Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von endokrinen Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen gefolgt von einzelligen RNA Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Analysen der pankreatischen endokrinen Linie Entwicklung, Zell-Heterogenität und transkriptomischen Dynamik.

Abstract

Pankreatische endokrine Zellen, die in Inseln gruppiert sind, Regeln Blut-Glukose-Stabilität und Energiestoffwechsel. Die unterschiedlichen Zelltypen in Inseln, einschließlich Insulin-sezernierenden β-Zellen werden von gemeinsamen endokrine Vorfahren während der embryonalen Phase unterschieden. Unreife endokrine Zellen über Zellproliferation zu erweitern und einen lange postnatale Entwicklung Zeitraum Reifen. Allerdings sind die Mechanismen, die diese Prozesse nicht klar definiert. Einzelne Zelle RNA-Sequenzierung ist ein vielversprechender Ansatz für die Charakterisierung von unterschiedlichen Zellpopulationen und Ablaufverfolgung Zelle Abstammung Differenzierung Wege. Hier beschreiben wir eine Methode für die einzelne Zelle RNA-Sequenzierung der isolierte Pankreatische β-Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen.

Introduction

Die Bauchspeicheldrüse ist eine wichtige Stoffwechselorgan bei Säugetieren. Die Bauchspeicheldrüse besteht aus endokrinen und exokrinen Fächer. Endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse, Insulin produzierenden β-Zellen und Glukagon produzierenden α Zellen, einschließlich cluster gemeinsam in den Langerhans-Inseln und koordinativ systemische Glukose Homöostase zu regulieren. Dysfunktion der endokrinen Zellen führt zu Diabetes Mellitus, die eine wichtige gesundheitspolitische Frage weltweit geworden ist.

Endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse stammen aus Ngn3⁺ Vorfahren während der Embryogenese¹. Später, während der Perinatalperiode die endokrinen Zellen vermehren sich zu Form unreifen kleinen Inseln. Diese unreifen Zellen weiter zu entwickeln und allmählich reifer Inselchen, die reich durchblutet werden, um Blut-Glukose-Homöostase in Erwachsene²zu regulieren.

Obwohl eine Gruppe von transcriptional Faktoren, die β-Zell-Differenzierung zu regulieren identifiziert worden, ist die präzise Reifung Weg der β-Zellen noch unklar. Darüber hinaus beinhaltet der β-Zelle-Reifung auch die Regulierung der Zelle Nummer Erweiterung^3,4 und die Generierung von zellulären Heterogenität^5,6. Die Regulierungsmechanismen dieser Prozesse sind jedoch nicht gut untersucht worden.

Einzelne Zelle RNA-Sequenzierung ist ein leistungsfähiger Ansatz, der Zelle Subpopulationen Profil und Zelle Abstammung Entwicklungsbiologie Bahnen⁷verfolgen kann. Nutzen diese Technologie, die Schlüssel, die Ereignisse, die während der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen auftreten bei den einzelligen Ebene⁸entziffert werden können. Unter den einzelligen RNA-Sequenzierung Protokolle ermöglicht Smart-seq2 die Erzeugung von in voller Länge cDNA mit verbesserte Empfindlichkeit und Genauigkeit und die Verwendung von standard Reagenzien bei niedrigeren Kosten⁹. Smart-seq2 dauert ungefähr zwei Tage, eine cDNA-Bibliothek für Sequenzierung¹⁰zu konstruieren.

Hier schlagen wir eine Methode zur Isolierung von Fluoreszenz-markierten β-Zellen aus den Bauchspeicheldrüsen von fetalen Erwachsenen Ins1-RFP Transgene Mäuse¹¹, mit Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und die Leistung des transkriptomischen analysiert, bei der einzellige Ebene, mit Smart-seq2 Technologie (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann erweitert werden, um das Transkriptom alle pankreatischen endokrinen Zelltypen in normalen und pathologischen Altern Staaten zu analysieren.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Peking-Universität genehmigt.

1. die Bauchspeicheldrüse Isolation

1. Für E17.5 (embryonale Tag 17,5) Embryonen:
   1. Embryonalen Tag 0,5 Basierend auf dem Zeitpunkt erscheint der vaginal Plug zu schätzen.
   2. Die schwangere Mäuse durch CO₂ Verwaltung zu opfern. Sprühen Sie das Bauch-Fell mit 70 % Alkohol.
   3. Machen Sie einen v-förmigen Schnitt mit der Schere aus dem Genitalbereich Erweiterung an den Rippen. Dieser Prozess wird komplett im Bauchraum geöffnet.
   4. Sezieren Sie die Gebärmutter aus der Bauchhöhle zu und legen Sie sie in einer 10 cm Petrischale mit kaltem PBS.
   5. Zerlegen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter mit dünnen Spitzen Pinzette unter einem Stereomikroskop, andere Gewebe wie die Plazenta und die Nabelschnur zu entfernen. Legen Sie alle Embryonen in einem 10 cm-Schüssel mit kaltem PBS.
   6. Reißen Sie die Embryonen Bauchhöhle und Graben der viszeralen Gewebes mit Ellenbogen Pinzette. Übertragen Sie die viszerale Gewebe in eine 6 cm-schwarz-unten-Schale mit kaltem PBS.
   7. Die Bauchspeicheldrüse befindet sich in der oberen linken Teil des Bauches und legt auf die Milz, Magen und Zwölffingerdarm (gelbe gestrichelte Linie in Abbildung 2A)¹². Lösen der Bauchspeicheldrüsen aus dem viszeralen Gewebe mit Pinzette und bündeln das Pankreasgewebe zusammen in ein 20 mL-Fläschchen mit 5 mL 0,5 mg/mL kalte Kollagenase Lösung: 0,5 mg/mL Kollagenase P in Isolation Puffer (HBSS mit 10 mM HEPES, 1 mM MgCl₂ 5 mM Glucose, pH 7.4).
2. Für Mäuse P0-P15 (postnatale Tag 0-15):
   1. Opfern und die Maus durch die Einhaltung der Gliedmaßen, ein Stück der Benchtop-Protector mit Klebeband fixieren. Sprühen Sie das Bauch-Fell mit 70 % Alkohol.
   2. Vollständig öffnen der Bauchhöhle, wie in Schritt 1.1.3 beschrieben. Ziehen Sie den Darm, und auf der linken Seite der Maus. Dieses Verfahren wird der Zwölffingerdarm, Magen und Milz Lappen der Bauchspeicheldrüse aussetzen. Sorgfältig sezieren Sie alle Lappen der Bauchspeicheldrüse (Abb. 2 b)¹² und bündeln Sie das Pankreasgewebe zusammen in ein 20 mL-Fläschchen mit 5 mL 0,5 mg/mL kalte Kollagenase-Lösung.
3. Für Mäuse P18-P60 (postnatale Tag 18-60):
   1. Bereiten Sie die Kollagenase-Lösung. Auf Eis bis zur Verwendung aufbewahren.
   2. Opfern Sie die Maus zu und öffnen Sie die Bauchhöhle zu, wie bereits erwähnt (Schritt 1.1.2 und 1.1.3).
      Hinweis: Die Leber nicht zu verletzen, jede Wunde, die Leber wird der Fließdruck in den Gallengang verringern und die Perfusion Effizienz der folgende Schritt.
   3. Entfernen Sie die Xiphoid. Ziehen Sie den Darm, und auf der rechten Seite der Maus, und drücken Sie die linken und rechts medialen Lappen der Leber auf jeder Seite der Gallenblase (weißer Pfeil in Abbildung 2) und der hauptgallengang auszusetzen.
   4. Klemmen Sie den Zwölffingerdarm mit ein paar kleinen Schiff Klemmen an der oberen und unteren Position, flankieren die Website, wo der Gallengang tritt in den Zwölffingerdarm (Abb. 2D).
      Hinweis: Die Magen oder Milz Lappen der Bauchspeicheldrüse nicht einspannen. Die Kollagenase-Lösung fließen nicht in den Magen und Milz Lappen der Bauchspeicheldrüse im nächsten Schritt wenn geklemmt.
   5. Füllen Sie eine Spritze mit 5 mL 0,5 mg/mL kalte Kollagenase Lösung und 30 G Nadel in der Gallenblase. Manipulieren Sie sorgfältig und gleichmäßig, die Nadel durch den Gallengang.
   6. Durchspülen der Bauchspeicheldrüsenkrebs durch die Injektion von 1 – 5 mL 0,5 mg/mL kalte Kollagenase Lösung, abhängig von der Größe der Maus. Die Injektion sollte langsam und konstant zu verhindern, dass die Nadel aus dem Rohr rutscht und zu verhindern, dass der Darm platzen unter Hochdruck flüssig sein. Die Injektion ist abgeschlossen, wenn die Bauchspeicheldrüse voll ausgebildet ist.
   7. Die Bauchspeicheldrüse (das gelbe gestrichelte Linie in Abb. 2D) aus der Bauchhöhle mit Pinzette unmittelbar nach der Perfusion zu sezieren. Legen Sie das Gewebe in eine 20 mL-Fläschchen mit 5 mL 0,5 mg/mL kalte Kollagenase-Lösung. Wenn mehrere Mäuse gleichzeitig bearbeiten, durchspülen Sie die Mäuse eins nach dem anderen und bündeln Sie das Gewebe in kalten Kollagenase-Lösung in ein 20 mL Fläschchen zu, bis alle Mäuse seziert worden.

(2) Collagenase Verdauung und Inselchen Isolation

1. Legen Sie die 20 mL-Fläschchen mit der Bauchspeicheldrüsen-Gewebe in ein Wasserbad von 37 ° C und 3 min auf die Temperatur equilibrate inkubieren.
2. Schütteln Sie das Rohr für weitere 3 bis 5 Minuten. Wenn die Bauchspeicheldrüse-Gewebe vollständig aufgeblasen ist, wird es nach und nach in kleinen Gewebe Stücke distanzieren, bis es schließlich gleichmäßig verteilt ist. Die Verdauung Zeit hängt von der Bauchspeicheldrüse-Größe und die Perfusion Effizienz.
3. Filtern Sie das verdaute Produkt durch ein 0,25 mm Nylon Sieb in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen. Das Sieb mit einer 20 mL Spritze mit eiskaltem PBS gründlich zu waschen.
4. Überspringen Sie für E17.5-P15 Bauchspeicheldrüsen Schritt 3.1.
5. Für P18-P60 Bauchspeicheldrüsen 200 X g für 1 min zentrifugieren und den überstand verwerfen. Wieder aussetzen des Gewebes mit kaltem PBS.
6. Gießen Sie 5 mL der Suspension Gewebe in einer 6 cm schwarz-unten Schüssel. Die pankreatischen kleinen Inseln sind klein, kompakt, milchig weißen Strukturen und acinar Gewebe ist locker und durchscheinend weiß. Wählen Sie Inselchen mit einer 200 μl Pipette aus und übertragen Sie sie in ein 1,5 mL Röhrchen mit einer kleinen Menge an kaltem PBS.

3. Trypsin-Verdauung von Bauchspeicheldrüsen-Gewebe oder Inseln

1. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit Bauchspeicheldrüsen-Gewebe oder Inseln 200 X g für 1 min bei 4 ° C und verwerfen Sie den überstand, ohne zu stören das Pellet.
2. Das Pellet mit 0,25 % Trypsin-EDTA wieder auszusetzen und im Wasserbad 37 ° C inkubieren. Aspirieren Sie nach 4 min Inkubation sanft und gelegentlich (Pipette) für 1 min mit 200 μL Spitzen.
   Hinweis: Für E17.5-P3 Bauchspeicheldrüsen, fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA. Fügen Sie für P4-P15 Bauchspeicheldrüsen 3 mL Trypsin-EDTA hinzu. Fügen Sie für 100-300 Inseln 1 mL Trypsin-EDTA. Stellen Sie die Lautstärke von Trypsin-EDTA entsprechend der Menge des Gewebes.
3. Die Verdauung durch Hinzufügen von 0,4 X Volumen der kalten fetalen bovine Serum (FBS) zu stoppen und durch sanfte Wirbel mischen.
4. Zentrifuge bei 250 X g für 3 min bei 4 ° C. Den überstand ohne zu stören das Pellet zu verwerfen.
5. Wieder auszusetzen, die Zellen mit 200 μL kalt FACS Puffer (HBSS mit 1 % FBS, pH 7.4). Übertragen Sie Zellen auf einem 5 mL FACS-Rohr.
6. Schnell Drehen der FACS-Röhre um die Zellsuspension durch den Filter, unverdaute große Gewebe Ablagerungen zu entfernen gehen zu ermöglichen. Die einzigen Zellsuspension in der Röhre ist nun bereit für die Sortierung von FACS.

4. Single-Zell-Lyse

1. Bereiten Sie Zelle Lysis Puffer.
   Hinweis: Führen Sie alle Experimente unter einer UV-entkeimt Kapuze mit Laminar-Flow. Alle Rohre, Platten und Pipettenspitzen sollte RNase- / DNase-free. Die Motorhaube und Pipetten mit RNase Weg Lösung vor Gebrauch zu dekontaminieren.
   1. Die Reagenzien auf Eis Auftauen: dNTP (10 mM), Oligo-dT Grundierung (10 μM) und ERCC Lager Lösung (01:20).
   2. Verdünnen Sie das ERCC bis 1:5 x 10⁵ mit Nuklease-freies Wasser.
   3. Berechnen Sie das Volumen der Zelle Lysis Puffer benötigt. Fügen Sie 0,1 μl RNase-Inhibitor (40 U/μl), 1.9 μL von 0,2 % (Vol/Vol) Triton x-100, 1 μl dNTP, 1 μL Oligo-dT Grundierung und 0,05 μL der verdünnten ERCC zu einem Endvolumen von 4,05 μL für jede Zelle.
   4. Aliquot der Zelle Lysis Puffer in 0,2 mL Dünnwand-8-Streifen PCR Schläuche oder 96-Well Platten. Zentrifugieren Sie die Rohre oder Platten für 30 s bei 4 ° C.
      Hinweis: Zentrifugieren Sie 0,2 mL Dünnwand-8-Streifen PCR Schläuche auf 7500 x g und 96-Well-Platten bei 800 X g in den folgenden Schritten.
2. Einzellige Kommissionierung und Lyse.
   1. Manuell wählen FACS Ins1-RFP⁺ einzelne Zellen im FACS Puffer in 8 Streifen PCR-Röhrchen mit einer 30-40 µm Kapillare Pipette sortiert, oder direkt sortieren Einzelzellen Ins1-RFP⁺ in 96-Well-Platten. Das Volume mit einer einzelnen Zelle gilt als weniger als 0,3 μL.
      Hinweis: Verwendung forward Scatter Höhe (FSC-H) Vs vorwärts Scatter Bereich (FSC-A) gating Strategie für Wams Diskriminierung, FSC-H Vs side Scatter-Bereich (SSC-A) für Schutt und Fluoreszenz gating für Ins1-RFP⁺ Zellsortierung (Abbildung 3A-3C). Sortieren Sie für die entnahmemethode die Zielzellen in eine 1,5 mL Röhrchen mit 300 μL FACS Puffer. Die entsprechenden Endkonzentration wird 5 – 10 Zellen/μL. Das Puffervolumen entsprechend anpassen. Sortieren Sie für die Platte Erfassungsmethode eine einzelne Zelle in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte nach dem Handbuch des Instruments. ^{7 , 13}
   2. Wirbel der Rohre oder Platten zur lyse der Zellen und lassen Sie die RNA. Zentrifugieren Sie die Rohre oder Platten für 30 s bei 4 ° C und sofort auf Eis legen.
      Hinweis: Die Zellen können bei-80 ° C eine Woche aufbewahrt werden.

(5) einzellige cDNA Amplification

1. Reversen Transkription (RT).
   1. Die RT-Reagenzien (Tabelle 1) auf dem Eis Auftauen.
   2. Die Proben bei 72 ° C für 3 min inkubieren und sofort setzen die Rohre oder Platten auf Eis für mindestens 1 min. kurz Zentrifugieren die Rohre oder Platten für 30 s bei 4 ° C.
      Hinweis: Verwenden ein Thermocycler mit 105 ° C erhitzt, Deckel für alle Inkubationen.
   3. Bereiten Sie die RT-Mischung für alle Reaktionen, wie in Tabelle 1beschrieben.
   4. 5.7 μl RT-Mix für jede Probe insgesamt 10 μL Volumen zu verzichten. Sanft die Mischung Vortex und Zentrifuge für 30 s bei 4 ° C.
   5. Legen Sie die Proben in einem Thermocycler und starten Sie das RT-Programm wie folgt: 42 ° C für 90 min, 10 Zyklen (50 ° C für 2 min, 42 ° C für 2 min), 70 ° C für 15 min und Halt bei 4 ° C.
2. PCR-Vorverstärkung.
   1. Die PCR Reagenzien (Tabelle 2) auf dem Eis Auftauen.
   2. Vorbereiten des PCR-Mixes für alle Reaktionen, wie in Tabelle 2beschrieben.
   3. 15 μl des PCR-Mixes zu jeder Probe, enthält die erste Strang Reaktionen zu verzichten. Sanft die Mischung Vortex und Zentrifuge für 30 s bei 4 ° C.
   4. Legen Sie die Proben in einem Thermocycler und starten Sie das folgende PCR-Programm: 98 ° C für 3 min, 18 Zyklen (98 ° C für 20 s, 67 ° C für 15 s, 72 ° C für 6 min.), 72 ° C für 5 min und Halt bei 4 ° C.
      Hinweis: Das PCR-Produkt kann bei 4 ° C für weniger als eine Woche oder bei-20 ° C/-80 ° C für bis zu 6 Monate gespeichert werden.
3. PCR-Reinigung.
   1. Jede Probe 25 μL neu suspendierten DNA Reinigung Perlen (1 X) aus dem vorherigen Schritt und die Mischung gut durch Wirbel hinzufügen. Dann schnell Drehen des Rohres oder Platten bei Raumtemperatur zu sammeln die Flüssigkeit aber vermeiden die Ansiedlung von Perlen.
      Hinweis: Equilibrate DNA Reinigung Perlen auf Raumtemperatur für 15 min und Vortex gründlich vor der Anwendung.
   2. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Ort der Röhre oder Platte auf eine entsprechende magnetische stehen, bis die Lösung klar ist, dann sorgfältig entfernen und entsorgen den überstand.
   4. Fügen Sie 200 μL von frisch zubereiteten 80 % Ethanol, waschen Sie die Perlen in die Magnetstativ, inkubieren Sie für 30 s, dann vorsichtig entfernen und entsorgen Sie die Ethanol-Lösung.
      Hinweis: Die 80 % (Vol/Vol) Ethanol-Lösung sollte frisch jedes Mal vorbereitet werden.
   5. Wiederholen Sie Schritt 5.3.4 für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.
   6. Sorgfältig entfernen und entsorgen Sie die restlichen Ethanol-Lösung und Luft trocknen die Perlen und die Röhre oder Platte ist auf dem magnetischen Stand.
      Hinweis: Vermeiden Sie übermäßig trocknen die Kugeln, um die maximale Elution Effizienz zu gewährleisten.
   7. Fügen Sie 11 μL der Nuklease-freies Wasser zu eluieren DNA Ziel von Perlen und mischen Sie gut durch Wirbel. Dann schnell drehen Sie des Rohres oder Teller und legen Sie es auf einem Magnetstativ, bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie 10 μl der Probe auf eine neue PCR-Rohr.
      Hinweis: Nach der Reinigung, Verteilung Formaterkennung cDNA anhand einer einzigen Runde gäbe es Dimere reinigen Sie wieder um die dimere vollständig zu entfernen. Die dimere können die cDNA Ertragsberechnung beeinflussen, wenn erlaubt, in die Stichprobe zu bleiben.
4. Qualitäts-Check der cDNA.
   1. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip Proben, die cDNA Gesamtausbeute mit einem Fluorometer zu erkennen.
   2. Bewerten Sie die Marker-Gen Ausdruck Niveaus durch Echtzeit-PCR (qPCR) (Abb. 4E). 1 μl der Probe zu verdünnen 40mal und 384-Well-Platte mit qPCR durchführen zu entfernen. Bereiten Sie den qPCR-Mix, wie in Tabelle 3beschrieben. Radsport-Bedingungen: 95 ° C für 10 min, 45 Zyklen (95 ° C für 10 s, 60 ° C für 15 s, 72 ° C für 15 s).
   3. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip Proben, die Größenverteilung mit einem parallelen Kapillarelektrophorese Instrument zu erkennen.

(6) cDNA Bibliotheksbau

1. Tagmentation Reaktion von Tn5 Transposase.
   1. Die cDNA Gesamtausbeute qPCR-ausgewählte Zellen aus Schritt mit einem Fluorometer 5.4.2 zu erkennen. Verwenden Sie 2 ng cDNA als Ausgangsmaterial.
   2. Die Tagmentation Reaktion Reagenzien (Tabelle 4) auf dem Eis Auftauen.
   3. Bereiten Sie die Tagmentation Reaktion in einem 0,2 mL Dünnwand-8-Streifen PCR-Röhrchen, wie in Tabelle 4, beschrieben und durch Wirbel vermengen Sie vorsichtig. Dann schnell spin-down der Lösung bei Raumtemperatur.
   4. Die Proben bei 55 ° C für 10 min inkubieren und bei 4 ° c zu halten
   5. Fügen Sie 2 μL 5 X TS sofort jede Probe mit der Tagmented DNA, um die Reaktion zu stoppen hinzu. Durch Wirbel vorsichtig umrühren und dann schnell spin-down der Lösung bei Raumtemperatur.
   6. Inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur. Die DNA sollte für die endgültige Bereicherung PCR sofort verarbeitet werden.
2. Verstärkung der Adapter ligiert Fragmente.
   1. Die PCR Reagenzien (Tabelle 5) auf dem Eis Auftauen.
   2. Bereiten Sie die Anreicherung PCR Mischung, wie in Tabelle 5, beschrieben zu und mischen Sie sorgfältig durch Wirbel. Dann schnell spin-down der Lösung bei Raumtemperatur.
   3. Die PCR mit das folgende Programm ausführen: 72 ° C für 10 min, 98 ° C für 30 s, 8 Zyklen (98 ° C für 15 s, 60 ° C für 30 s, 72 ° C für 3 min), 72 ° C für 5 min und Halt bei 4 ° C.
      Hinweis: Die Anzahl der Zyklen richtet sich nach der erwarteten Bibliothek DNA-Menge.
3. PCR-Reinigung mit Größenauswahl.
   1. Jede Probe 14 μL neu suspendierten DNA Reinigung Perlen (0,7 X) aus dem vorherigen Schritt und die Mischung gut durch Wirbel hinzufügen. Dann drehen Sie schnell das Rohr bei Raumtemperatur zu sammeln die Flüssigkeit aber vermeiden die Ansiedlung von Perlen.
      Hinweis: Equilibrate DNA Reinigung Perlen auf Raumtemperatur für 15 min und Vortex gründlich vor der Anwendung.
   2. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Legen Sie das Rohr auf eine entsprechende Magnetstativ, bis die Lösung klar ist, sorgfältig übertragen des Überstands zu einem neuen Schlauch Streifen und entsorgen den vorherigen Röhre Streifen.
   4. Fügen Sie 3 μL neu suspendierten DNA Reinigung Perlen (0,15 X) zu jeder Probe in der Röhre Streifen und die Mischung gut durch Wirbel. Dann drehen Sie schnell das Rohr bei Raumtemperatur.
   5. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   6. Ort der Röhre oder Platte auf eine entsprechende magnetische stehen, bis die Lösung klar ist, dann sorgfältig entfernen und entsorgen den überstand.
   7. Fügen Sie 200 μL von frisch zubereiteten 80 % Ethanol, waschen Sie die Perlen in die Magnetstativ, inkubieren Sie für 30 s, dann vorsichtig entfernen und entsorgen Sie die Ethanol-Lösung.
      Hinweis: Die 80 % (Vol/Vol) Ethanol-Lösung sollte frisch jedes Mal vorbereitet werden.
   8. Wiederholen Sie Schritt 6.3.7 für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.
   9. Sorgfältig entfernen und entsorgen Sie die restlichen Ethanol-Lösung und Luft trocknen die Perlen und die Röhre oder Platte ist auf dem magnetischen Stand.
      Hinweis: Vermeiden Sie übermäßig trocknen die Kugeln, um die maximale Elution Effizienz zu gewährleisten.
   10. Fügen Sie 11 μL der Nuklease-freies Wasser zu eluieren DNA Ziel von Perlen und mischen Sie gut durch Wirbel. Dann schnell drehen Sie des Rohres oder Teller und legen Sie es auf einem Magnetstativ, bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie 10 μl der Probe auf einem neuen Schlauch Streifen.
4. Qualitäts-Check der endgültigen cDNA-Bibliothek.
   1. Messen Sie die Konzentration von jeder Bibliothek mit einem Fluorometer und prüfen Sie die Größenverteilung mit einem parallelen Kapillarelektrophorese-Instrument.
      Hinweis: Die DNA-Ausbeute ist in der Regel zwischen 15 – 25 ng für jede Bibliothek. Die Fragmente von 250 bp auf 450 bp beobachtet werden. Wenn Dimere nach der Reinigung, bleiben wie die Verteilung Überprüfung bestätigt, mit 1 x DNA Reinigung Perlen noch einmal zu reinigen.
5. Pooling-Bibliothek
   1. Basierend auf die ungefähre Fragmentgröße Pool gleiche Mengen von DNA von jeder Probe, um sicherzustellen, dass keiner von ihnen die gleichen Kombinationen von N6XX und N8XX-Adapter enthalten.

(7) DNA-Sequenzierung

1. Fachbibliotheken Barcode zu 51 bp Einend-Sequenzierung mit einem Hochdurchsatz-Sequenzierung System. Führen Sie die Sequenzierung nach der Hersteller-Protokolls. Die Sequenzierung Tiefe jeder Zelle beträgt etwa 1 Million im Durchschnitt⁸, liest mindestens 0,5 Millionen pro Zelle¹⁴liest.

(8) Bioinformatik-Analysen

1. Sequenzierung Qualitätsbewertung und Ausrichtung.
   1. Bewertung der Qualität der sequenzielle Lesevorgänge mit FastQC (v0.11.3)¹⁵ mit den folgenden Parametern: "Fastqc - Extrakt -o Output_dir Input_fastq".
   2. Zusammenführen der Maus Genom mit dem ERCC-Sequenzen mit dem Befehl "cat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
   3. Bowtie2 zu bauen (v2.2.5)¹⁶ Index mit den folgenden Parametern: "bowtie2-Build mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
   4. Richten Sie liest mit tophat2 (v2.1.0)¹⁷ mit den folgenden Parametern: "tophat2 -o Output_dir -G gene.gtf--Transkriptom-Index Trans_index mm10_ERCC Input_fastq".
2. Gen Ausdruck Niveaus zu quantifizieren.
   1. Graf abgebildet liest für jedes Gen mit HTSeq (V 0.6.0)¹⁸ mit den folgenden Parametern: '' Htseq-Count - f Bam - R pos -s keine - ein 30 accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt''.
   2. Normalisieren Sie die Gen Ausdruck Ebenen Transkripte pro million (TPM)¹⁹.
3. Qualitätskontrolle der Zellen.
   1. Zellen mit weniger als 0,5 Millionen zugeordneten liest oder weniger als 4.000 Gene auszuschließen (TPM > 1).
      Hinweis: das Kriterium der Ausgrenzung richtet sich nach der Zelltypen und Sequenz Tiefe.
   2. Behalten Sie mit dem Ausdruck endokrine Marker (z. B. Ins1 für β-Zellen, Gcg für α-Zellen) Zellen und schließen Sie Zellen mit dem Ausdruck nicht endokrine Marker (z. B. Spi1 für Leukozyten aus).
4. Hauptkomponentenanalyse (PCA)
   1. Hochvariablen Gene nach ERCC Spike-ins, wie zuvor beschrieben²⁰zu identifizieren.
   2. Führen Sie mithilfe der Funktion "PCA" in der R FactoMineR (v1.31.4)²¹, Paket mit PCA log2(TPM + 0.1) hochvariablen Gene.
   3. Visualisieren der PCA-Ergebnisse mit ggplot2 (v2.0.0)²².
5. Hierarchische Cluster.
   1. Identifizieren Sie mit den höchsten Hauptkomponente (PC) Belastungen, die mit der Funktion "Dimdesc" FactoMineR (v1.31.4)²¹Gene.
   2. Führen Sie hierarchische Cluster mithilfe der Funktion "heatmap.2" in der R-Paket Gplots (v3.0.1)²³, mit log2 (TPM + 1) relative Werte des hohen PC laden Gene.

Results

Bauchspeicheldrüsen von embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Mäusen seziert wurden (Abbildung 2A und 2 b). Für Mäuse älter als postnatale 18.Tag hängt die verdauungsfördernde Wirkung vom Grad der Durchblutung; die Injektion ist daher der wichtigste Schritt zur Insel Isolierung (Abbildung 2-2E und Tabelle 6). Wie viel Kollagenase injiziert wurde, da die Bauc...

Discussion

In diesem Protokoll haben wir eine effektive und einfach zu bedienende Methode zur Untersuchung der einzelligen expressionsprofile von pankreatischer β-Zellen gezeigt. Mit dieser Methode konnte, endokrine Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und einzellige transkriptomischen Analysen durchzuführen.

Die wichtigste Schritt ist die Isolierung der einzelnen β-Zellen in gutem Zustand. Voll PERFUNDIERTEN Bauchspeicheldrüsen reagieren besser auf nachfo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kollagenase P	Roche	11213873001
Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	25200114
Fötales Rinderserum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Dumont #4 Pinzette	Roboz	RS-4904
Dumont #5 Pinzette	Roboz	RS-5058
30 G BD Nadel 1/2" Länge	BD	305106
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi DV4
Stereo-Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	Stereo Lumar V12
Zentrifuge	Eppendorf	5810R
Zentrifuge	Eppendorf	5424R
Polystyrol Rundbodenrohr mit Zellsiebkappe	BD-Falcon	352235
96-Well-PCR-Mikroplatte	Axygen	PCR-96-C
Silikon-Dichtungsmatte	Axygen	AM-96-PCR-RD
Dünnwell-PCR-Röhrchen	Extragene	P-02X8-CF
Zellsortierer	BD Biosciences	BD FACSAria
Kapillarpipette	Sutter	B100-58-10
RNaseZap	Ambion	AM9780
ERCC-RNA-Spike-In-Mix	Life Technologies	4456740
Destilliertes Wasser	Gibco	10977
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
dNTP-Mix	New England Biolabs	N0447
Rekombinanter RNase-Inhibitor	Takara	2313
Hochgestellte II-Reverse-Transkriptase	Invitrogen	18064-014
Erststrangpuffer (5x)	Invitrogen	18064-014
DTT	Invitrogen	18064-014
Betain	Sigma-Aldrich	107-43-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Nukleasefreies Wasser	Invitrogen	AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)	KAPA Biosystems	KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads	Vazyme	N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 für Illumina	Vazyme	TD502	Enthält 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 für Illumina	Vazyme	TD203	Enthält 16 N6XX und 24 N8XX
Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit	Fortschrittliche Analysetechnologien	DNF-474
1x HBSS ohne Ca2+ und Mg2+			138 mM NaCl; 5,34 mM KCl 4,17 mM NaHCO3; 0,34 mM Na2HPO4 0,44 mM KH2PO4
Isolationspuffer			1 × HBSS mit 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glukose, pH 7,4
FACS-Puffer			1 & mal; HBSS mit 15 mM HEPES, 5,6 mM Glucose, 1 % FBS, pH 7,4
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich	G5767
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Oligo-dT30VN Primer			5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO
			5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR
Primer			5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward Primer			5'-ATGGTGAAGC GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse Primer			5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Vorne Primer			5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse Primer			5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'