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Methodenartikel

Eine neuartige Operationstechnik als Grundlage für In Vivo teilweise Leber Engineering in der Ratte

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DOI:

10.3791/57991

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6. Oktober 2018

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1Experimental Transplantation Surgery, Department of General, Visceral and Vascular Surgery, University Hospital Jena

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir etablieren eine neuartige Operationstechnik für ein Modell in Vivo einzelne Leber Lappen Perfusion in der Ratte als Voraussetzung für das weitere Studium in Vivo teilweise Leber engineering in der Zukunft.

Zusammenfassung

Orgel-Engineering ist eine neuartige Strategie zur Leber Orgel ersetzt, die potenziell verwendet werden können in der Transplantationsmedizin zu generieren. Vor kurzem hat in Vivo Leber engineering, einschließlich in Vivo Orgel Decellularization gefolgt von Wiederbesiedlung, ein vielversprechender Ansatz über ex Vivo Leber Engineering entwickelt. Postoperative überleben wurde jedoch nicht erreicht. Das Ziel dieser Studie ist es, eine neuartige Operationstechnik der in Vivo selektive Leber Lappen Perfusion bei Ratten als Voraussetzung für in Vivo Leber Technik zu entwickeln. Wir generieren einen Bypass Schaltung nur durch den linken seitlichen Lappen. Dann ist der linke seitliche Lappen mit heparinisierten Kochsalzlösung durchblutet. Das Experiment wird durchgeführt mit 4 Gruppen (n = 3 Ratten pro Gruppe) basierend auf verschiedenen Perfusion Zeiten von 20 min, 2 h, 3 h und 4 Std. Überleben sowie die makroskopisch sichtbare Veränderung der Farbe und histologisch entschlossen fehlender Blutzellen in den Portal-Dreiklang und der Sinusoide wird als Indikator für ein erfolgreiches Modell Einrichtung übernommen. Nach selektiver Perfusion der linken seitlichen Lappen beobachten wir, dass der linke seitliche Lappen in der Tat, von rot bis schwach gelb aktiviert. In einer histologischen Beurteilung sind keine Blutzellen sichtbar im Bereich der Pfortader, die zentrale Vene und der Sinusoide. Der linke seitliche Lappen wird nach der Wiedereröffnung der blockierten Schiffe rot. 12/12 Ratten überlebt die Prozedur für mehr als eine Woche. Wir sind die ersten, die eine chirurgische Modell für in Vivo einzelne Leber Lappen Perfusion mit einer langen Überlebenszeit von mehr als einer Woche zu melden. Im Gegensatz zu den zuvor veröffentlichten Bericht der wichtigste Vorteil der hier vorgestellten Technik ist, die Durchblutung von 70 % der Leber bleibt während des gesamten Verfahrens. Die Einrichtung dieser Technik bietet eine Grundlage für in Vivo teilweise Leber Engineering bei Ratten, einschließlich Decellularization und Recellularization.

Einleitung

Die Indikationen für eine Organtransplantation werden ständig erweitert. Im Gegensatz dazu sind Organspenderaten und die allgemeine Qualität der Organe rückläufig führt zu einer steigenden Nachfrage nach Transplantationen. Die Zahl der Kandidaten zur Lebertransplantation Warteliste hinzugefügt weiter zu erhöhen (z. B.in den Vereinigten Staaten 11.340 Patienten wurden im Jahr 2016, gegenüber 10.636 im Jahr 2015)1. Trotz erheblicher Anstrengungen entspricht die Anzahl der verfügbaren Organe nicht klinischen Anforderungen. Aufgrund der erhöhten Inzidenz von Lebererkrankungen viele Patienten mit terminaler Erkrankungen der Leber sterben auf der Warteliste Transplantation vor ein Spenderorgan verfügbar. Um die riesige Nachfrage nach Spender Leber Transplantationen verfolgt alternative Ansätzen Lebergewebe Konstruktionsprinzipien aktiv werden2. Heute konnte eine neu entwickelte biologische Technik der Leber Technik potenziell diesen Mangel überwinden.

Leber-Technik besteht aus zwei Schritten: die Generation der eine azelluläre Gerüst, gefolgt von einer Wiederbesiedlung des Gerüstes. Um eine biologische azellulärer Leber Gerüst zu erhalten, ist die explantierten Leber PERFUNDIERTEN über das Gefäßsystem mit ionische oder nichtionische Detergentien, die das Zellmaterial aus der Leber entfernen können. In den meisten bisherigen Studien erzielte biologische azellulärer Leber leski Perfusion der Leber mit einer Kombination von Sodium Dodecyl Sulfat und TritonX100. Infolgedessen wurden alle Zellen entfernt, während die Struktur der extrazellulären Matrix beibehalten wurde. Die Orgel-Gerüste wurden mit Reifen Zellen, hepatozellulären, sowie endothelialen Zell-Linien und primäre Hepatozyten mit oder ohne die gleichzeitige Anwendung von Endothelzellen oder mesenchymalen Stammzellen (MSC) nachgesät. Die meisten Forscher konzentrieren sich auf ex-Vivo Leber engineering3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. In den meisten bisherigen Studien wurden jedoch nur kleine Stücke von Waldlandschaften Gerüst Würfel in verschiedenen heterotopisch Implantation Sites transplantiert. In einigen Studien wurden teilweise Waldlandschaften Gerüste als eine zusätzliche Transplantat transplantiert. Allerdings war die maximale berichtete Überlebenszeit nur 72 h8,14. Soweit wir wissen, wurde über orthotopen Transplantation eine Waldlandschaften volle Leber Transplantation noch nicht aufgeführt oder veröffentlicht. Die langfristige Funktion und veränderter Organtransplantation sind noch in den Kinderschuhen. Daher ist ein alternativer Ansatz zur ex Vivo Leber Technik erforderlich.

In Vivo Leber Technik kann eine Alternative zum hepatischen Wiederbesiedlung unter physiologischen Bedingungen studieren darstellen. Die Vorteile von in Vivo Leber Technik im Vergleich zu ex Vivo Leber Technik sind vielfältig. Die in Vivo aufgefüllt teilweise Leber Gerüst unterliegt physiologischen Durchblutung mit der richtigen Temperatur, genügend Sauerstoff, Nährstoffen und Wachstumsfaktoren im Gegensatz zu ex-Vivo Perfusion mit künstlichen Kulturmedium. Darüber hinaus hält die restlichen teilweise normale Leber die Leberfunktion, so dass vor allem langfristiges Überleben. Da eine implantierte ex Vivo entwickelt Leber Transplantat noch nicht in der Lage, unterstützen das langfristige Überleben der Versuchstiere durch ihre Leberfunktion8ist, wir uns vorstellen, dass in Vivo teilweise Leber Engineeringwould letztlich eine zukunftsträchtiges Modell um die Entwicklung von veränderter Lebern mit länger überleben Beobachtungen als ex-Vivoweiter zu studieren.

Vor kurzem präsentierte eine Forschungsgruppe (Pan und Kollegen) zum ersten Mal eine Technik der in Vivo Leber engineering-15. Sie erreicht die isolierte Perfusion des Rechts minderwertig Leber Lappens in lebenden Ratten trotz anatomischen und technische Herausforderungen. Sie meldeten die ersten intraoperative Ergebnisse in Vivo Wiederbesiedlung mit einer Ratte primäre Hepatozyten-Zelllinie. Jedoch in Vivo chirurgische Perfusion Modell von Pan Et Al. hat Nachteile. Sie erreichten einzelne Leber Lappen Perfusion bei Ratten auf Kosten vollständig blockieren die Pfortader und minderwertige Hohlvene, die das Tier schwere Schäden zufügen kann. Die experimentellen Ratten wurden nach nur 6 Stunden intraoperative Beobachtungszeit geopfert. Daher, die in Vivo Leber Lappen Perfusion Technik bedarf weiterer Verbesserungen, postoperative Überleben zu erreichen.

Wir entwickelten ein Roman überleben Modell für in Vivo Leber Lappen Perfusion, basierend auf früheren Studien der hepatischen Anatomie der Ratte16, die Pfortader Kanülierung Technik für die hämodynamische Überwachung in den Mäusen17und Leber bioengineering 18 , 19. die wichtigsten Schritte des Verfahrens sind in Figur 1A – 1Edargestellt.

Diese Technik eignet sich für diejenigen, die dieses experimentelle in-Vivo Perfusion Modell für Grundlagenforschung auf teilweise Orgel Behandlung durch Infusion mit Drogen, in Vivo Decellularization als eine chemische Resektion für organerkrankungen verwenden möchten (z.B. , Leberkrebs), in Vivo Zellkultur in einer decellularized Matrix vergleichen ex Vivo zwei- und dreidimensionale Zell-Kultur Systeme20,21,22,23 , 24 , 25 , 26und in Vivo Leber engineering durch Decellularization und Wiederbesiedlung.

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Protokoll

Das Gehäuse und alle durchgeführten Verfahren wurden im Einklang mit deutschen Tierschutzvorschriften. Alle Gaze, Verkleidung Kleidung und chirurgische Instrumente sind autoklaviert und vor der Operation vorbereitet. Alle Verfahren werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

1. Vorbereitung der Ratte für den chirurgischen Eingriff

  1. Die Ratte in eine Induktion-Kammer und Betäuben Sie die Ratte mit 4 % verdampft Isoflurane und 100 % Sauerstoff bei 0,5 L/min für ca. 3 min zu, bis die Ratte vollständig betäubt ist.
  2. Nehmen Sie die Ratte aus der Induktion Kammer und Messen Sie seines Körpergewichts.
  3. Das Fell der chirurgischen Region auf dem Bauch zu rasieren.
  4. Legen Sie das Tier zurück in Isofluran Kammer für eine zusätzliche 2 min, Anästhesie zu vertiefen.
  5. Legen Sie die Ratte auf dem OP-Tisch in Rückenlage.
  6. Beheben Sie Anästhesie-Maske in die Mund-Region der Ratte zu und halten Sie das Tier mit einem kontinuierlichen Gasstrom von 2 % verdampft Isoflurane und 100 % Sauerstoff mit einer Durchflussrate von 0,5 L/min betäubt.
  7. Befestigen Sie die Gliedmaßen mit Klebestreifen.
  8. Tragen Sie Tierarzt Salbe auf beide Augen, Trockenheit zu verhindern.
  9. Verwalten von Buprenorphin 0,05 mg/kg subkutan, zur Schmerzlinderung während der Betriebsdauer.
  10. Das OP-Feld des Bauches mit 3 Runden der Jod-Tinktur, gefolgt von 2 Runden von 70 % Alkohol zu desinfizieren.
  11. Ort sterilisiert Gaze in der Gegend, wo der Schnitt gemacht werden, um nur das Operationsfeld des Bauches ausgesetzt zu verlassen.
  12. Gehen Sie zum Ausführen des Vorgangs, wenn der Zeh-Prise Rückzug Reflex der Ratte nicht vorhanden ist.

2. Laparotomie der Ratte

  1. Machen Sie eine transversale Haut und Muskel Bauchschnitt mit Schere und eine elektrische Coagulator.
  2. Beheben Sie und ziehen Sie den Xiphoid Prozeß in Richtung zum Kopf mit einer 4: 0-Polypropylen-Naht.
    Hinweis: Achten Sie auf heben Sie die Xiphoid Prozeß senkrecht zur besseren Expose der Leberzellkrebs, aber gehen mit Vorsicht zu schweren respiratorischen Einschränkung und Erstickungsgefahr zu vermeiden.
  3. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch ziehen beide Seiten der Bauch-Wände in Richtung des Kopfes mit zwei subcostal Haken um die Leber freizulegen.
  4. Decken Sie den Zwölffingerdarm und Dünndarm in die Bauchhöhle mit einem angefeuchteten Gaze um Austrocknen zu vermeiden.
  5. Heben Sie Links und rechts mittlere Lappen mit einem angefeuchteten Gaze an und halten Sie sie gegen den Brustkorb zu besseren setzen das Hilum der Leber.
  6. Legen Sie die Ratte unter einem Stereomikroskop (8 X Vergrößerung).
  7. Fallen Sie einige warme Kochsalzlösung in den Bauch und auf die Oberfläche der Leber und der Darm alle mehrere Minuten, um zu verhindern, während des gesamten Verfahrens trocknen.

3. Einrichtung einer Bypass-Passage innerhalb der linken seitlichen Lappen

  1. Zerlegen Sie der linken portalader und verbinden Sie es mit einer 6-0 Seide Naht an der Basis (Abbildung 2A).
  2. Blockieren der linken leberarterie, der linken Gallengang sowie die linke mittlere Pfortader, die linke mittlere leberarterie und die linke mittlere Gallengang mit Mikro Klemmen um einen Fluss von der Perfusat die linke mittlere Lappen (Abb. 2 b) zu verhindern.
  3. Trennen des linken seitlichen Lappens durch das Abschneiden der umgebenden Bänder des Lappens durch Mikro-Schere.
  4. Blockieren der linken seitlichen Lebervene klemmend an der Unterseite der linken seitlichen Lappen mit Mikro Klemmen (Abbildung 2).
    Hinweis: Stellen Sie sicher nicht zu der linken portalader auch versehentlich Klemmen.
  5. Verwendung Mücke, die Ligatur der linken portalader und halten die Vene mit richtige Spannung für spätere Kanülierung Klemmen.
  6. Machen Sie einen Einschnitt sorgfältig in der vorderen Wand des linken portalader durch Punktion es mit einem 24-G-Nadel-Wohnung-Katheter ( Abb. 3A).
    Hinweis: Um einen Bypass zu erstellen, sind Gefäßzugang Punkte auf der linken portalader und der linken Lebervene erforderlich. Für diesen Schritt ist es bevorzugt, die vaskulären Zugang erstellen, indem Sie die Gefäße mit einer Nadel durchstechen, anstatt einen größeren Schnitt mit einer Schere. Dies reduziert das Risiko von Blutungen und späteren Stenose.
  7. Zurückziehen Sie des Katheters und nehmen Sie die Nadel aus der Katheter Katheter nadelfreien 24-G zu erhalten.
  8. Verbinden Sie den Katheter mit einer Perfusion Röhre, die verbindet der anderen Endpunkt zu einer 20-mL-Spritze mit 15 mL 40 U/mL heparinisierten Kochsalzlösung auf einer Perfusion Pumpe.
  9. Schalten Sie die Pumpe für die Vorrichtung des Rohres um Luft heraus aus der Tube und nadelfreie Katheter zu vertreiben.
  10. Schalten Sie die Pumpe Perfusion.
  11. In der linken portalader über die punktierte Schnittführung auf die Vene (Abb. 3 b) die nadelfreien Katheter wieder einsetzen.
    Hinweis: Aufgrund der Tatsache gibt es sehr wenig Platz für die Befestigung des Katheters, es ist an dieser Stelle nicht festgelegt. Daher sollte der Chirurg Sorgfalt verwenden, die Vertreibung des kanülierte Katheters zu vermeiden.
  12. Machen Sie sorgfältig ein weiterer Einschnitt am Rand der sichtbaren Region des linken seitlichen Lebervene durch Punktion es mit einem 22 - 24 G-Nadel-Wohnung-Katheter (Abbildung 3).
    Hinweis: Es wird empfohlen, dass der Katheter etwas kleiner als das Schiff sein.
  13. Zurückziehen Sie des Katheters und nehmen Sie die Nadel aus der Katheter, einen nadelfreien 22-G-Katheter zu erhalten.
  14. Schalten Sie die Pumpe Perfusion in der linken seitlichen Lappen über heparinisierten Kochsalzlösung durchspülen 24-G kanülierte nadelfreien Katheter von der linken portalader bei einer Durchflussrate von 0,5 mL/min.
  15. Verwenden Sie trockene Gaze, um Out-fließenden Abfall Flüssigkeit rund um den Einschnitt der linken seitlichen Lebervene zu absorbieren.
  16. Cannulate der linken seitlichen Lebervene über die punktierte Inzision der Vene mit dem 22-G nadelfreien Katheter, um einen fluidauslaß zur Minimierung von intra-abdominalen Kontamination (Abbildung 3D) zu generieren.
    Hinweis: Es ist technisch schwierig, den kanülierte Katheter zu der Leber Lappen zu beheben. Daher sollte der Chirurg auf Verschiebung des Katheters zu vermeiden achten. Ohne Kanülierung der linken seitlichen Lebervene mit einem Katheter, kann alternativ auch am Schnitt und Umgebung die Vene nur mit einem trockenen Gaze Abfall Flüssigkeit aufgenommen werden.
  17. Halten Sie die Vorrichtung des linken seitlichen Lappens mit heparinisierten Kochsalzlösung für etwa 20 min (Gruppe 1) und dann nur mit Kochsalzlösung für 2 h, 3 h oder 4 h (Gruppe 2, Gruppe 3 und Gruppe 4, beziehungsweise).
  18. Schalten Sie die Pumpe stoppt die Perfusion.

4. physiologische Reperfusion des linken seitlichen Lappen

  1. Nehmen Sie beide Katheter aus der linken portalader und der linken seitlichen Lebervene.
  2. Schließen Sie den Schnitt von der linken portalader mit einem 11: 0 Polyamid Naht.
  3. Den Schnitt des linken seitlichen Lebervene mit einer 11-0-Polyamid-Naht sowie in der Nähe.
  4. Zykluszeit der linken seitlichen Lebervene.
  5. Die linke mittlere Pfortader, linken Gallengang und linken leberarterie Zykluszeit.
  6. Schneiden Sie die Ligatur auf der linken portalader, die Vene wieder zu öffnen.

(5) Verschluss der Bauchwand

  1. Schließen Sie die Muskelschicht der Bauchwand durch unterbrochene vernähen mit einem 4: 0 resorbierbaren Polyglactin 910 Naht.
  2. Schließen Sie die Hautschicht der Bauchwand durch unterbrochene vernähen mit einem 4: 0 resorbierbaren Polydioxanon Naht.
  3. Schließen Sie den Bauch und Desinfizieren Sie den Hautschnitt mit 70 % Alkohol.

6. postoperative Behandlung der Ratte

  1. Legen Sie das Tier auf eine wärmende Unterlage zur Reanimation für ca. 10 min und dann legen Sie sie in einen neuen Käfig.
  2. Verwalten von Buprenorphin 0,05 mg/kg subkutan 2 x pro Tag für ein in Folge 3-d postoperativ, Schmerzen zu veröffentlichen.

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Ergebnisse

Zwölf Männer (im Alter von 12 - 13 Wochen) Lewis-Ratten wurden verwendet, um die Auswirkungen der selektiven Leber Lappen Perfusion zu bewerten. Der Versuch wurde durchgeführt in vier Gruppen (n = 3 Ratten pro Gruppe). Mit verschiedenen Perfusion Perioden von 20 Minuten, erreicht 2 Stunden, 3 Stunden und 4 Stunden, nach den oben beschriebenen Schritten wir erfolgreich in Vivo einzelne Lappen Perfusion.

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Diskussion

Durch blockieren und Metallspirale der linken portalader mit einem Katheter als eine Flüssigkeit Bucht und der linken seitlichen Lebervene mit einem anderen Katheter als eine Flüssigkeit austritt, erzielten wir erfolgreich eine in Vivo Fluid Bypass innerhalb der linken seitlichen Lappen darauf hinweist, dass Obwohl die Technik höchst anspruchsvollen aufgrund der geringen Größe der Schiffe für Kanülierung und ein hohes Risiko für Blutungen verursacht, ist es machbar. Sogar die Ratten in einer langen Perfusion 4 S...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten danken Jens Geiling aus dem Institut für Anatomie I, Universitätsklinikum Jena, für die Herstellung der schematischen Zeichnungen der Ratte Leber Anatomie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Perfusionspumpe
Perfusor VIB. Braun, Melsungen
Katheter
Versatus-W  KatheterTerumoSR+DU2419PX24G, 0,74 x 19mm
Versatus-W  KatheterTerumoSR+DU2225PX22G, 0,9-fach; 25mm
Mikrochirurgie Instrument
MikroschereF· S· LNr. 14058-09
micro serrefineF· S· LNr.18055-05
Mikroklemmen ApplikatorF· S· LNr. 18057-14
Gerade MikrozangeF· S· LNr. 00632-11
Gebogene MikropinzetteF· S· LNr. 00649-11
Mikro-NadelhalterF· S· LNr. 12061-01
allgemeinchirurgische Instrumente
Standard-SchereF· S· L
Moskito-KlemmeF· S· L
gezackte PinzetteF & Middot; S· L
ZahnzangeF & Middot; S· L
NadelhalterF· S· L
Naht
4-0 proleneethicon
4-0 ETHICON*IIethicon
6-0 silkethicon
11-0 Polyamidethicon

Referenzen

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