de expressie van nucleoside vervoerder en, zo deze methoden lijken minder flexibel in de ontluikende gist dan labelen met 4tU.

De duur van het labelen van de 4tU kan worden aangepast en varieert naargelang de vraag. Bij de beoordeling van mRNA-synthese in S. cerevisiae, een korte labeling puls van 6 min zorgt ervoor dat worden de nieuwe getranscribeerde mRNA niveaus minimaal beïnvloed door aantasting van het RNA. Gezien het feit dat de vertragingstijd voordat de gewijzigde nucleotide kan worden opgenomen in de ontluikende RNA minder dan 1 min is, garandeert deze 6-min labeling duur dat een redelijke hoeveelheid nieuwe kunstmatige RNA kan worden gezuiverd. Dergelijke protocol, zoals gedefinieerd door Miller et al. 11, is gebruikt in verschillende S. cerevisiae mutanten te onthullen van de mondiale veranderingen in mRNA-synthese en RNA verval9,10,22,26,27, 36. een langer labeling duur (3 h) werd gebruikt in een metabole pulse-achtervolging labelen met 4tU om te bepalen van verval tarieven van alle mRNAs in S. cerevisiae12. Ten slotte, uiterst korte (vanaf 1,5 min) 4tU labeling is gebruikt om RNA verwerking kinetiek in ontluikende en kernsplijting gist13,25,37onderzoeken.

Deze methode heeft echter enkele beperkingen, zoals het relatief lage rendement van gelabelde RNA hersteld aan het einde van het hele protocol. Hoewel in gist, er geen beperking in de grondstof is, en dit een probleem zijn kan bij het analyseren van metazoan cellen, specifiek als dit protocol wordt gebruikt in vivo. Een van de beperkende maatregelen van het protocol is de biotinylation van de gelabelde RNA-poule, waarvan efficiëntie is verre van compleet en was naar schatting één op de drie 4sU residuen in gelabelde RNA5wijzigen. Onlangs bleek dat het gebruik van methanethiosulfonate (MTS)-biotine, in plaats van biotine-HPDP, verhoogt het rendement van herstelde RNA38. Volgens niet-gepubliceerde resultaten van deze onderzoeksgroep en resultaten van Rutkowski en Dölken is MTS-Biotine echter niet volledig thiol-specifieke, wat leidt tot zuivering van labelloze RNA, die met name problematisch wanneer lage bedragen van gelabelde RNA is zijn gezuiverde39. Een andere beperking van de metabole labelen met behulp van 4tU/4sU is de inherente snelheid bij welke RNA polymerase kieuwopeningenvorm. De gemiddelde snelheid van RNA polymerase II werd geschat op ongeveer 3,5 kb/min40,41,42. Vandaar, in een 6 min etikettering, de polymerase zal de capaciteit hebben om te transcriberen 15 – 20 kb. Dus, in een experiment met een korte puls-labelen met 4tU/4sU, alleen de 3' einde deel van nieuw getranscribeerde RNA wordt aangeduid, terwijl de 5' einde regio's reeds bestaande vóór de toevoeging van 4tU/4sU werden. Dus, de zuivering van gelabelde RNAs verrijkt ook reeds bestaande 5' einden van afschriften, met name voor lange afschriften zoals in zoogdiercellen. Om te overwinnen dit vooroordeel, in een geraffineerde protocol genaamd TT-seq, is met het ultrasoonapparaat voorafgaand aan de zuivering van nieuw samengestelde soorten43de uitgepakte label RNA gefragmenteerd.

Over het geheel genomen is 4tU-seq een uitstekende manier om transcriptionele adreswijziging in een bepaalde context. Niettemin, en terwijl het protocol vrij eenvoudig is, het bestaat uit meerdere verschillende stappen, wordt uiteindelijk vrij uitgebreid. Eerst en vooral, aangezien dit protocol RNA van start verwerkt tot finish, is het verplicht dat alle voorschriften, vereist voor een schoon en vrij van aantasting van het monster wordt voldaan. Vandaar, alle gebruikte reagentia moeten worden RNase-vrij, en alle materialen moeten worden gewijd aan het manipuleren van RNA, zuivering welbeschouwd grondig en regelmatig met RNase decontaminatie oplossing. Ten tweede, terwijl Biotine reactie zeer specifiek is, de overdaad aan biotine-HPDP die niet reageerde moet worden verwijderd uit het monster (om te voorkomen de verzadiging van de streptavidine parels met biotine die niet covalent aan RNA, bijvoorbeeld gebonden is). Derde, zoals beschreven in het protocol, het gebruik van de aangegeven daar beklede magnetische kralen wordt sterk aanbevolen, aangezien de diverse onderzoeksgroepen we hebben gesproken hebben al aangegeven dat deze parels geleid tot lagere achtergrondniveaus. Vierde, passende kwaliteit en experimentele besturingselementen moeten worden gebruikt. Omvatten monsters afgeleid uit cellen die niet werden blootgesteld aan 4tU/4sU. Deze monsters zullen van grote waarde voor adres achtergrondniveaus en om te zorgen dat tijdens het experiment, een besmetting met niet-geëtiketteerden RNA doet zich niet voor. Ook een uitstekend alternatief om te testen of het monster wordt verrijkt voor nieuw samengestelde RNA is voor het uitvoeren van een RT-qPCR gebruikend inleidingen tegen een intro-bevattende gen. De inleidingen moet een aanvulling vormen op het einde 3' en 5' einde van twee opeenvolgende exon en intron, of vice versa. Ten slotte, voorafgaand aan de sequencing van microarray kruising, valideren de monsters door RT-qPCR. Hiervoor moeten verschillende genen met verschillende niveaus van expressie en verordening worden geselecteerd en geanalyseerd. Optimaal, moet dit worden uitgevoerd voor de twee verschillende breuken van RNA (steady-state en nieuw samengestelde RNA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Laszlo Tora voor zijn steun en V. Fisher, K. Schumacher en F. El Saafin voor hun discussies. T.B. werd gesteund door een Marie Curie-ITN fellowship (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) en de Fondation ARC. Dit werk werd gesteund door fondsen van het Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Deze studie werd ook ondersteund door ANR-10-LABX-0030-INRT, een Franse staat Fonds beheerd door de Agence Nationale de la Recherche onder het frame programma Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

Tags

Gedrag kwestie 140 S. cerevisiae RNA transcriptie nieuw gesynthetiseerd RNA 4-thiouracil RNA polymerase II SAGA complex
<em>Saccharomyces cerevisiae</em> Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baptista, T., Devys, D.… More

Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter