Methodenartikel

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

DOI:

10.3791/58001

⸱

30. Juni 2018

 ,  , 
1Virus Research & Development Laboratory, Statens Serum Institut, 2Infectious Disease Research Unit, University of Southern Denmark

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die schnelle Virus Nukleinsäure-Extraktion aus der Vollblut-Virus inaktiviert. Die Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom. Die Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und kann überall (z.B.in Feldlazaretten) verwendet.

Zusammenfassung

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Die schnelle Diagnose einer Infektion ist entscheidend für den Ausbruch Management, Risiko Containment und Patientenversorgung. Wir haben zuvor eine Methode für die schnelle am Krankenbett Inaktivierung des Ebola-Virus während der Blutentnahme für sichere Nukleinsäure (NA) Tests gezeigt, indem man einen kommerziellen Lyse/Bindung Puffer direkt in das Vakuum Blutentnahmeröhrchen. Mit diesem Ansatz am Krankenbett Inaktivierung, entwickelten wir eine sichere, schnelle und vereinfachte am Krankenbett NA Extraktionsmethode für die spätere Entdeckung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die NA-Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom.

Nachdem das Blut in den Lyse/Bindung Puffer gesammelt, die Inhalte werden durch Umklappen das Rohr von hand gemischt und die Mischung wird für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Magnetische Glaspartikeln (Map) werden hinzugefügt, um das Rohr, und der Inhalt sind durch Umklappen das sammelröhrchen von hand gemischt. Die Map werden dann auf der Seite das blutsammelröhrchen mit einem Magnethalter oder ein Magnet und ein Gummiband gesammelt. Die Map werden dreimal gewaschen, und nach der Zugabe der Elution Puffer direkt in das sammelröhrchen, die NAs sind bereit für NA-Tests, wie qPCR oder Isothermen Schleife Verstärkung (Lampe), ohne die Entfernung von der Map aus der Reaktion. Die NA-Extraktions-Verfahren ist nicht abhängig von jedem Laboreinrichtungen und lässt sich problemlos überall (z.B.in Feldlazaretten und Krankenhaus Isolierstationen) verwendet. Wenn diese NA-Extraktions-Verfahren mit Lampe und ein tragbares Gerät kombiniert wird, erhalten Sie eine Diagnose innerhalb von 40 Minuten die Blutentnahme.

Einleitung

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In Virus Ausbruch Situationen wenn Patienten auf das Krankenhaus Isolierstationen oder wenn eine schnelle Diagnose benötigt wird beschränkt sind, ist eine sichere, einfache und genaue Molekulare Diagnostik der Point-of-Care unerlässlich, dass die Patienten Pflege und Risiko Containment. Die zwei jüngsten virale Ausbrüche, das Ebola-Virus (EBOV) in Westafrika (2013) und der Zika-Virus in Südamerika (2015), haben das Interesse an verbesserte Point-of-Care Molekulare diagnostische Tests, wie z. B. reverse Transkription Schleife-vermittelten Isothermen erhöht. Verstärkung (RT-Lampe)1,2 und Rekombinase Polymerase Verstärkung (RPA)3,4. RT-Lampe und RPA sind schnelle, sensitive und spezifische Molekulare Tests, die auf vereinfachtes Beispiel Vorbereitungen durchgeführt werden können. Für das Zika-Virus wurde RT-Lampe mit einem lateralflow-Assay (LFA), kombiniert die Zika-Virus in Vollblut-gereinigte Proben innerhalb von 30 min1erkennen kann; für EBOV, das ist ein Risiko-Gruppe 4-Pathogen eingestuft und ist hoch ansteckend, die Proben müssen jedoch unter Biosafety behandelt werden Stufe 4 (BSL-4) Bedingungen und inaktiviert werden, bevor eine sichere diagnostischen Verfahren durchgeführt werden können.

Vereinfachte Inaktivierungsverfahren für EBOV, wie die Zugabe von Lyse Puffer auf die Probe2,3,4,5, dienten während des Ausbruchs; Diese Methoden erfordern jedoch Handhabung BSL-4 Bedingungen mit Laborgeräten, wie BSL-3 Biosafety Schränke, Zentrifugen, Heizblöcke und Pipetten, auf ein Minimum. Dieses Gerät ist normalerweise nicht vorhanden, Isolierstationen oder in Feldlazaretten. Um diese Herausforderung zu meistern, wurden Versuche unternommen, im Koffer3Diagnostik durchzuführen, und mehrere tragbare Geräte und Maschinen wurden entwickelt [z. B.ein tragbares Gerät zur Gewinnung von Nukleinsäure (NA)]6. EBOV-positiven Proben müssen jedoch noch inaktiviert werden, bevor diese Geräte verwendet werden können.

Wir haben zuvor eine schnelle am Krankenbett Virus-Inaktivierung-Methode zur EBOV7, Vaccinia Virus und Kuhpocken-Virus8 durch Zugabe eines kommerziellen Lyse/Bindung-Puffers zu gewöhnlichen Vakuum Blutentnahmeröhrchen, berichtet ermöglicht den direkten Übertragung von Blut aus dem Patienten in die Inaktivierung Puffer7. Diese direkte und sofortige Inaktivierung in einem geschlossenen System eliminiert die Notwendigkeit für die Proben unter Verwendung strikte Einschließung, z. B. BSL-4 Bedingungen7, Handhabung und die Proben können unter Normalbedingungen BSL-2 behandelt werden. Diese Inaktivierung Methode ist kompatibel mit mehreren NA Absauganlagen, wie Roboter und Hand-Reinigung-Kits-7; Diese Methoden erfordern jedoch Laborgeräte wie Roboter, Zentrifugen und Elektrizität, die nicht immer in den Bereich Einstellungen oder im Krankenhaus Isolierstationen vorhanden sind.

In diesem Bericht beschreiben wir eine sichere, schnelle und vereinfachte manuelle NA Extraktionsmethode für die anschließende molekulare Erkennung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die NA-Extraktions-Verfahren erfordert keine Geräte außer einem Magnet/Magnethalter. Für die NA-Extraktion werden keine Zentrifugen, Heizung, Blöcke oder Strom benötigt. Daher, diese Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und lässt sich problemlos überall (z.B.in Feldlazaretten in Isolation Krankenstationen oder mit geringen Ressourcen Einstellungen) verwendet. Die NA-Extraktions-Verfahren ist schnell und einfach und kann direkt in alle nachgelagerten NA-Tests wie qPCR, RT-qPCR, Lampe oder RT-Lampe verwendet werden. Wenn diese NA-Extraktions-Verfahren mit Lampe und ein tragbares batteriebetriebenes Isothermen Instrument kombiniert wird, erhalten Sie eine Nachttisch Diagnose innerhalb von 40 Minuten die Blutentnahme.

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Protokoll

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Der Ausschuss für biomedizinische Forschungsethik, Hauptstadtregion Einwilligung gegeben hat, und alle hier beschriebene Verfahren befreit aus einer Überprüfung durch die Ethik-Ausschuß-System gemäß dem dänischen Gesetz über Assay-Entwicklung-Projekte.

1. Vorbereitung des Vakuum Blutentnahmeröhrchen für Virus-Inaktivierung und schnellen NA-Extraktion

Achtung: Der Puffer verwendet für dieses Protokoll enthält Guanidinium-Thiocyanat (GITC) und nichtionischen Tensiden, die Reizstoffe sind. In geeigneten Laboratorien Schutzmaßnahmen ergreifen, verwenden eine Fluss-Haube und Handschuhe beim Umgang. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt. Wenn der Puffer verschüttet ist, muss die zu reinigende Oberfläche nie direkt mit Chloramin oder Natriumhypochlorit (die Wirkstoffe in "Bleach") desinfiziert werden, da diese Mischung zu der Bildung von toxischen Zyanid führen kann. Erstens die verschüttete Puffer mit einem saugfähigen Tuch aufwischen. Anschließend reinigen Sie die Oberfläche mit 70 % Ethanol und dann mit Wasser und schließlich Chloramin oder Natriumhypochlorit.

  1. Um das Vakuum Blutentnahmeröhrchen vorzubereiten, injizieren Sie 1,6 mL des Puffers bestimmten kommerziellen Lyse in einer Vakuumröhre 4 mL EDTA durch Punktion des Deckels des Röhrchens mit einer 25 x 1 Nadel und einer Spritze 3 mL.
    Hinweis: Nehmen Sie nicht den Deckel von der Vakuum-Röhre. Das Vakuum muss eingehalten werden.
  2. Die Vakuum-Röhren, enthält des Puffers bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung zu speichern.
    Hinweis: Die Rohre sind für mindestens 1 Jahr nach ihrer Herstellung stabiler.

2. Vorbereitung der Puffer für die NA-Extraktion

  1. Die Puffer für eine NA-Extraktion, Platz zwei 1,8 mL, zwei 4,5 mL und einem 3,6 mL Röhrchen in einem Rack vorzubereiten.
  2. Durch pipettieren, 960 µL des magnetischen Glaspartikeln (Map) eine saubere 1,8 mL Tube und Label mit Map. Aufschwemmen die MGP-Aufhängung komplett vor pipettieren sie hinzufügen.
    Hinweis: Die Map neigen dazu, schnell an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
  3. Fügen Sie durch pipettieren, 4 mL Waschpuffer ich zu einem sauberen 4,5 mL Schlauch und beschriften Sie sie als WB-1.
    Achtung: Waschpuffer I enthält Guanidinium Chlorid, das reizend ist. In geeigneten Laboratorien Schutzmaßnahmen ergreifen, verwenden eine Fluss-Haube und Handschuhe beim Umgang. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt.
  4. Hinzufügen von pipettieren, 1,5 mL Waschpuffer II zu einem sauberen 3,6 mL Schlauch und bezeichnen es als WB-2.
  5. Hinzufügen von pipettieren, 3 mL Waschpuffer III zu einem sauberen 4,5 mL Schlauch und bezeichnen es als WB-3.
  6. Fügen Sie durch pipettieren, 100 µL der Elution Puffer, um eine saubere 1,8 mL-Tube und beschriften Sie sie als EB.
  7. Die regelmäñig Puffer bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung zu speichern.
    Hinweis: Die Rohre sind für mindestens 1 Monat nach ihrer Herstellung stabiler.

3. Blutentnahme von Patienten mit Anzeichen und Symptome einer Virusinfektion

Achtung: Ergreifen Sie in geeigneten Laboratorien Schutzmaßnahmen, wenn Vollblut des Patienten zu sammeln. Tragen Sie Handschuhe und Brille. Wenn der Patient isoliert ist, folgen Sie bitte Biosafety Niveau 4 Verfahren.

  1. Um intravenöse Vollblut des Patienten zu sammeln, verwenden Sie eine Butterfly-Nadel mit KK Verlängerungsschlauch und einer Blut Sammlung Vakuumröhre, Lyse/Bindung Puffer enthält. Den Arm des Patienten in eine nach unten gerichtete Position ausruhen und dem Sammelrohr niedriger als der Butterfly-Nadel zu positionieren. Schmetterling Nadel in die Vene des Patienten und die KK-Erweiterung der Blut-Sammlung-Vakuum-Röhre beimessen.
    Hinweis: Dies verhindert Rückfluss.
  2. Mischen Sie nach der Blutentnahme den Inhalt des Röhrchens durch Umklappen der Röhre 5 - 10 mal.
    Hinweis: Durch den restlichen Unterdruck in dem Blut Sammelrohr, 1,6 mL Lyse/Bindung Puffer enthält, wird das Volumen der Probe erfasst automatisch 1,6 mL sein.
  3. Desinfizieren Sie die Außenseite des Schlauches mit 70 % Ethanol.
  4. Inkubieren Sie die Rohre für 20 min bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und die volle Blutentnahmeröhrchen können bei-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C und 37 ° C für mindestens 1 Monat7gelagert werden.
  5. Weiterhin die vereinfachte NA-Extraktions-Verfahren.

4. vereinfachte NA Extraktion des Vollblutes

  1. NA aus dem Lyse/Bindung Puffer-inaktivierten gesammelten Blut, Mischung zu reinigen Rohr den Inhalt des Röhrchens durch Umlegen des Vakuums von hand 5-10 X.
  2. Entfernen Sie vorsichtig den Deckel des Rohres und Entladen Sie den Deckel zu.
  3. Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten Map (1 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.
  4. Legen Sie einen neuen Deckel aus einer ungenutzten Blut Sammelrohr auf das Rohr mit der Probe.
  5. Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist und den Inhalt des Rohres durch Umklappen das blutsammelröhrchen 5-10 mal von hand mischen.
  6. Legen Sie das Rohr in den Magnet Holder und halten Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.
  7. Flip-Magnethalter mit dem Rohr ein paar Mal von Hand um sicherzustellen, dass die Map auf der Seite des Rohres mit dem Magneten gesammelt werden.
    Hinweis: Der Magnethalter kann mit einem länglichen Magneten und einem Gummiband ersetzt werden.
  8. Entfernen Sie den Deckel des Rohres und verwerfen Sie den Inhalt des Rohres mit einer Einweg-Pipette oder einfach durch Gießen den Inhalt in ein Sammelrohr 50 mL.
    Hinweis: Vermeiden Sie Aerosole aus dem Sammelrohr 50 mL durch das Rohr mit einem Deckel schließen.
  9. Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten von WB-1 (4 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.
  10. Setzen Sie den Deckel auf die Tube und legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.
  11. Entfernen Sie das Rohr aus der Magnethalter, dabei den Deckel fest angezogen mit einem Finger.
    Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube.
  12. Die Map durch Umklappen das blutsammelröhrchen eigenhändig 5-10mal aufzuwirbeln.
  13. Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.8.
  14. Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten WB-2 (1,5 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.
  15. Setzen Sie den Deckel auf das Rohr und entfernen Sie das Rohr aus der magnetischen Halterung zu.
    Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube.
  16. Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.
  17. Aufschwemmen der Map durch Umklappen das blutsammelröhrchen für ein paar Sekunden von hand.
  18. Wiederholen Sie Schritt 4.6-4.8.
  19. Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten von WB-3 (3 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.
  20. Setzen Sie den Deckel auf das Rohr und entfernen Sie das Rohr aus der magnetischen Halterung zu.
    Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube.
  21. Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.
  22. Die Map durch Umklappen das blutsammelröhrchen eigenhändig 5-10mal aufzuwirbeln.
  23. Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.8.
  24. Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten EB (100 µL) direkt in das blutsammelröhrchen.
  25. Setzen Sie den Deckel auf das Rohr und entfernen Sie das Rohr aus der magnetischen Halterung zu.
    Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube.
  26. Aufschwemmen der Map in der EB durch das blutsammelröhrchen 5-10 mal mit dem Finger antippen.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten, und die Rohre können bei-20 ° c gelagert werden
  27. Übertragen Sie einen Tropfen (5-8 µL) der resuspendierte Map in den nachgelagerten NA Verstärkung Reaktion Mix mit einer Einweg-1,5 mL-Pipette (keine nachgeschalteten diagnostische NA Verstärkung assay wie RT-Lampe oder qPCR/RT-qPCR-Assays verwendet werden können).
    Hinweis: Das NAs wird halten Sie sich an die Map, so sicher sein, verwenden Sie die Map in der nachgelagerten NA Verstärkung Reaktion. Mischen Sie die MGP Suspension vor dem Gebrauch. Nach dem Mischen werden die Map an der Unterseite des Rohres sammeln.

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Ergebnisse

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Die hier vorgestellten Protokoll ist einfach und effizient und kann auch im großen und ganzen auf eine molekulare Assay auf infektiöse Vollblut Proben mit dem Puffer Lyse/Bindung inaktiviert durchgeführt werden. Der Workflow für die Inaktivierung von Blut und NA-Extraktion ist in Abbildung 1, einschließlich der Vorbereitung von Blut Sammlung Vakuumröhren7 (Abbildung 1A), die Blut Sammlung...

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Diskussion

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In diesem Bericht beschreiben wir eine sichere, schnelle und einfache manuelle am Krankenbett NA Extraktionsmethode für die nachgelagerten molekulare Erkennung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die beschriebenen NA-Extraktions-Verfahren wurde entwickelt, um direkt auf Vollblut-Proben im Vakuum Blutentnahmeröhrchen, enthält die Lyse/Bindung Puffer (Table of Materials)7durchgeführt werden. Dieser spezielle Puffer inaktiviert EBOV7 und i...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Wir danken Susanne Lopes Rasmussen und Solvej Kolbjørn Jensen für ihre technische Unterstützung und für den Umgang mit der klinischen Proben. Dieses Projekt ist Teil des Konsortiums EbolaMoDRAD, die Mittel aus der innovativen Medizin Initiative 2 gemeinsamen Unternehmens unter Grant Vereinbarung N ° 115843 erhalten hat. Dieses gemeinsame Unternehmen erhält Unterstützung von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm und EFPIA.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Vacutainer K2 EDTA-Röhrchen (4 mL)Becton Dickinson368861
Plus BlutentnahmeBecton Dickinson362725
23G x 1 NadelBecton Dickinson300800
LUER LOK Spritze (3 mL)Becton Dickinson309658
Butterfly-Nadel mit Verlängerungsschlauch mit kleinem DurchmesserJø rgen Kruuse A/S121714
1% VirkonNomeco A/S849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lyse-/Bindungspuffer - NachfüllpackungRoche Diagnostics A/S03246752001
MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation KitRoche Diagnostics A/S3038505001
Kryo-Röhrchen für Biobanken und Zellkulturen (1,8 mL)Thermo Fisher Scientific375418
Deutschland Kryo-Röhrchen für Biobanken und Zellkulturen (3,6 mL)Thermo Fisher Scientific379189
Deutschland Kryo-Röhrchen für Biobanken und Zellkulturen (4,5 mL)Thermo Fisher Scientific379146
DynaMag™-5 MagnetThermo Fisher Scientific12303D
Transferpipette (3,5 mL)Sarstedt86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco&Handel; Transferpipetten mit feiner Spitze (1,5 ml)Thermo Fisher Scientific231
Thermo Scientific™ Nunc&Handel; 50 mL konische sterile Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenThermo Fisher Scientific339652

Referenzen

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