Summary
このプロトコルは、バーンズ迷路を使用して記憶・学習能を測定します。新たな乙女の苦痛パラダイムは、自発運動量とマウスにおける向社会的行動を評価するために使用されます。
Abstract
バーンズ迷路は、空間的な学習と食餌制限または非常にストレス刺激への暴露を必要としないメモリの信頼性の高い尺度です。バーンズ迷路迷路のプラットフォームと探索行動から脱出する一般的な動機などの他のマウス動作を評価することも。バーンズ迷路は、遺伝子の突然変異であるかどうかを測定できる環境変数が取得及び空間記憶の保持に影響を与えると同様またはマウスで採用されている検索方法に関する情報を提供します。ここでバーンズ迷路を使用して単一発達エタノールの露出イベント アダルト マウスのメモリの赤字を検出します。新しく記述された乙女の苦痛のパラダイムは、アリーナのオープン センター フィールドで商工会議所の中に閉じ込めて雌マウスに男性マウスを公開します。それは社会的に閉じ込められた女性への対応、向社会的行動を示すマウスのための機会を提供します。新規アリーナとメジャーの自発運動のマウスの動作を調べるため乙女の苦痛パラダイムを使用もできます。バーンズ迷路と乙女の苦痛のプロトコルの両方で必要最小限の金融投資と共通の実験用品からテストの大部分を構築できます。これらのツールの柔軟性とアクセスは、開発の過程での行動の変化を検出するも使用できます。
Introduction
このプロトコルの目的は、バーンズ迷路と同様の社会的応答と乙女の苦痛のパラダイムを使用して歩行を用いたマウスの記憶・学習能を測定することです。齧歯動物などマルチ スポークの装置の 1 つの腕で隠された食品を見つけるためにマウスの能力を測定する放射状迷路モリス水迷路は、大きな浴槽やプールの水、マウスの空間学習・記憶テストを用い、隠された水中プラットフォームを見つける時間を評価します。通常、これらのパラダイムのための訓練は複数の試験にまたがるし、両方の測定を可能集録速度や保存期間を短期的および長期的なメモリ試験を学習します。
放射状迷路とモリス水迷路は齧歯動物でメモリをテストするための信頼性の高い方法であるが、一部の研究者の合併症を呈する。両方の迷路は、補強1として剥奪や強い嫌悪刺激を使用します。放射状迷路は、齧歯動物の食糧報酬を見つける、適切に動機づけを確実に絶食を使用します。モリス水迷路の中で強制水泳による応力の効果はマウス2で結果を変更できます。
バーンズ迷路は、明るく、開いている迷路表面3を脱出するために穴の位置を学ぶための齧歯動物を必要とする代替の空間認識タスクです。マウスがプラットフォームからの脱出の可能性を高めるに弱い嫌悪刺激 (光や音) が適用されます。バーンズ迷路は、絶食を必要としない ― 動物の準備の量はより放射状迷路。動作や食事、ホルモン調節、または視床下部経路に関連付けられている分子を調査する研究者によって、競合することがなく使用できます。
バーンズ迷路は、モリス水迷路上の利点もあります。モリス水迷路、マウス4コルチコステロンのより高いレベルを引き起こしているよりもストレスが少ないです。また、それを組み立てるためにはるかに簡単で、テスト プロシージャとストレージの間に以下の専用領域が必要です。
乙女の苦痛のアッセイは、向社会的行動が続く運動を評価することが簡単な 2 つの部分実験です。乙女の苦痛のアッセイは、探索行動と内包された女性齧歯類に応えて男性齧歯動物の社会的応答性を評価するために設計されています。社会性 (と同様社会の目新しさのための好み) を評価するために一般的に使用されるメソッドの近くや他のマウス5から離れて時間を過ごすマウスの自由な選択を評価するクローリーの 3 商工会議所社交性テストの使用であります。
クローリーの 3 商工会議所社交性テストと同様に、苦痛の乙女アッセイも別のマウスの存在下で時間を費やすことについて自由に選択を測定しますが、また社会的機能のより深い側面の測定を提供します: 1) で、乙女の苦痛の試金、オープン フィールドに男性の潜在的な嫌悪感が社会的探索または同種の苦しめられた女性を調査する彼のドライブに対してピットインされてので、閉じ込められた雌マウスはオープン フィールドの中心に開催されます。2) 苦痛の乙女のモデルは、マウスで頻繁に探索されていないトラップのマウスへの応答で共感および向社会的行動パターンを評価する方法を提供します。
動物の共感は間違いなく観測と測定可能なこの目的のためのない多くのパラダイムが存在します。たとえば、ラット、捕獲おりの仲間は、ラットが閉じ込められた動物を解放していく、向社会的行動のモチベーションの状態を引き起こすことができます。実際、ラットはチョコレート スナックを含む類似のコンテナーを開く前にも閉じ込められた動物を支援するを選択し、チョコレートにアクセスし、新たに解放されたラット6と共有します。
マウスにおける共感性の対策で通常は極度の痛みの実際、痛みの他のマウスを見てマウス、7、8自体の痛みに敏感。拘束応力は齧歯動物に特徴づけられる現象で、ショック マウス9,10に共感の一つとしてストレス反応を調べると結合されています。
ストレスを誘発する選択肢が必要なので、誘発される痛みやショックに関連付けられている倫理的な考慮事項があります。痛みやショック治療の不在で共感行動の尺度として苦痛の乙女パラダイムを開発しました。私達の苦痛の乙女のプロトコルに閉じ込められたマウスは、彼らは小さな容器内を好転させることができないまだ彼らはその苦痛に対応する他のマウスのための機会を提供しながら無傷だけいくつかの瞬間後苦痛の明白な徴候を表示します。
乙女の苦痛の評価を開始するには、雄マウスは小さな空中央のシリンダーを含む大規模な新規アリーナに配置されます。アリーナのどのように多くのセクションを交差しているし、中央のオープン エリアで費やされているどのくらいの時間を含むいくつかの分の探索行動が記録されます。このメソッドは、正常に完了の協調運動が必要な学習状況の潜在的な交絡因子として運動障害を除外するための迅速かつ簡単な方法を提供します。また、オープンのセンター フィールドにどのくらい嫌悪感が存在の基本的な指標を提供します。両方の措置はバーンズ迷路パフォーマンスに影響可能性があります。
初期の探査の後、男性がアリーナから削除され雌マウスは、囲まれた、小さい明確な中央のシリンダー (マウスから血を収集するために使用に似ています) に配置されます。元の雄マウスは、アリーナに再導入し、探索行動を再び獲得しました。乙女の苦痛パラダイム マウス (のセンター広場で、掘りエピソードの数時間で得点)、閉じ込められた女性が存在する場合、かどうか行動パターンの変更に基づく社会的相互作用に興味があるかどうかを評価する、マウスの展示 (シリンダー調査と閉じ込められた女性と接触イベントの量で得点) 閉じ込められた女性に向けて向社会的行動。乙女の苦痛の試金を使用して、研究者が馴染み深く、新しいマウスをトラップするかどうかに応じて (クローリーの 3 商工会議所社交性テストに類似) 社会の目新しさのための傾向を測定できます。
一緒に、バーンズ迷路と乙女の苦痛実験マウスの正確な評価学習能力と社会的な反応で許可非常にストレスの刺激の欠如。すべての行動実験と同様これらの実験は動物によって経験される不快感を最小限に抑え、動物の経験に向けて素晴らしい感度で行わなければなりません。
ほとんどの迷路のような自発運動の違いに影響を及ぼすバーンズ迷路のパフォーマンス研究者も評価してください運動、特に (よう運動を損なう可能性のある突然変異マウスの学習を評価するためにバーンズ迷路を使用する場合、ハンチントン病マウス モデルで見つけられるそれらまたはさらされる毒素は、多動性は、誘導やエタノールなどの動きを遅らせる可能性があります)。さらに、迷路と商工会議所の表面を徹底的に掃除する必要があり、香りキューを避けるためにそれぞれの動物の間変更された寝具を困惑させます。
重要なは、最小限の投資でのサイトにすべての材料を加工できます、ほぼすべての設定は、大きな柔軟性を可能にこれらの実験をレプリケートできることを意味するこれらのアッセイの物理的な設置面積が小さい。この種のアクセスは、パイロット データが実質的なサポートの欠如ですばやく収集する必要がある場合、限られた資源でより小さい機関で実行する良い科学をことができます。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ハンプデン ・ シドニー ・ カレッジのランドルフメーコン カレッジ (、いくつかの仕事が以前実行された) によって承認されました。
マウスの基本住宅
- 固体底と側面、柔らかい寝具と紙のシュレッダーのような材料を入れ子のレイヤーとプラスチックのケージ内マウスを家します。細切りのトウモロコシの穂軸で構成される寝具または木の削りくずを使用し、寝具が衛生のため定期的に変更されることを確認します。
- 食糧へのアクセスを提供し、水の自由。プラスチック製ケージの上部は住宅食品ホッパーです。食品ホッパーから正しく作り出されたマウスの餌のペレットを調剤し、水ディスペンサーを提供します。外部の汚染物質からマウスを保護するためにエアフィルターをケージ上部に機能を確認します。
- 住宅施設で 12 時間の明暗周期に従うことによってマウスの自然なリズムを維持します。夜の時間帯などの動物の暗い周期の間に理想的には、一日の同じ時間で行動なテストを実施します。
注: ハウジングにマウスを区別するために注意する必要があります。特徴的なマウスのさまざまな方法があります、耳パンチ、耳タグ、および尾のマーキングなど。
2. バーンズ迷路テスト: 建設
- 直径 120 cm 円形木製ボードを取得します。
- 20 の円形の穴 (直径 4.5 cm) の円の周囲をカットします。迷路の端から 2.5 cm、13 cm 隣接穴とは別に各穴を配置します。
- 表面を滑らかにし、それらに光沢のある白い (明るい色を推奨) を描きます。
- 小さなカップの挿入するため迷路ボードの指定の 1 つの側面は、それぞれの 20 穴と各ホール (各穴の両側に 1 つ) の場所の 2 つのフックから約 2-3 cm をフックします。
- フックと迷路の側面の穴をカバーするため浅い黒 (プラスチック) ディスクを使用します。迷路の下にディスクを握るために太い輪ゴムを確保するためのフックを使用します。
- バーンズ迷路、地上とはテーブルや椅子のような他の同様に背の高いオブジェクトから 120 cm を安全にマウントします。ボックスや便は、迷路の中をサポートする使用できます。
- 迷路の 3 側面の余分な迷路的手掛かりとして (三角形、円、およびクロス) 各壁に 1 つの形をした大きな白いポスターを配置します。各試行の迷路の周りの壁にポスターを維持します。
- 迷路の最後には、マウスの迷路上に表示されている研究者なしデータを正確に記録できるので、オブザーバーを非表示にする固体黒いカーテンを設定します。
- 迷路全体表面の鳥瞰図とアリーナでビデオカメラを中断します。
- 表面をきれいにすべて迷路 (黒ディスクとターゲット ボックスが含まれている) の水で、70% エタノール溶液各マウス試験の前後に。
- 100 W 光源 25 cm を迷路 (トライアルのスタート/フィニッシュでオン/オフ回転) の中心に置き、ディスクと床に直面してフックを持っていることを確認します。
注: ルームで他のすべての天井の照明がテスト中にオフしている必要があります。100 W の光の横に掛け超音波ノイズ メーカーの添加をお勧めします。それをオン/オフに各試験の開始/終了。
3. バーンズ迷路テスト: プロシージャ
注: は、テストを再開する前に完全に乾燥する時間を可能にする、各試験の前後には、水と 70% のエタノール溶液で迷路のすべてのコンポーネントを洗浄してください。クリーニング品の準備と試験のタイマーを持っていることを確認します。
- 信頼性の高い同定法を使用している間グループのすべてのマウスを家します。迷路で積極的に実行されていないときは、マウス試験室の外してください。これ途中で超音波の鳴り物にさらされないことを確認することです。
- マウスをそっと拾って手に足尾のベースからそれらを保持して処理します。
- 訓練のためには、/の学習を評価するために行の 7 日間の 1 日あたりの毎日一度迷路の実行マウスを持っています。
注: 後日メモリ/保持を評価するための一つの長期的な試験を行うことができます。現在のプロトコルは生後 32 から始まる思春期のマウスを訓練され、生後 4 ヶ月で大人の長期試験を行った。 - テスト期間中に使用するターゲットの穴に各マウスをランダムに割り当てます。穴は 1-20 迷路の下にまたはどこ彼らは見えない迷路の中でマウス迷路境界の外側にラベルすることができます。
- 小さいブラック ボックス (23 x 11 cm) で割り当てられた穴ディスクを置き換えます。しっかりと輪ゴム最寄りのフックに接続されているバーンズ迷路に取り付けます。
注: ターゲット ボックスは浅い十分なので、マウスはそれに簡単にステップ ダウンすることができますまたはそれにジャンプするマウスがないことを確認する手順が含まれています。 - テストを開始するまでの 30 秒間に適応するカップの下に迷路の中央にマウスを配置します。ビデオの録画を開始します。
- 光と超音波の鳴り物を入れます。動物の最初の見出しをバイアスを避けるために文字列のメカニズムを介してカップを持ち上げます。Timer を起動し、観察するカーテンの後ろに座る。
- マウスがターゲットの穴に入る後、裁判またはバインダーの開始で使用される同じ不透明なカップで穴をカバーし、超音波の鳴り物をオフにします。マウスがターゲットを入力していない 5 分が経過した後場合、は、ターゲットの穴にマウスを同種します。
- マウスが入る穴を確認します。マウスがターゲット ボックス内にあるとき穴をカバーし、鳴り物をオフにします。1 分間妨げられていないターゲット ボックスに残っているために、マウスを許可します。
- ターゲットの穴は各マウスのトレーニング期間中一定であるがマウス ランダムな順序で毎日実行前のマウスで左の手がかり/香りを次がないことを確認します。
4. バーンズ迷路テスト: データ分析
- バーンズ迷路学習試験中に記録次タイミング データ: 迷路に費やされた時間の合計し、ターゲットを見つける時間がターゲットを入力した場合は、ターゲットの穴を入力する時間です。
- エラー (不適切な穴探検の数) の数を決定するのには、マウスの全体的な動きを追跡ターゲットがある前後に。またターゲットの穴から探検する最初の穴までの距離を記録 (距離は離れての穴の数で測定されます)、任意の顕著な行動をグルーミングと一緒に。
- 各試行間に迷路の図を一枚の紙にそれぞれの動物の動きを追跡し、ターゲットの反対側の象限に探検された穴の数を決定すると同様、検索戦略を分析に使用します。ビデオ分析を使用して、パスを確認します。
5. 乙女-の-遭難テスト: 拘束室を構築します。
- 明確なシリンダーを鼻の先端に尾のベースから雌マウスの長さの 3/4 と等しい長さにカットします。シリンダーの寸法がマウスの中に配置を好転させることができないものであることを確認します。
注: 我々 は 1 カ月齢のマウスの 4 cm 長いチューブと 8 センチ 4 ヶ月齢マウスの管を作るために 50 mL のコニカル チューブの円錐端をカットします。 - キャップの一つ、削除して再接続できるようにシリンダーの両端をキャップします。パンチ 3 4 穴、約 0.5 cm、各キャップ。穴が鼻触るマウスと呼吸12を許可するのに十分な大きさであることを確認します。
注: また、採血中にマウス拘束のデバイス使用できます。
6. 乙女-の-遭難テスト: アリーナの準備
- アリーナで 19 cm 壁付け 38 × 38 cm の不透明なトップレス プラスチック正方形ボックスことを確認します。均一に約 2.5 cm の高さにトウモロコシ寝具でそれを埋めます。
注: トウモロコシの穂軸寝具簡単掘りイベントを検出します。 - アリーナ全体がビューであるようにアリーナにビデオカメラを停止します。
7. 乙女-の-遭難テスト: 探索行動測定
- アリーナ中央に閉じた状態と空のストレス チャンバーを配置します。
- 中断されたカメラで記録を開始します。
- 雄マウスを選択します。マウスは、識別のためにマークされている場合、は、この男性の身元に注意してください。ない場合は、ケージに戻った後区別することができますこのマウスをマークします。
- アリーナの左下隅でカップの下に男性マウスをそっと置きます。30 秒後に、文字列のメカニズムを介してカップを削除します。
- 10 分、録画中にその視野を出さないように注意しながら探索するマウスを許可します。10 分の終わりには、アリーナから、マウスを削除して次の 5 分12の持株ケージに戻る。
- 録音を停止し、適切な識別子を持つビデオ ファイルを保存します。
8. 乙女-の-遭難テスト: 社会的な反応測定
- 探索行動測定のように同じアリーナと録音の設定を使用します。
- 雌マウスを選択します。マウスは、識別のためマークされて、この女性の身元を注意してください。ない場合は、ケージに戻った後それを識別できるように、このマウスをマークします。
注: littermate、おりの仲間、または新しいマウス使用できます、研究の質問に応じて。複数の試験が行われている場合は、すべての試験でリレーションシップの種類を保持します。 - 雌マウス優しく首拘束、尾のベースで必要に応じて、押しながら拘束室にそれを下げます。それの後ろに開口端を閉じ、好転することがあることを確認します。
注: は、雌マウスは拘束チャンバーに入ることに耐性があるとして一口抵抗力がある手袋を着用を検討します。 - 中断されたカメラで記録を開始します。
- 共感アリーナの中央に内閉じ込められた雌マウスの拘束室を置き、10 分の順応する女性を許可します。女性の視野からままに注意してください。
- 雌マウスが 5 分間拘束室にしたら前に、と同じプロセスを使用して共感アリーナにマークされた雄マウスを配置します。雄マウス マウスの視野からままに世話をもう一度、アリーナを探索するさらに 5 分を許可します。
- 録音を停止し、適切な識別子を持つビデオ ファイルを保存します。
- 5 分の終わりには、アリーナから両方のマウスを削除し、ケージに配置します。トウモロコシ寝具を交換し、アリーナと 70% エタノール12チャンバー内にストレスをサニタイズします。
9. 乙女-の-遭難テスト: データ分析
- トラッキング ソフトウェアを使用することができます、しかし、ビデオは手動で分析もできます。ビデオ ファイルがコンピューター上に表示されると、画面上に透明シートをオーバーレイし、マーカーを使用してアリーナの広場を説明します。アリーナの正方形を 9 つの等しいコンパートメントに分割します。
- 初期の探索的測定の最初の 5 分の動画データを確認します。番号を記録するコンパートメントの交差 (自発活動/探索行動)、アリーナ (オープン フィールド嫌悪) と掘りとグルーミングのエピソードの数、マウスに触れた空虚な中心拘束時間数の正方形の中心に費やされた時間商工会議所。
注: は、男性の 10 分の初期探鉱、5 分で 2 番目の得点は行われませんも 10 分、女性は男性の不在で中央の部屋に閉じ込められています。 - 男性はアリーナに閉じ込められた女性と再導入直後の社会的応答測定 5 分の映像データを確認します。初期の探索的メジャーとして同じデータを記録、さらに雄マウス トラップ雌マウスの鼻に触れた回数を記録します。
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Representative Results
バーンズ迷路
バーンズ迷路の使用方法を示すため、単一初期エタノール曝露がマウスの開発のコースを学習の違いを原因かどうかを検討しました。2.5 g/kg のエタノール溶液を注入したか C57Bl6/J マウス (n = 8) または生理食塩水 (n = 6) 2 回、2 時間おきに生後 6 日目で。我々 は思春期 (P30)、バーンズ迷路上の動物を訓練し、成人期 (4 ヶ月) で一つの長期的な試験を実行します。収集されたデータは、いくつかの主要なカテゴリに分けることができます: 1) 時間と誤答率、2) 対象エントリ、および 3) マッピング探索パス精度。
時間と誤答率による精度:
時間の測定は、いくつかの重要な側面を網羅: エスケープ穴 (を探しに行くになっているマウスを学ぶ場合 (マウス、試用を開始後最初の任意の穴を調査するためにかかる時間) の最初の穴に到達する遅延を説明図 1 a)。(ターゲットの穴の平面に鼻の初期低下によって得点) ターゲットの穴を見つけるため待ち時間が正しい穴 (図 1 b) を見つけることができます。各セッションで、動物迷路学習していることを示すトレーニング セッションを実行する時間は短く必要があります。
間違って穴調査 (と呼ばれるエラー) 正しい穴 (図 1) を配置する前にマウスを実行の数は、動物は比較的ターゲット脱出の穴にまっすぐ行くことができるかどうかを示します。マウスが裁判の過程で不適切な穴を探る時間の合計数は、自発運動量と探索行動の基本的な基準を与えます。(図 1)。正常に、思春期 (ここで生後 32-39 で毎日のセッションで表されます)、誤り率と時間の減少によって示される 7 日間のテスト期間中は、ターゲットの穴を見つけるためのバーンズ迷路の訓練すべてのマウスが使用されました。学習トレーニング期間にわたってエタノールとコントロールの動物との間に有意差はありませんでした。
ターゲット エントリ数:
ターゲットの穴を実際に入力する待ち時間は一般的成功迷路完成の基準として使用されるが、テストの他の側面としてできるだけ多くの情報を与えない可能性があります。ターゲットへの参入は、0 または 1 としても得点することができます。テスト、マウス 5 分が経過する前に先に入る場合が成功すると、言えますが、バインダーや本を使用してそれはマグマ溜まりの安全性を経験するので、ターゲットに動物の同種禁止にマウスがターゲットを入力しなかった場合。最初のトレーニング日にターゲットと迷路は完全に 5 分間、動物にエントリの低率を確認するべき。日以降のテストはより少ない時間を取る必要があります。
ターゲットを見つけた後複数のエラーを作るターゲット ボックスを入力しようという意欲を示し、またマウス (高架のプラットフォーム、明るい光、オープン フィールド、超音波ノイズ) に通常嫌悪されている状況を異常なコンフォートを検出可能性があります。試用期間中、ターゲットと穴探検の合計数を見つける前にミスの大きな違いは、ターゲット脱出室 (図 2 a) を入力する貧しい人々 の動機を示します。マウスは、発見後ターゲットの脱出の穴を入力されていない場合、は、軽度の有害刺激と明るい照明や騒音をテストの状況に追加できます。
実験では、テスト対象を入力して余分な動機を紹介する 5 日目に迷路上超音波ノイズ エミッタをされました。超音波ノイズの導入前に生理食塩水の投与までに入ったないスパイク ノイズの導入の後の入り口が、ターゲット。大幅よりマウス (生理食塩水とエタノールの組み合わせ) がトライアル 4 と比較して試験 6 ターゲットを入力 (t-テスト、p = 0.0014) (図 2 b)。
パス ・ マッピング:
マウスのパスをマッピング情報の保存と同様の戦略を学習を評価することができます。最初の探検の穴とターゲットの穴間の距離は、マウスが最初に行くし、どのように彼らを閉じるこのトラックはターゲット (図 3 a)、ターゲットの場所のためのメモリの良い指標です。この測定の訓練の初めに広く異なるを期待が、マウス学ぶターゲットの場所を訪問した最初の穴がターゲットに移動近い。
動物にエタノール注入が難しく時間を持っていたときこれらのマウスが (4 ヶ月) で一つの長期試験を用いた成人として再実行は、研修期間にわたってエタノールと制御動物の間学習の統計の違いは見つかりませんでしたがターゲットの穴が位置していた場所を思い出して (図 3 b)12。トレーニング、学習・記憶の微妙な違いを拾うことができましたあとでもう一度迷路を使用してバーンズ迷路の初期にこのメモリ保持の違いが見つかりませんでした 1 つ発達エタノール中毒イベントに見られるようです。バーンズ迷路表面によりマウスを取ったパスをマップする研究者の代表的な図、エラーの数と最初のホールのレコードなどを含む (図 3) を訪問しました。
反対側の象限に費やされた時間は、マウスは、迷路の中の 1 つのセクションを探る時間ターゲットの反対の 1 つ具体的に対応します。研究者取得し、マウスは、迷路を実行しているが、この措置は後で解析が必要です他のすべてのメジャーを計算することが可能です。学んでいるマウスは、反対側の象限に時間探索穴を減らす必要があります。トライアルの長期的な大人にエタノールが扱われるマウスは正しい一般的な空間的な位置を覚えて失敗を示すターゲットから反対側の象限にはるかに多くの穴を探検 (p = 0.03) (図 4 a)。
エラーの前に、実際にターゲットを見つけた後にこのマッピング測定値を分割することが重要です。ターゲットを見つける前に、エラーの数は、学習が行われているが、それはまたマウスの検索戦略について私たちを伝えることができるかどうかに明らかにできます。ランダムに穴をいただき、代わりに、マウスはターゲットをすばやく検索するための戦略を採用することが。長期の試用期間中にすべてエタノール投与動物の連続した穴を検索リング状のファッションで穴が発見されるまで、使用マウスがこの手法を採用かなり少ない生理食塩水が扱われるに対し (p = 0.004) (図 4 bと4 D)。また、マウスは、空間的な学習が行われている、動物がターゲットの穴の付近を頭に外部キューを使用している可能性が高いことを示します (図 4)、迷路の一般的な方向をターゲットできます。
乙女の悩み
乙女の苦痛アリーナが建設され、両方の 1 M で C57Bl6/J マウスの探索と社会的行動をテストする使用 (n = 15)、4 M (n = 12) 年齢の。雄マウスが角 (図 5 a) に共感の場に利用されました。マウスの探索行動は、新しいアリーナで 5 分で交差正方形の数として定量化されます。古いマウス (4 ヶ月) クロス若いマウス (1 ヶ月) (p < 0.0001) よりより多くの正方形であることが分かった (図 5 b)。
次に、閉じ込められた女性が (図 5 a) アリーナの真ん中でシリンダーに置かれました。女性は、部屋に閉じ込められている、一度探索行動再び交差正方形の数として定量化することができます。閉じ込められた女性の存在は、男性の探索行動を影響します。年齢に関係なく男性マウスを閉じ込められた女性少ない探索します。若年男性探検少ないアリーナ (正方形の交差の数によって測定される閉じ込められた女性は単独でよりもマウス (1 ヶ月で: t-テスト、p = 0.001; 男性だけで 46 ± 女性 26.13 ± 3.42 正方形の対 4.34 正方形を意味する)。この違いはまた明らかに大人で (4 ヶ月で: t-テスト、p < 0.000001; 意味男性単独で 151.5 ± 女性 103.08 ± 0.3.59 正方形の対 5.31 正方形) (図 5 b)。
さらに、マウスは、5 分間中央広場で費やされた時間数も評価されなければなりません。センター広場で費やされた時間は、存在と社会的関心の対策として女性の不在で比較する必要があります。男性が閉じ込められた女性の存在下で広場を中心に多くの時間を過ごすことが分かった。若年男性が閉じ込められた女性の前でアリーナのセンターを探索するより多くの時間を過ごしただけでするときよりもマウス (1 ヶ月で: p = 0.05; 33.42 ± 9.32 秒の女性対男性の単独で 13.14 ± 2.79 s を意味する)。この違いは、大人にも見られた (4 ヶ月で: p = 0.001; 52.87 ± 8.9 秒の女性対男性の単独で 14.80 ± 1.89 s を意味) (図 5)。
さらに、研究者も不安や閉じ込められた女性に向けて向社会的行動の測定ができる舞台で掘りイベントの数を定量化するべき。この措置は 1 ヶ月 (1 M) マウスがなく、4 ヶ月 (4 M) マウスの女性の存在下で大幅に異なる。若年男性を過ごした閉じ込められた女性の前でアリーナで彼らの時間の間にもっと時間を掘って単独でするときよりもマウス (1 ヶ月で: p = 0.027; 意味と女性 3.2 ± 0.27 倍対男性一人で 0.4 ± 1.09 倍)。大人でこの差は見られなかった (4 ヶ月で: p = 0.65; 男性単独で 1.33 ± 0.54 倍対.と意味女性 1 ± 0.49 倍) (図 5)。
男性が閉じ込められた女性と動物に触れた空気穴を通して鼻回数を含む拘束室に触れる回数は、向社会的行動の対策です。結果、雄マウスに触れた格納筒閉じ込められた女性大幅大人 (4 ヶ月) として頻繁より稚魚 (1 ヶ月) として (p = 0.00001; 意味 1 ヶ月 4.73 ± 0.95 倍対. 4 ヶ月 15.92 ± 1.64 倍) (図 5E)。開始よりも大人の男性には、女性の接触イベントが閉じ込められています。雄マウスに触れた空気穴を通して閉じ込められた女性と鼻大幅大人 (4 ヶ月) として頻繁より稚魚 (1 ヶ月) として (p = 0.002; 意味 1 回対 4 ヶ月 8.67 ± 3.93 1 ヶ月 ±.94 回)。(図 5 階)。
超音波記録装置は、雌マウスで 20 kHz 以上の超音波発声をリッスンに使用した、「独身の苦痛」逆転パラダイムに閉じ込められた男性マウスでも超音波発声をリッスンする使用だった。以前研究嫌悪刺激 (身体拘束、電気ショックなど) 露出11中超音波発声反応マウスが見つかりませんので、期待されているいずれかの状況での発声は検出されませんでした。
図 1: 時間と誤答率によってバーンズ迷路精度代表の結果します。注入したマウスか 2.5 g/kg のエタノールまたは生理食塩水で 2 回 2 時間離れて生後 6 日目で。私たちは一度思春期では、7 日間毎日動物を訓練し、成人11一つの長期試験を行った。(A) 待ち時間マウス エスケープ穴を見つけることを学んでいる場合最初の穴 (マウス、試用を開始後最初の任意の穴を調査するためにかかる時間) 明らかに到達します。(B) 待ち時間 (ターゲットの穴の平面に鼻の初期低下によって得点) ターゲットの穴を見つけることは正しい穴を見つけることができます。(C) 間違って穴数調査 (と呼ばれるエラー) マウスを作る動物は比較的ターゲット脱出の穴にまっすぐ行くことができるかどうかを示す正しい穴を見つける前に。マウスが裁判の過程で不適切な穴を探る (D) 合計回数は、自発運動量と探索行動の基本的な基準を与えます。誤差範囲は、SEM11を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 成功したバーンズ迷路完成。ターゲットの穴を実際に入力する遅延条件として成功した迷路完成使われませんが動物の発見の後ターゲットの穴を入らない場合があります。(A) A 大きな違いターゲット脱出部屋を入力する貧しい人々 の動機を示す試用期間中、ターゲットと穴探検の合計数を見つける前にエラー。私たちの実験では超音波ノイズは、ターゲットを入力するためにネズミを誘導する試み 5 に加えられました。(B) 大幅よりマウス (生理食塩水とエタノールの組み合わせ) に入力したターゲット トライアル 4 と比較して試験 6 (t-テスト、p = 0.0014)。エタノールのマウスは 7 日目でターゲットを見つけた後探索を続けた誤差範囲を表す SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: バーンズ迷路動機。マウスのパスをマッピングは、動機についての情報を提供できます。最初の探検の穴とターゲットの穴の間の距離 (A) マウスが最初に行くこのメジャー トラックとして、ターゲットの場所のためのメモリの良い指標は、どの程度までターゲットを離れていると。(B) これらのマウスが (4 ヶ月) で一つの長期試験を用いた成人として実行再した場合、研修期間にわたってエタノールとコントロールの動物との間学習に統計的差は認められなかったものの、動物にエタノール注入ターゲットの穴が位置していた場所を思い出して難しく時間を持っていた。(C) A 代表図バーンズ迷路の表面により、研究者がマウスを取ったパスをマップする、エラーの数と最初のホールのレコードを含む訪問しました。このマウス 16 秒以内ターゲットにまっすぐに行ったが、決して 5 分にわたって入力し、その後 41 穴を探検します。この動作は、ターゲットを入力しようという意欲を示します。誤差範囲を表す SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: バーンズ迷路探索戦略。マウスのパスをマッピングすることができます検索戦略を明らかにし戦略を学習についての情報を提供します。(A) 試験の長期的な大人にエタノールが扱われるマウスは正しい一般的な空間的な位置を覚えて失敗を示すターゲットから反対側の象限にはるかに多くの穴を探検 (* p = 0.03)。(B) 長期試用期間中すべてエタノール投与動物の連続した穴を検索リング状のファッションで穴が発見されるまで、使用マウスにこの手法が採用されている生理食塩水の少ない処理大幅に対し (* * p = 0.004) (B、D)。(C) 生理食塩水の体験日 6 の結果を写真処理マウスと (D) エタノール処理マウス。マウスは、空間的な学習が行われている、動物がターゲットの穴の付近を頭に外部キューを使用している可能性が高いことを示します (C) 迷路の一般的な方向をターゲットできます。通常、作業領域スコアは、この戦略を使用してマウスの優れています。シーケンシャルな穴に穴 (D) 検索ではリング戦略、マウスが迷路の任意の端に行くし、ターゲットを見つけるために各穴に見えます。象限のスコアは、マウス リング戦略を使用して、大きな変化と貧しい。誤差範囲を表す SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:乙女の苦痛。(A) 苦痛の乙女アリーナは 9 の正方形に分かれています。雄マウスは隅に置かれ、男性の行動を観察しました。シリンダー容器の中に閉じ込め、メスのマウスは、アリーナの中央の広場に配置されます。(B) アリーナ内探索行動は思春期 (1 月 = 1 M) と成人期 (4 ヶ月 = 4 M) の間増加します。全体的に、男性マウス探検少ない閉じ込められた女性です。また、検討若年マウス未満の閉じ込められた女性の存在下で成体。(C) 社会的な反応は、マウスをトラップ マウスの開催場所中央広場で費やしている時間によっても測定できます。少年、成人男性は、閉じ込められた女性の存在下で広場を中心に多くの時間を過ごした。(D) 若年男性が閉じ込められた女性の前でアリーナで彼らの時間の間により多くの時間掘りを過ごしただけでするときよりもマウスします。(E) 雄マウスに触れた少年としてよりも大人より頻繁大幅閉じ込められた女性を含むチューブ。(F) 大人の男性よりも開始には、少年よりも女性の接触イベントが閉じ込められています。誤差範囲を表す SEM (* * * p < 0.0001 * * p 0.001、* p 0.05)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
バーンズ迷路、乙女の苦痛実験マウスの向社会的行動、自発運動、空間学習を評価する方法が安価、迅速、かつ比較的簡単。他の利点には、あからさまなストレス、苦痛、または動物のための食事制限がない場合があります。ほとんどの学習/記憶パラダイムのようなバーンズ迷路の不利な点はターゲットの穴の位置を学ぶして動物に必要な試行回数です。
データの収集:
マウスの活動と両方のパラダイムの中での行動を観察すると、データを一貫して収集する必要があります。バーンズ迷路の最初の穴に達すると、それは、ターゲットの穴に到達時間と、それは、ターゲットの穴に入る時間を探るエラー/間違っている穴の数時間の記録が含まれます。さらに、研究者は各マウスの迷路上のパスにマップします。マウスは、迷路を実行して同時にバーンズ迷路の紙の地図を使用してデータを追跡することができ、映像を使用してタイミングと穴番号を確認できます。動物を追跡する場合は、毎分 1 回可能性があります重複の穴探検を追跡するペンの色を変更すると便利場合があります。コンピューターによる追跡システムは精度・信頼性の向上、idTracker、Ctrax、tracktor などに使用可能ないくつかは無料またはオープン ソース。
乙女の苦痛の試金のため記録されたデータは、男性に入ると、空シリンダーのみと比較して閉じ込められた女性が存在する場合、男性が中央広場で費やしているどのくらいの時間、女性に到達するための男性のための時間どのように多くの正方形を含める必要があります。、どのように多くの接触イベントがあるがシリンダー、チャンバーと何回掘りイベントを通して触れた動物鼻が全体的な発生の回数と中心部の数の正方形。
行動テストで定数:
すべての行動のテストと同様、条件間および環境変数が研究の結果を混同しないことを確保するための動物実験の内で一定した保たれることが重要です。実験環境における視覚、聴覚や嗅覚刺激のものかどうかのマウスで、行動の変更を引き起こすまたはない13。そのため、気が散る外部刺激14からマウスを保護するため注意が必要があります。アリーナは苦痛の乙女シナリオで使用し、バーンズ迷路はそれぞれ水で試験前のマウスの残留インジケーターには後の裁判影響ないように 70% エタノールで消毒後掃除する必要があります。さらに、各乙女の苦痛の分析後寝具に変更する必要があります。データ収集は、データを確認し、正確な分析を確保する実験者を許可するビデオに常に記録されなければなりません。それはカーテンの後ろに隠されたままに研究者のための挑戦をすることができます。 またはそれ以外の場合、データが、これを収集しながら視界からはマウスの定数、気晴らしフリーの設定を維持することが重要。
バーンズ迷路パラダイム設計と変更:
バーンズ迷路用の複数の出版されたパラダイムがあります。バーンズ迷路トレーニングのプロトコルの 7-15 日から通常範囲、プロトコルを短縮することができます。難しいタスクを学習するためにトレーニング セッションの数を切り捨てるより長いプロトコルが15を逃すことの相違点を特定できます。光 (元・ バーンズ研究) のようにオーバーヘッドだけで使用できるまたはマウス エスケープ室3,16を入力するより多くの動機を作るために (明るい光、ファン、ノイズなど) その他の要素を追加できます。パイロット調査の間にターゲット ボックスを入力する貧しい人々 の動機を観察すると、実際のトレーニング中にこれらの要素の追加が考慮。
正しいターゲットの穴への参入がより急速にこれらの要素なしで実行可能性が高いが、研究者はこれらの追加のストレスを誘発するかもしれないことに注意してくださいする必要があります刺激。嫌悪刺激の有無は、ターゲットの穴を入力する動機を評価するために操作できます。分かったその出生前のエタノールは、マウスだろう、明るい光だけが使用され、この現象が実際にターゲットの穴が位置していた場所を学習とは異なるトレーニング期間中に逃亡穴を入力する可能性に影響を与えた。
プロトコルの 1-4 日に見られる、マウスはありませんでした、穴を入力する非常に独創力のある彼らは十分に容易にそれを見つけるようだが。ただし、超音波ノイズが 5 日目に迷路の上に配置されたとき、マウスがそれを発見した後ターゲット部屋を入力する可能性を含むほとんどのバーンズ措置についてスコアが向上しました。裁判の日 6 と 7、余分な穴調査の数を大幅に削減する、ノイズが登場し、7 日目でエタノール マウス保持探索ないターゲット (図 2 a) を発見した後。それはこれは迷路を学習の自然な結果が可能ですが、動物は超音波ノイズの導入後より興奮し、迷路を探索しにくい表示でした。マウスのやりがいのある状況のままに商工会議所で、研究者もつけなければならない嫌悪刺激をオフにする (穴をカバーし、ノイズをオフに) 割り当てられた量の商工会議所の妨げられていないままに動物の許可と動物を削除する前に処理にかかる時間
バーンズ迷路の設計は、学習およびメモリ評価に影響を持つことができます。現在のプロトコルは、余分な迷路のキューを使用します。実験室の非対称性に加えて 4 つの単純な黒に白背景図形 (正方形、三角形、円、十字) のポスターは視覚的な手掛かりとして部屋の壁にマウントされていた。バーンズ迷路実験室の壁に遠位の手がかりの有無解決することができます。 またはシリアル検索戦略を使用して解決することができます。このため、「最初穴目標からの距離"測定のみを使用してマウス迷路を解決する非空間能力17から空間を区別しない方法で関連違いを見落とす可能性があります。またについて反対正方形またはターゲットの前にエラーの数、穴の数を調べるなど、複数の解析メジャーを使用ください。検索戦略のパターンを分析もできます。
異なる近交系マウスの視力の違いによる可能性、バーンズ迷路に変数のパフォーマンスがあります。バーンズ迷路で使用する貧しい人々 の視力を持つマウスのひずみを選択している場合迷路の端の周りに小さな壁の接触 (壁に取り付ける動作) を増加し、非ビジュアル検索戦略の使用を増加させます。男性は、DBA/2 j と C3h/hej 緊張の女性よりもよりよい学習性能を持っていたし、C57/Bl6 マウス バーンズ迷路18メモリにおける男女差を表示するされて見つかっていない男性だけは、現在のプロトコルで使用されたが。
乙女の苦痛パラダイムの設計や変更:
主要な制限では、乙女の苦痛実験のため、アリーナの中央にチューブからメスのマウスまたは「乙女」を解放する探索的マウスの逃げ道はないです。リリースのメカニズムを含めるに商工会議所の再設計興味深い将来変更になります。苦痛の乙女の欠点向社会的行動を測定するための新しい評価は、パラダイムを用いた比較研究の不在であります。
苦痛の乙女を (別のマウスと過ごす時間への傾斜で定義)、社会性を評価するためにさらに変更可能性があります社会的目新しさ (おなじみのマウスと比較して新しいマウスを調査する傾斜) のための好み交尾や積極的な(発情期の女性や商工会議所の新規男性のトラップ)、行動と利他的な行動傾向 (閉じ込められた非, と比較して閉じ込められた littermate への応答の遺伝的背景の影響など、進化生物学の問題マウス)19。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ハンプデン ・ シドニー大学で我々 はバーンズ迷路と乙女の苦痛実験のプロトコルのテストに関与することをアントン Kheirani ハンター ・ リー、ザック ライトナー ショーン ウォールデンの承認と感謝を与えます。バーンズ迷路と、ランドルフ ・ メイコン大学生物学教室検査スペースを提供するための建設のためランドルフメーコン カレッジでジェイムズ ・ フォスターに感謝したいと思いますも。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Damsel-in-Distress | |||
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Any brand of 50 mL conical tube will work |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| hammer | Grainger | 6R252 | Any standard hammer will work |
| nail (size 8D) | Grainger | 4NFE3 | Similarly-sized nails should work just as well |
| opaque, topless plastic box | AcmePlastics | CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025 | Opaque plastic, cut to size (30 cm L x 19 cm W x 3-6 cm H). Step may be added to ensure no more than a 3.5 cm entrance depth for the mouse. |
| video camera (smartphone) | N/A | N/A | Any camera-equipped smartphone will work |
| bite-resistant gloves | Kent Scientific | GLVDYN02 | Any brand offering appropriate protection |
| transparency sheet | Staples | 954145 | Any brand of clear plastic sheet will work, used for scoring |
| Barnes Maze | |||
| Petri Dishes | Corning | 353025 | Spray painted and used as covers for Barnes maze holes |
| Plywood (3/4 in.) | LP Building Products | 22487 | To construct Barnes maze |
| Spray Paint | Krylon | 1274937 | Used to paint petri dish caps black, white paint used to paint plywood |
| Cup Hooks (5/8 in.) | Ace Hardware | 5360615 | 2 used on either side of ventral hole surfaces; Rubber band wraps around hooks to hold cap flat |
| Poster Board | Creatology | n/a | Used at edges of maze as extra cues |
| Light Bulbs | Phillips | n/a | 100W light bulb, used to during the trials |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| Ultrasonic noisemaker | Victor mini PestChaser | M753SN | Used as aversive stimuli |
References
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