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Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57982
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

Summary

El protocolo aquí descrito se basa en la cuantificación del genoma de mRNA recién sintetizada purificada de células de levadura con 4-tiouracilo. Este método permite para medir la síntesis de mRNA desacoplado del decaimiento del mRNA y por lo tanto, proporciona una medida exacta de la transcripción del RNA polimerasa II.

Abstract

Globales defectos en la transcripción del RNA polimerasa II podrían dominados por transcriptómicos estudios análisis de RNA de estado estacionario. De hecho, la disminución global en la síntesis de ARNm ha demostrado ser compensado por una disminución simultánea en la degradación del mRNA para restaurar los niveles de estado estacionario normales. Por lo tanto, la cuantificación del genoma de la síntesis de mRNA, independientemente del decaimiento del mRNA, es el mejor reflejo directo de la actividad transcripcional de RNA polimerasa II. Aquí, discutimos un método usando el etiquetado metabólico no perturbar de ARN naciente en Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). En concreto, las células se cultivan para el minuto 6 con un uracilo analógico, 4-tiouracilo y el etiquetado ARN recién transcrito es purificado y cuantificado para determinar las tasas de síntesis de los ARNm individuales. Por otra parte, utilizando etiquetado Schizosaccharomyces pombe células como estándar interno permite comparar la síntesis de mRNA en S. cerevisiae de diferentes cepas. Usando este protocolo y montaje de los datos con un modelo cinético dinámico, se pueden determinar las tasas de decaimiento de ARNm correspondiente.

Introduction

Las células responden a estímulos endógenos y exógenos, a través de la alteración de la dinámica de su programa de expresión génica. En los últimos años un enorme desarrollo de metodologías de genoma permite la descripción precisa y completa de transcriptoma cambios en diferentes condiciones. En la mayoría de los estudios de transcriptómicos, microarray hibridación o alto rendimiento de secuenciación se utilizan para cuantificar niveles de ARN de una fracción de RNA total de estado estacionario. Cambios transcripcionales bajo una perturbación específica pueden mostrar una amplia gama de resultados posibles, con un amplio espectro de genes ser para arriba - u o o cambios de expresión del gen específico. Expresión génica es el resultado de un equilibrio optimizado, o estado estacionario, entre la síntesis de RNA por polimerasas del RNA y otros procesos que afectan a niveles de ARN. Transcripción de ARN polimerasa II, incluyendo sus tres fases (iniciación, elongación y terminación), es altamente y estrechamente asociado con procesamiento de mRNA, exportación citoplasmática, traducción y degradación.

Varios estudios recientes demostraron que descomposición y síntesis de mRNAs son mecanismos acoplados y demostraron que efectos transcripcionales a mutación o bajo estímulos pueden ser pasado por alto cuando la cuantificación de ARN total de estado estacionario. En primer lugar, la detección de cambios transcripcionales a través de los análisis de los niveles de estado estacionario de mRNA siempre depende de mRNAs Half-Life. Una vez que la perturbación se introduce, los niveles de estado estacionario de mRNAs con vida media larga se verá afectados mucho menos que los mRNAs con una vida media corta. Por lo tanto, la detección de los cambios en la síntesis de ARN es sesgada fuertemente a favor de las transcripciones de breve duración, mientras que el análisis de especies de mRNA perdurable puede no revelar cambios dinámicos en la tasa de transcripción. En segundo lugar, varios informes han demostrado que, tanto en levaduras y mamíferos, cambios globales en la transcripción pueden ser pasado por alto al analizar los niveles de estado estacionario de mRNA. Esto es probablemente debido a los mecanismos que vinculan la síntesis de mRNA y degradación resultante en mRNA buffering. Esto incitó el desarrollo de nuevos protocolos para cuantificar la síntesis de mRNA desacoplado de la degradación, a través del análisis del ARNm recién transcrita. En los últimos años, se presentan varias alternativas, incluyendo la secuencia funcionamiento global (GRO-seq)1y transcripción elongación nativo secuenciación (NET-seq)2,3. Aquí, presentamos un protocolo, desarrollado inicialmente en células de mamíferos4,5,6 y luego adaptado a levadura7,8,9,10, 11, que se basa en RNA etiquetado con un nucleósido thiolated o base analógica, 4-thiouridine (4sU) o 4-tiouracilo (4tU), respectivamente.

Este método específicamente purifica ARN recién transcrito de las células en el que ARN son pulso marcado con 4sU prácticamente sin interferencia en la homeostasis celular. Por lo tanto, una vez que las células se exponen a 4sU, la molécula es rápidamente captados, fosforila a 4sU-trifosfato e incorporada en el ARN se transcribe. Una vez que pulso marcado, es posible extraer ARN celular total (correspondientes a niveles de estado estacionario del ARN) y, posteriormente, la fracción de RNA marcado con 4sU es tiol-específicamente modificado, dando lugar a la formación de un enlace disulfuro entre biotina y recién transcrito RNA4,5. Sin embargo, 4sU sólo pueden ser captados por las células expresando un transportador de nucleósidos, como el transportador de nucleósidos equilibrative humano (hENT1), impidiendo su uso inmediato en la levadura de gemación o fisión. Mientras que uno podría expresar hENT1 en S. pombe o en S. cerevisiae, se logra un acercamiento más fácil utilizando el 4tU base modificado, puesto que las células de levadura pueden tomar 4tU, sin la necesidad de expresión de un transportador de nucleósidos10, 11 , 12 , 13. de hecho, el metabolismo de 4tU requiere la actividad de la enzima uracilo fosforribosiltransferasa (UPRT). En varios organismos, incluyendo la levadura pero no mamíferos, UPRT es esencial para una vía de salvamento de pirimidina, reciclaje uracilo a monofosfato de uridina.

Un importante sesgo en estudios transcriptómicos puede ser introducido por la normalización entre diferentes muestras analizadas en paralelo. De hecho, muchos factores de la desviación pueden afectar el análisis comparativo del transcriptoma de cepas de tipo salvaje y mutante: la eficiencia de la lisis celular, las diferencias en la extracción y recuperación del RNA y las variaciones en la calibración del escáner para análisis de microarray , entre otros. Como hemos comentado anteriormente, estas variaciones pueden ser particularmente engañosas cuando se espera que los efectos globales en la transcripción del RNA polimerasa II. Un medio elegante para comparar con precisión las tasas de síntesis de mRNA entre diferentes muestras fue diseñado mediante el uso de la levadura del distante relacionado fisión Schizosaccharomyces pombe como estándar interno. Para ello, un número fijo de etiquetado S. pombe células se añade a las muestras de S. cerevisiae , células de tipo salvaje o mutantes, antes de la lisis celular y extracción de RNA10. Posteriormente, estado estacionario y recién sintetizados RNAs de S. pombe y S. cerevisiae se cuantifican por RT-qPCR o mediante el uso de chips de microarray o secuenciación de alto rendimiento10. Combinando estos datos con el modelado cinético, se pueden medir tasas absolutas de la síntesis de mRNA y decaimiento en levadura de florecimiento.

En el marco de este manuscrito, nos mostrará cómo el análisis del ARN recién transcrito permitió revelar un papel global para los complejos del coactivator SAGA y TFIID transcripción del RNA polimerasa II en florecimiento levadura14,15, 16. Lo importante, últimos estudios cuantificaron niveles de mRNA de estado estacionario en S. cerevisiae y sugirieron que SAGA desempeña una función predominante en un conjunto limitado de genes de levadura que son fuertemente afectadas por mutaciones en SAGA pero relativamente resistente a TFIID las mutaciones17,18,19. Sorprendentemente, las actividades enzimáticas de la SAGA fueron demostradas para actuar sobre el genoma transcrito entero, sugiriendo un papel más amplio para este coactivador en la transcripción del RNA polimerasa II. Se observó menor reclutamiento de RNA polimerasa II en genes más expresados sobre la inactivación de la SAGA o TFIID, sugiriendo que estos activación trabaja juntos en la mayoría de los genes. Por lo tanto, la cuantificación de ARNm recién transcrita reveló que SAGA y TFIID son necesarios para la transcripción de casi todos los genes de la RNA polimerasa II14,15,16. La implementación de mecanismos de compensación surge como una forma de las células hacer frente a una disminución global en la síntesis de mRNA que es protegida por una simultánea disminución global en la degradación del mRNA. SAGA suma a la lista de factores con un efecto global en la transcripción del RNA polimerasa II, como subunidades de ARN Pol II10, el mediador del coactivator complejo20, el general transcripción factor TFIIH21,22 e indirectamente, elementos de mRNA degradación maquinaria9,10,23. Tales eventos compensatorios universalmente fueron observadas en mutantes de la SAGA, son responsables de los cambios en los niveles de mRNA de estado estable a pesar de una disminución global y severo de la síntesis de mRNA14modestos y limitados. Análisis similares se realizaron en una cepa de eliminación BRE1 , resultando en una pérdida completa de ubiquitinación de histona H2B. Curiosamente, un mucho más suave pero consistente efecto global en la transcripción del RNA polimerasa II se podría detectar en ausencia de Bre1, indicando que el etiquetado metabólico del ARN recién transcrito en la levadura puede detectar y cuantificar una gran variedad de cambios en el ARNm tasas de síntesis.

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Protocol

1. célula de cultivo y el agotamiento de la rapamicina de una subunidad de la SAGA

  1. Para cada cepa de S. cerevisiae y repetición, incluyendo tipo o cepas de control, inocular una colonia solo de un plato fresco en 5 mL de medio YPD (2% peptona, extracto de levadura 1% y 2% de glucosa).
  2. Cultivar células de S. cerevisiae durante la noche a 30 ° C con agitación constante (150 rpm).
  3. Medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) y diluir la cultura a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 100 mL de medio YPD y dejarla crecer hasta que el OD600 es alrededor de 0,8.
  4. En paralelo, inocular una sola Colonia de S. pombe células de una nueva placa en 50 mL de medio de sí (0,5% extracto de levadura, 250 mg/L adenina, histidina, uracil, leucina y lisina; 3% de glucosa) y crecen las células durante la noche en 32 ° C con agitación constante (150 rpm).
  5. Medir OD600 de la cultura durante la noche de S. pombe y diluir la cultura a un OD600 de aproximadamente 0.1 en 500 mL de medio de sí y dejarla crecer hasta que el OD600 es aproximadamente 0.8.
  6. Para cada cepa ancla lejos de S. cerevisiae y repetición, incluyendo tipo o cepas de control, inocular una colonia solo de un plato fresco en 5 mL de medio YPD (2% peptona, extracto de levadura 1% y 2% de glucosa).
  7. Crecen las células durante la noche a 30 ° C con agitación constante (150 rpm).
  8. A la mañana siguiente, medir el OD600, diluir la cultura a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 100 mL de medio YPD y dejarla crecer hasta el OD600≈ 0.8.
  9. Añada 100 μl de rapamicina a la cultura de una solución stock de 1 mg/mL (concentración final rapamicina de 1 μg/mL) y dejar las células incubar a 30 ° C con agitación constante durante el tiempo necesario para la proteína de interés a ser condicional agotado desde el núcleo ( generalmente, 30 minutos es suficiente). Para el control, utilizar un cultivo de levadura similar, pero en lugar de agregar rapamicina, añadir el volumen equivalente de dimetilsulfóxido (DMSO).

2. 4tU etiquetado con S. pombe como una espiga (cuenta)

  1. Preparar una solución fresca de 4 M 2-tiouracilo. Una vez preparado, mantener a temperatura ambiente y lejos de la luz.
    1. Exactamente pesa 64,1 mg de tiouracilo de 4 para cada cultivo de S. cerevisiae y disolver en 250 μl de dimetilformamida (DMF) o en 250 μl de DMSO.
    2. Para el cultivo de S. pombe ser utilizado como punto de pesa de 320,5 mg de 4-tiouracilo y disolverlo en 1.250 μl de DMSO.
  2. Añadir la solución 4-tiouracilo a cultivos de S. cerevisiae y S. pombe para una concentración final de 5 mM e incúbelos durante 6 min con agitación constante a 30 ° C y 32 ° C, respectivamente.
  3. Después de 6 minutos, retirar una pequeña alícuota de cada cultivo para el recuento celular. Contar las células usando un contador celular automático o una cámara de Neubauer.
  4. Recoger las células por centrifugación (2.500 x g) durante 5 min a 4 ° C.
  5. Eliminar el sobrenadante, lavar las células y helada 1 x PBS, centrifugar nuevamente (2.500 x g, 4 ° C, 5 min).
  6. Calcular el número total de células en cada una de las muestras de S. cerevisiae y S. pombe .
  7. Resuspender las células en 5 mL de PBS 1 x helada y S. cerevisiae se mezclan con las células de S. pombe con una proporción 3:1.
  8. Centrifugar las células (2.500 x g, 4 ° C, 5 minutos), retirar el PBS, flash-congela las células en el líquido de N2y almacenar la muestra a-80 ° C hasta su uso posterior.

3. ARN extracción y tratamiento de DNasa

  1. Descongelar las células en hielo por aproximadamente 20-30 min.
  2. Proceder a la extracción de RNA utilizando un kit de extracción de ARN de la levadura (Tabla de materiales) con algunas adaptaciones.
  3. Por cada muestra, vierta 750 μl de helada granos de zirconio en un tubo de 1,5 mL tapón provisto en el equipo. Tenga en cuenta que por cada tubo, ARN de hasta 109 células puede ser eficientemente extraída. Por lo tanto, prepare el número de tubos necesarios para cada muestra. Por ejemplo, un cultivo de S. cerevisiae de 100 mL (OD600≈ 0.8) puede hacer alrededor de 2 x 109 a 3 x 109 células, a un total de 2.7 x 109 4 x 109 células en total (después de la espiga con un tercio de la de S. pombe células). En este caso, se requiere hasta 3-4 tubos de reacción por cada muestra/condiciones/mutantes/repetición.
  4. Por cada 1 x 109 células, añadir 480 μl del tampón de lisis suministrado con el kit de 48 μl de SDS 10% y 480 μl de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol (25:24:1, v/v/v).
  5. Mezclar las células usando un mezclador de tipo vórtex y transferir a tubos que contienen los granos de zirconio helados.
  6. Acomodar los tubos en un adaptador de mezclador de vórtice, gire el vortex a máxima velocidad y batir por 10 min a lyse las células de levadura (en una habitación a 4 º C). Alternativamente, realizar la lisis de las células en un batidor automático de grano.
  7. Centrifugar los tubos a 16.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente y recoger cuidadosamente la fase superior (fase que contiene RNA) a un nuevo tubo falcon 15 mL. Por lo general, el volumen recuperado por cada tubo es alrededor de 500 – 600 μl.
  8. A los tubos de 15 mL que contiene el RNA parcialmente purificado, añadir el tampón de Unión suministrado con el kit y mezcla bien. Por cada 100 μl de solución de RNA, añadir 350 μl de tampón de unión (es decir, cuando el volumen de fase acuosa solución es 600 μl, 2,1 mL de la solución de enlace debe añadirse).
  9. A la mezcla anterior, añadir el etanol 100% y mezclar bien. Por cada 100 μl de solución de RNA, añadir 235 μl de etanol al 100% (es decir, cuando el volumen de fase acuosa solución es 600 μl, añadir 1,41 mL de etanol).
  10. Aplicar hasta 700 μl de la mezcla del paso 3.9 a un cartucho de filtro montado en un tubo de colección, tanto incluidas en el kit.
  11. Centrifugar por 1 min a 16.000 x g. Si la duración de la centrifugación no fue suficiente para el volumen total pasar a través del filtro, repetir la centrifugación durante 30 s.
  12. Deseche el flujo a través y reutilizar el mismo tubo de la colección. Añadir otro 700 μl de solución tampón etanol de unión de ARN al filtro y centrifugar a 16.000 x g durante 1 minuto.
  13. Deseche el flujo a través y repita los pasos 3.11 y 3.12 hasta que termine la solución de RNA.
  14. Lave el filtro 2 x con 700 μl de solución 1 de lavado. Recoger el lavado solución mediante centrifugación a 16.000 x g durante 1 min y mantenga siempre el tubo de la colección.
  15. Lave el filtro 2 x con 500 μl de solución 2 de lavado. Recoger el lavado solución mediante centrifugación a 16.000 x g durante 1 min y mantenga siempre el tubo de la colección.
  16. Centrifugar los tubos una vez más a 16.000 x g durante 1 min secar completamente el filtro.
  17. Transferir el cartucho del filtro al colección final (un tubo apropiado de RNA) y eluir el RNA con 50 μl de tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O (precalentado a 100 ° C).
  18. Centrifugar por 1 min a 16.000 x g.
  19. Eluir el RNA otra vez (en el mismo tubo) con 50 μl de precalentado tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O. Asegúrese de que el volumen ha pasado por el filtro; en caso contrario, centrifugar durante períodos más largos.
  20. Si se utilizan tubos múltiples para una sola muestra, les piscina todo en un tubo.
  21. Cuantificar y comprobar la pureza de la muestra utilizando el equipo adecuado.
    Nota: Mientras 4tU sólo se incorpora dentro de RNA recién sintetizada, hay una probabilidad de menor contaminación con ADN. Por ello, siempre es recomendable para tratar las muestras con DNasa I. Para ello, utilice los reactivos proporcionados con el kit de extracción de RNA (Tabla de materiales) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

4. específico de tiol Biotinilación de ARN recién sintetizado

  1. Ajustar la concentración del RNA con el artículo 3 del Protocolo a 2 mg/mL. Alícuota de 200 μg de ARN total, calentar durante 10 minutos a 60 ° C y enfriarlas inmediatamente en hielo durante 2 minutos.
  2. A la alícuota del RNA, añadir los reactivos que se mencionan a continuación en el siguiente orden: 600 μl de tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O, 100 μl de tampón de Biotinilación (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] y 10 mM EDTA, tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O) y 200 μL de biotina-HPDP de un stock de 1 mg/mL biotina-HPDP en DMSO o DMF.
    1. En algunas situaciones, la solución de biotina HPDP tiende a precipitar, es probable que debido a su baja solubilidad en agua. En esta situación, aumentar el volumen de DMSO/DMF hasta un 40% del volumen de la reacción (a la muestra de RNA, añadir 400 μL de tratada con DEPC H2O, 100 μl de buffer de Biotinilación y 400 μL de biotina HPDP de un stock de 0, 5 mg/mL).
  3. Incubar la muestra a temperatura ambiente y protegido de la luz por 3 horas, con agitación suave.
  4. Después de la incubación, añadir un volumen aproximadamente igual de cloroformo en los tubos y mezclar vigorosamente.
  5. Girar la muestra a 13.000 x g durante 5 minutos, a 4 ° C. Este paso permite la eliminación de exceso biotina que no biotinylate el ARN. Por otra parte, realizar este paso mediante tubos de fase de bloqueo (pesados). Para ello, girar por los tubos de la fase de bloqueo durante 1 min a 13.000 x g, añadir la mezcla de RNA y una cantidad igual de cloroformo, Mezclar vigorosamente y centrifugar a 13.000 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.
  6. Cuidadosamente transferir la fase superior a nuevos tubos de 2 mL.
  7. Añadir una décima parte del volumen de 5 M NaCl y mezclar la muestra.
  8. Añadir un volumen igual de isopropanol, mezclar bien la muestra y exprimir a 13.000 x g durante al menos 30 minutos, a 4 ° C.
  9. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y agregar 1 mL de etanol 75% helada.
  10. Vuelta a 13.000 x g durante 10 min, 4 ° c.
  11. Cuidadosamente Quite el sobrenadante, rápido-hacer girar el tubo y la solución restante de etanol. Asegúrese de que no secar el pellet de RNA.
  12. Suspender el ARN en 100 μl de tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O.

5. purificación de la fracción recién sintetizado del ARN Total y sin etiqueta con bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina

  1. Calor biotinilado RNA durante 10 min a 65 ° C y luego enfriar las muestras en hielo durante 5 minutos.
  2. Añadir 100 μl de bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina a biotinilado RNA (en un volumen final de 200 μL). Específicamente, se recomienda utilizar las cuentas indicadas en la Tabla de materiales, ya que, después de conversaciones con otros laboratorios, estos parecían ser más consistente y confiable.
  3. Incubar la muestra con agitación leve durante 90 minutos, a temperatura ambiente.
  4. Colocar las columnas con el kit (Tabla de materiales) en el soporte magnético.
  5. Agregar 900 μl de tampón de lavado temperatura (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], EDTA 10 mM, 1 M NaCl y 0,1% Tween 20, tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O) a las columnas (de funcionamiento previo y equilibrar).
  6. Aplique la mezcla de granos ARN (200 μL) a las columnas.
  7. Recoge el flujo a través de tubos de 1,5 mL y aplicarlo de nuevo a la misma columna magnética. Si es necesario, mantenga este paso que representa la fracción de RNA sin etiqueta.
  8. Lavar las columnas 5 x con el aumento de volúmenes de tampón de lavado (600, 700, 800, 900 y 1000 μL).
  9. Eluir el RNA recién sintetizado con 200 μL de 0,1 M TDT.
  10. Realizar una segunda elución, 3 minutos más tarde, con un volumen igual de 0,1 M TDT.
  11. Después de liberador del RNA, Añadir 0,1 volúmenes de 3 M NaOAc (pH 5,2), 2 μl de glucógeno 20 mg/mL (RNA-grado) y 3 volúmenes de helados 100% de etanol y dejar el RNA precipitado durante la noche, a-20 ° C.
  12. El ARN se recuperan por centrifugación (13.000 x g durante 10 minutos, a 4 ° C) y resuspender en 15 μl de tratada con DEPC, libre de ARNasa H20. La proporción de ARN marcado en total se espera que alrededor 2% - 4% (generalmente más hacia el extremo inferior), haciendo aproximadamente 2.0 μg de RNA recién sintetizada. Esta cantidad es suficiente para hacer varios experimentos de qPCR, así como para análisis de microarray de la secuencia.

6. RT-qPCR validación de las diferentes fracciones

  1. Sintetizar el cDNA de 2 μg de ARN total o 10 μl de ARN marcados con random hexamers y la transcriptasa reversa de la opción, según las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).
  2. Amplifican el cDNA por qPCR en tiempo real usando un protocolo estándar (Tabla de materiales).
    Nota: Todas las muestras se llevará por triplicado de un mínimo de dos réplicas biológicas. Corregir todos los valores de materia prima para la expresión de S. pombe tubulina.

7. microarrays de hibridación

  1. Hibridar las muestras de RNA en chips de microarray recomendado: según las instrucciones del fabricante (para este protocolo específico, consulte la Tabla de materiales). Brevemente, preparar biotinilado cRNA objetivos de 150 ng de ARN usando el Premier Kit de amplificación de ARN (Tabla de materiales), según las instrucciones del fabricante. Hibridar 4 mg de anestesistas fragmentada de 16 h a 45 ° C y 60 rpm en los chips de microarray.
  2. Lavar, mancha y analizar las fichas con la estación indicada y escáner (Tabla de materiales). Extraer los datos raws (archivos de CEL intensidad) de las imágenes escaneadas utilizando la consola de comandos (AGCC, versión 4.1.2).
  3. Otro proceso de los archivos del CEL con versión de software de expresión consola 1.4.1 para calcular la sonda establece intensidades de la señal, usando los algoritmos basados en estadísticas MAS 5.0 con ajustes predeterminados y de escala global como método de normalización.
    Nota: La intensidad de blanco medio ajustado de cada chip se estableció arbitrariamente en 100. Realizar todos los experimentos usando al menos dos réplicas biológicas independientes. Normalizar datos en bruto a la señal de S. pombe y calcular veces cambios en los niveles de RNA total y recién sintetizados.

8. los datos el análisis usando una tubería existente de R

  1. Calcular síntesis y decaimiento de las tasas mediante un oleoducto y un paquete de R/Bioconductor públicamente disponible, como se describió anteriormente8,10.

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Representative Results

Cuando se realiza el etiquetado metabólico del ARN recién transcrito, varios aspectos que controlar: el tiempo y la eficiencia de la rotulación, la proporción de espiga en, el protocolo de extracción y la eficacia de Biotinilación (incluyendo signal to noise ratio), entre otros. Estas condiciones han sido extensivamente y metódicamente demostradas por otros7,10,11. Aquí nos centramos principalmente en la interpretación y análisis inmediatos que se pueden realizar una vez que han sido procesadas las muestras, ya sea por RT-qPCR, microarray y secuenciación. El análisis de diferentes cepas mutantes de demuestran el poder del método para detectar no sólo una disminución en la síntesis de mRNA, global dramática como en el caso de la mutante de la SAGA S. cerevisiae cepas, sino también una disminución muy leve de actividad de RNA polimerasa II a supresión de histona H2B monoubiquitination.

Nuestros análisis de actividades enzimáticas SAGA sugieren un amplio reclutamiento a cromatina15, que no fue revelado por el análisis de los niveles de mRNA de estado estacionario en cepas mutantes de la SAGA. Como contratación de RNA polimerasa II fue deteriorada sobre la inactivación de la SAGA, hemos decidido analizar si las tasas de síntesis de ARNm se vería afectadas a nivel mundial. Por lo tanto, tipo salvaje o mutantes cepas de S. cerevisiae fueron expuestas a 4tU durante 6 min para etiquetar el ARN recién transcrito. Después de mezclar con las espiga en etiquetado células (S. pombe) en una proporción de 3:1, ARN total fue extraído, y ARN recién sintetizado fue biotinilado y purificada según el protocolo presentado aquí, como en el cronograma que se muestra en la figura 1. Etiquetado RNAs fueron purificados de un total de 200 μg de RNA, asegurando que la cantidad de producto purificado sería suficiente para cualquier aplicación posterior. Como un paso inicial y sistemático antes de cualquier análisis de genoma, purificación de RNA recién sintetizado se validó por RT-qPCR. Genes fueron seleccionados según diferentes parámetros, incluyendo un nivel de expresión, vías de reglamentación y una dependencia de diferentes Polimerasas del RNA.

Para confirmar que este protocolo específicamente purifica ARN marcados, cuantificamos los niveles de transcritos en fracciones purificadas de células de tipo salvaje que fueron cultivadas con o sin 4tU. Niveles insignificantes de los RNAs analizados fueron detectados de las células que no fueron expuestas a 4tU (figura 2A). Purificación del ARN recién transcrito además fue validado por el enriquecimiento observado del intrón contiene ACT1 pre-mRNA (datos no mostrados). Después de la validación de la calidad de las muestras, probamos si la síntesis de mRNA se verían afectados con supresión de SPT20, que es conocido por interrumpir la Asamblea compleja SAGA. Según otros, cuantificación del mRNA en ARN (estado estacionario) de la cepa Δ de spt20reveló niveles sobre todo sin cambios o ligeramente reducidos para los genes muestreados (figura 2B). Resultados similares se obtuvieron cepas eliminado para BRE1 (figura 2B). En contraste, el análisis del ARN recién transcrito de la cepa Δ de spt20reveló una dramática disminución en la síntesis de mRNA por tres-probaron hasta cinco veces para todos los genes (figura 2C). La pérdida de Bre1 condujo a una disminución más discreta pero todavía visible en los niveles de mRNA recién sintetizada de los genes estudiados (figura 2C). De acuerdo con un papel de SAGA y Bre1 en la transcripción del RNA polimerasa II, la pérdida de Spt20 o Bre1 no afectó la expresión de genes RDN25 o snR6 , transcrito por la ARN polimerasa I y la ARN polimerasa III, respectivamente ( Figura 2C).

Sin embargo, las cepas eliminadas para las subunidades estructurales de la SAGA compleja, como SPT7 o SPT20, Mostrar fenotipos severos de crecimiento lento que pueden explicar las alteraciones transcripcionales observadas. Para descartar efectos secundarios no deseados, que nos agota condicional Spt7 del núcleo, usando anclaje a S. cerevisiae cepas14,24. A 60min de tratamiento rapamicina, antes el pulso-etiquetado con 4tU (ver figura 1 para una representación esquemática), niveles de ARNm recién transcrita se redujeron a un grado similar que el observado en la cepa de eliminación (Figura 2D y 2E ). Este análisis, por lo tanto, confirma nuestros resultados anteriores y validar el protocolo para este sistema inducible por agotamiento. En un análisis del curso del tiempo, donde las células fueron expuestas a rapamicina para un tiempo que abarca de 0 a 240 min, expresión reducida fue evidente inmediatamente después de 15 min de exposición a la droga. Más interesante, niveles de mRNA de estado estacionario tendieron a disminuir inicialmente pero volvieron a niveles normales después de 60 min, una indicación que un mecanismo compensatorio ocurre mientras tanto (figura 2E).

En conjunto, el etiquetado y la cuantificación de RNA recién sintetizada permiten revelar nuevas funciones reguladoras para el complejo de la SAGA. El protocolo descrito también podría revelar efectos moderados sobre la actividad de RNA polimerasa II y fue aplicada con éxito a condicional agotamiento cepas de levadura.

Una de las aplicaciones aguas abajo para el purificado RNA recién sintetizado es una cuantificación del genoma de las transcripciones mediante microarray hibridación o secuenciación (4tU-seq). Mientras que la secuenciación de alto rendimiento es más cuantitativa, sensible e informativa, microarray hibridación puede ser muy útil para determinar si se alteran los niveles de mRNA global. En este contexto donde la normalización es fundamental, hemos añadido un punto en el organismo a la muestra que pretende analizar. Específicamente, mezclan células de S. cerevisiae a S. pombe células en una proporción de 3:1, ambos están expuestos previamente a 4tU. Cuando el ARN purificado, rotulado es objeto de secuenciación de alto rendimiento, puede utilizar cualquier protocolo de preparación de la biblioteca estándar, más a menudo después de agotamiento de ARN ribosómico. Normalización entre seq 4tU datos de diferentes muestras se ha realizado mediante la adición o etiquetados RNA de diferentes especies (es decir, mezcla S. cerevisiae y S. pombe células como arriba)22 o en vitro- transcrito, thiolated spike en RNA12,25,26,27. Chips de microarray comercialmente disponibles contienen sondas para el transcriptoma entero de la levadura de gemación y fisión, lo que permite la cuantificación de ARNm de ambos organismos en un solo experimento. Hibridaciones de microarray se realizaron con el ARN recién sintetizado y total validado por RT-qPCR, como se indicó anteriormente (tipo salvaje, spt20Δ y Δ bre1). Además, se incluyeron una cepa que no es compatible con monoubiquitination de la histona H2B, a través de la mutación de punto del residuo ubiquitinable (K123R). Porque la misma exacta proporción de S. pombe células fueron utilizados en las diferentes muestras y las repeticiones, es posible reescalar linealmente las matrices intensidades para que el total y etiquetada S. pombe sondas tienen la misma intensidad mediana. Esta normalización o reescalado, se puede realizar un paquete de Bioconductor desarrollado por el laboratorio de Patrick Cramer y se utiliza en paralelo en las muestras analizadas, total y etiquetado fracciones y tipo salvaje y mutantes de cepas8. Brevemente, la entrada de este gasoducto es un archivo de Excel que contiene las sondas y su intensidad (MAS5 o RMA) para todas las muestras y fracciones. Después de excluir las sondas que están fuera del rango de detección, la intensidad de la señal es escalarlos disminuir, teniendo en cuenta los valores de intensidad de las sondas de S. pombe . Por último, puede asignar las sondas a la brotación y el genoma de la levadura de fisión, terminando con una matriz que contiene los valores de expresión normalizados para el punto. Estos valores pueden ser más procesados (ver siguiente sección) o como es. En el ejemplo siguiente, se determinó que cambia el doblez de cada transcripción entre el mutante y la cepa de tipo salvaje.

Los análisis fueron realizados para ambos estado estacionario o recién sintetizados los niveles de ARN y conspiraron contra su significación estadística (p-valor) (figura 3). De acuerdo con otros estudios, cuando se analizaron los niveles de RNA total, sólo unos cuantos genes tuvieron su expresión alterado, ya sea para arriba - u o (Figura 3A-3 C). Sin embargo, el análisis del ARN recién transcrito condujo a conclusiones muy diferentes. Los niveles de ARNm recién transcrita de más de 4.000 genes se redujeron significativamente por lo menos doble en la eliminación de SPT20, lo que sugiere un efecto positivo global de SAGA en la transcripción del RNA polimerasa II en levaduras de gemación (figura 3D ). Además, en la Δ bre1y mutantes K123R , los resultados fueron más discretos: mayoría de los genes parece tener su expresión reducida, pero el grado de regulación a la baja y el número de genes afectados significativamente (≈ 300-500) era de hecho más limitada (figura 3E y 3F).

Como previamente mencionados, estacionaria o total niveles de mRNA son dictados por el ajustado equilibrio entre la síntesis y descomposición (figura 4A). Cuando la transcripción del RNA polimerasa II es globalmente deteriorada, pueden ser en la foto dos escenarios: (i) cualquiera de los dos mRNA total niveles disminuyen a nivel mundial, como respuesta a la síntesis reducida pero constante deterioro o degradación del ARNm (ii) se reduce en la misma medida, resultante en sobre todo sin cambios de niveles de mRNA de estado estacionario. El segundo escenario se ha divulgado para varias condiciones, incluyendo en el contexto de la SAGA o TFIID interrupción9,10,14,16,22. Un procedimiento llamado análisis de transcriptoma dinámica comparativa (cDTA) basado en 4tU etiquetado y modelado cinético dinámico nos permite determinar la síntesis de mRNA y deducir las tasas de decaimiento para cada transcripción8,10. Una vez más, aprovechamos los datos recogidos para las cepas anteriormente mencionadas (tipo salvaje, spt20Δ, bre1Δ y K123R). Como era de esperar, con supresión de SPT20, observamos una disminución simultánea en mRNA tasas de síntesis y degradación en comparación con la cepa de tipo salvaje. En esta cepa mutante, la compensación era casi óptima, con un promedio disminución de la síntesis de 3.8-fold y un promedio disminución del decaimiento del 4.1-fold (figura 4B), corroborar por qué podrían ser sólo limitados cambios transcripcionales detectado en los niveles de mRNA total (figura 3A). En las dos otras estirpes mutantes (bre1Δ y K123R), también se observaron cambios concomitantes en la síntesis de mRNA y decaimiento, pero los cambios fueron en una escala mucho más pequeña y más dispersión (figura 4 y 4 D).

Figure 1
Figura 1 : Representación esquemática del etiquetado metabólico de ARN utilizando 4tU. 4tU recién preparado se añade al medio de cultivo y las células están etiquetadas para 6 minutos etiquetadas S. cerevisiae y S. pombe células se mezclan en una proporción de 3:1 y se extrajo ARN total. Después, ARN recién sintetizado es biotinilado y puede ser purificado mediante bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Por último, total RNA (estado estacionario) y etiquetada recién sintetizada RNA puede ser utilizado en una variedad de aplicaciones posteriores, incluyendo RT-qPCR y microarray hibridación o secuenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Análisis que representan cambios transcripcionales en tanto estado de equilibrio y recién transcripción RNA determinado por RT-qPCR. Se cuantificaron los niveles de (A) RNA de cinco genes diferentes de la fracción marcada de RNA purificada de células de tipo salvaje que tampoco fueron expuestas o no a 4tU. Los siguientes dos paneles muestran total (B) y (C) recién sintetizado cuantificación de RNA por RT-qPCR para wild-type (WT), spt20Δ y células de levadura bre1Δ. Spt7 cepas ancla lejos, sin tratamiento o tratados con rapamicina durante 60 min, fueron etiquetadas con 4tU y total (D) o (E) recién transcrito RNA se cuantificó por RT-qPCR. (F) este panel muestra que el curso del tiempo análisis de cambios en el estado de equilibrio y recién sintetizada ARNm sobre agotamiento nuclear Spt7. Para todas las muestras, los niveles de mRNA para cinco los genes de RNA polimerasa II se cuantificaron por RT-qPCR. ARN polimerasa I y genes de ARN polimerasa III (RDN25 y snR6, respectivamente) fueron utilizados como control. Valores de expresión (media ± SD de tres experimentos independientes) se normalizaron en el tacon en S. pombe la señal y el valor 1 en la muestra de control. Paneles D-F se han modificado de Baptista et al. 14. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Análisis de genoma de niveles del mRNA usando fracciones de RNA total o etiquetados. Estos paneles muestran volcán parcelas mostrando pliegue cambios en los niveles de mRNA de estado estacionario (A-C) o (D-F) recién sintetizados los niveles de mRNA en relación con su significado (p-valor). Los cambios de doblez (FC) se calcularon como el log2 de la relación entre el valor de la expresión de cada gen después de normalización a la señal de S. pombe en el Δ de spt20(A y D), Δ bre1(B y E) o () C y F) K123R tensión versus el valor de la expresión del mismo gen de tipo salvaje S. cerevisiae. Se analizaron un total de 5.385 genes y umbrales de doble cambian (punto azul: más que una doble disminución; amarillo puntos: más que un aumento doble) y 0.05 p-valores eran considerados. Paneles A y D han sido modificados de Baptista et al. 14. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Paralelo de cambios en la síntesis de mRNA y resultados del decaimiento del mRNA en mRNA buffering. (A) este panel muestra una representación esquemática de los resultados de la perturbación de síntesis de RNA en niveles de ARN de estado estacionario. (B-D) Estos paneles muestran el cálculo de la síntesis de mRNA y las tasas de decaimiento de los análisis de ARN total y recién sintetizado. Se determinaron las tasas de síntesis y descomposición de cada transcripción de S. cerevisiae en (B) spt20Δ, Δ de bre1(C) y (D) K123R. (Calculados como el log2 de la relación entre el mutante y el salvaje-tipo) de cambios en las tasas de síntesis se enfrenta a cambios en las tasas de decaimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Mientras todavía están mejorando herramientas de genoma para analizar cambios en la transcripción, el único análisis de transcriptoma a través de la cuantificación de los niveles de estado estacionario del ARN podría no reflejan cambios en la actividad de RNA polimerasa II. De hecho, niveles de ARNm están regulados no sólo por la síntesis de ARN, sino también por su maduración y degradación. Para medir la síntesis de mRNA desacoplado de la degradación del mRNA, distintos protocolos se han desarrollado en los últimos años para el análisis de la transcripción naciente en levaduras y mamíferos.

Uno de los protocolos más utilizados para la cuantificación de la transcripción naciente es GRO-seq1. Mientras que la ventaja principal de GRO-seq es su capacidad para develar la polimerasa transcripcionalmente activa y comprometida en alta resolución y bajo fondo, tiene dos puntos distintos que disminuyen su atractivo: (i) es técnicamente difícil y requiere la aislamiento de núcleos y, (ii) núcleos manipulaciones introducir algunas perturbaciones al sistema28. Otra alternativa es red-seq, que se basa en la secuenciación de los extremos 3' de las transcripciones obtenidas por inmunoprecipitación de la extremadamente estable complejo ternario entre la naciente RNA plantilla ADN y ARN polimerasa II. Este enfoque permite la caracterización de ARN naciente con una resolución de pares y puede explorar eventos de procesamiento de mRNA mediante inmunoprecipitación de la ARN polimerasa modificada II (fosforilación de la serina-5, por ejemplo)2,3 , 29. sin embargo, presenta algunos de los obstáculos, de los cuales destacamos tres. En primer lugar, mientras que los anticuerpos contra la polimerasa II del RNA generalmente son altamente específicos, depende de eficiencia de anticuerpo. En segundo lugar, RNA puede ser propenso a la degradación durante los períodos de incubación, lo que nos conduce hacia el punto anterior (menos eficientes anticuerpos podrían requerir incubación más veces, dejando más susceptible a la degradación del RNA)29. Tercero y sobre todo en mamíferos, la digestión de la MNase y la selección del tamaño podrían excluir secuencia única alineación29,30.

Aquí se presenta un protocolo detallado para el etiquetado metabólico del ARN recién sintetizado usando 4tU en S. cerevisiae que tiene diversas ventajas en comparación con otros métodos disponibles. Porque la transcripción es muy sensible a las perturbaciones, las células se deben mantener en las condiciones más fisiológicas. Por ejemplo, GRO-seq implica la detención de transcripcionalmente a ARN polimerasa II a través de la exposición de los núcleos de las células a sarkosyl. Sin embargo, sarkosyl tratamiento ha sido descrito como inhibitoria de varios procesos celulares11. En este caso, etiquetado metabólico con 4tU o 4sU concentración descrita es no perturbar y no visiblemente afecta la homeostasis de la célula, especialmente durante períodos cortos de exposición. En contraste con otros métodos mediante inhibición de la transcripción para medir la vida media de mRNA, cDTA o 4tU-seq y conexión con el modelado dinámico determina las tasas de degradación de cada mRNA solo en células imperturbable. Por lo tanto, un método único puede abordar simultáneamente la síntesis y las tasas de decaimiento del transcriptoma todo en un tipo de célula específica. Desde cDTA o 4tU seq toma ventaja de los métodos de normalización altamente confiable, es decir, a través del uso del punto, diferentes conjuntos de datos pueden analizar juntos y compararon directamente. Finalmente, el etiquetado metabólico y cuantificación de RNA recién sintetizada es una técnica que puede implementarse fácilmente en cualquier laboratorio de biología molecular, no requiere ningún equipamiento específico. Esto probablemente explica la gran difusión de esta técnica, que tiende a utilizarse cada vez más sistemáticamente para explorar la producción de RNA y la degradación en las levaduras, así como en eucariotas superiores.

RNA puede etiquetarse en las células vivas con otros análogos de nucleósidos, es decir, 5-bromouridine (BrU)31,32 o 5-ethynyluridine (UE)33,34. El aislamiento de BrU RNA marcado de pulso se basa en la purificación de anticuerpos anti-BrdU que tenga diferentes eficiencias entre experimentos. EU-etiquetados RNA puede ser covalentemente conjugado con biotina utilizando química click lleva a una conjugación de irreversible a diferencia de la modificación de tiol, que puede revertirse con agentes reductores. BrU y etiquetado EU han utilizado en células de mamífero para determinar el genoma RNA decay tarifas31,32 o evaluar naciente RNA síntesis34,35. Sin embargo, etiquetado BrU o UE no tiene descrito en S. cerevisiae. De hecho, la absorción de los análogos de nucleósidos de requiere la expresión del transportador de nucleósidos y, así, estos métodos aparecen menos flexibles en levadura de florecimiento que etiquetado con 4tU.

La duración de 4tU etiquetado puede ser adaptada y varía según la pregunta. Cuándo evaluar la síntesis de mRNA en S. cerevisiae, un pulso etiquetado corto de 6 minutos asegura que los niveles de ARNm recién transcrita son mínimamente afectados por degradación de RNA. Teniendo en cuenta que el tiempo de retraso antes de que el nucleótido modificado puede ser incorporado en el RNA naciente es de menos de 1 minuto, esta duración Etiquetadora de 6 min garantiza que una cantidad razonable de RNA recién sintetizada puede ser purificada. Dicho Protocolo, según lo definido por Miller et al. 11, se ha utilizado en diferentes S. cerevisiae mutantes para revelar cambios globales en la síntesis de mRNA y RNA decaen9,10,22,26,27, 36. una duración ya etiquetada (3 h) fue utilizada en un pulso-persiga metabólica etiquetado con 4tU para determinar las tasas de decaimiento de los mRNAs en S. cerevisiae12. Por último, extremadamente corto (de 1,5 min) 4tU etiquetado se ha utilizado para estudiar la cinética del proceso de RNA en gemación y fisión levaduras13,25,37.

Sin embargo, este método tiene algunas limitaciones, como el relativamente bajo rendimiento de ARN marcados se recuperó al final de todo protocolo. Mientras que en la levadura, no existe limitación en el material de partida, y esto puede ser un problema al analizar las células de metazoarios, especialmente si este protocolo es ser utilizados en vivo. Uno de los pasos limitantes del protocolo es Biotinilación de la piscina etiquetada de RNA, cuya eficiencia está lejos de ser completa y se estima que para modificar uno de cada tres residuos 4sU etiquetados RNA5. Recientemente demostró que el uso de methanethiosulfonate (MTS)-biotina, en lugar de biotina-HPDP, aumenta la producción de RNA recuperado38. Sin embargo, según resultados no publicados de este grupo de investigación y resultados de Rutkowski y Dölken, MTS-biotina no es completamente tiol específico, conduce a la purificación de RNA sin etiqueta, que es particularmente problemáticos cuando bajas cantidades de ARN marcados son purificada39. Otra limitación del etiquetado metabólico usando 4tU/4sU es la velocidad inherente en que RNA polimerasa se alarga. La velocidad media de la ARN polimerasa II era estimada para ser aproximadamente 3,5 kb/min40,41,42. Por lo tanto, en un etiquetado de 6 min, la polimerasa tendrá la capacidad de transcribir a 15-20 kb. Así, en un experimento con un pulso corto etiquetado con 4tU/4sU, sólo el 3' extremo parte del ARN recién transcrito es marcada, mientras que las regiones 5' extremo eran preexistentes antes de la adición de 4tU/4sU. Por lo tanto, la purificación de ARN marcado también enriquece preexistente 5' extremos de transcripciones, especialmente para largas transcripciones como en células de mamíferos. Para superar este sesgo, en un refinado protocolo llamado TT-seq, los etiquetados RNA extraído está fragmentado por sonicación antes de la purificación de especies recién sintetizada43.

En conjunto, 4tU seq es una manera excelente de cambios transcripcionales de dirección en un contexto determinado. Sin embargo, y aunque el protocolo es bastante simple, consta de varios pasos diferentes, siendo en última instancia relativamente extensa. Primero y principal, ya que este protocolo encarga de RNA de principio a fin, es obligatorio que se cumplan todos los requisitos necesarios para una muestra limpia y libre de degradación. Por lo tanto, todos los reactivos deben estar libre de Rnasa, y todos los materiales deben dedicarse a manipular el ARN, limpiar todo a fondo y regularmente con solución de descontaminación de Rnasa. En segundo lugar, mientras que la reacción biotina es altamente específica, debe eliminarse de la muestra (para evitar la saturación de los granos de estreptavidina con biotina que no es covalentemente al RNA, por ejemplo) el exceso de biotina-HPDP que no reaccionó. En tercer lugar, como se describe en el protocolo, se recomienda el uso de las bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina indicados, puesto que los varios grupos que tenemos de investigación habló que todo indica que estos granos llevaron a bajar los niveles de fondo. Puede usarse en cuarto lugar, adecuado controles de calidad y experimentales. Incluyen muestras procedentes de las células que no fueron expuestas a 4tU/4sU. Estas muestras serán de gran valor para los niveles de fondo de dirección y para asegurarse de, durante el experimento, no se produce una contaminación con ARN no etiquetados. También, otra excelente alternativa para probar si la muestra es enriquecida para el ARN recién sintetizado es realizar una RT-qPCR utilizando cebadores contra un gen que contiene la introducción. Los cebadores deben ser complementarios al extremo 3' y 5' el extremo de dos consecutivos exón y del intrón o viceversa. Por último, antes de la secuencia de la hibridación de microarrays, validar las muestras por RT-qPCR. Para esto, genes diferentes con diferentes niveles de expresión y regulación deben ser seleccionados y analizados. Óptimo, esto debe realizarse para las dos fracciones diferentes de RNA (RNA recién sintetizada y de estado estacionario).

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Laszlo Tora por su apoyo y V. Fisher, Schumacher K. y F. El Saafin para sus discusiones. T.B. fue apoyado por una beca Marie Curie ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) y la Fundación arco. Este trabajo fue financiado por los fondos de la Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Este estudio fue apoyado también por ANR-10-LABX-0030-INRT, un fondo del Estado francés a cargo de la Agence Nationale de la Recherche en el marco programa Investissements Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210

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References

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

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Comportamiento número 140 S. cerevisiae ARN transcripción recientemente sintetiza ARN 4-tiouracilo ARN polimerasa II complejo de SAGA
<em>Saccharomyces cerevisiae</em> Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II
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Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).

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