Summary
Denne protokollen måler romlige læring og hukommelse bruker Barnes labyrinten. En roman jomfru-i-nød paradigme brukes til å vurdere locomotor aktivitet og Piezo2 i mus.
Abstract
Barnes labyrinten er et pålitelig mål på romlige læring og hukommelse som ikke krever maten begrensningen eller eksponering for ekstremt stressende stimuli. Barnes labyrinten kan også vurdere andre mus atferd, som generelt motivasjon til å rømme fra labyrinten plattform og utforskende atferd. Barnes labyrinten kan måle om en genetisk mutasjon eller miljømessig variabel kan påvirke erverv og oppbevaring av romlige minner, samt informasjon om søkestrategi ansatt av musene. Her bruker vi Barnes labyrinten for å oppdage minne underskudd i voksen mus etter en enkelt utviklingsmessige etanol eksponering hendelse. Nylig beskrevet jomfru-i-nød paradigmet viser en mannlig mus til en kvinnelig mus fanget i et kammer i feltet for åpen center arenaen. Det gir en mulighet for musen til sosialt svare på fanget kvinnelige og viser Piezo2. Jomfru i nød paradigmet kan også brukes til å undersøke museinnstillinger i en roman arena og måle locomotor aktivitet. Både Barnes labyrinten og jomfru-i-nød protokollene krever minimal økonomisk investering og de fleste aspekter av testene kan konstrueres fra vanlige lab forsyninger. Disse fleksible og tilgjengelige verktøyene kan også brukes til å oppdage atferdsendringer i løpet av utviklingen.
Introduction
Formålet med denne protokollen er å måle romlige læring og hukommelse i mus ved hjelp av Barnes labyrinten som sosiale respons og bevegelse bruker jomfru-i-nød paradigmet. Brukte romlige læring og hukommelse tester for gnagere inkluderer radial arm labyrinten, som måler en mus har muligheten til å finne skjulte mat i en arm av en multi-eiker apparater, og Morris vann labyrinten, som plasserer en mus i et stort badekar eller basseng med vann og vurderer hvor lang tid det tar for å finne en skjult undervanns plattform. Vanligvis trening for disse paradigmer spenner over flere forsøk og kan måle både oppkjøpet priser og oppbevaring gjennom kortsiktige og langsiktige minne studier.
Selv om radial-arm labyrinten og Morris vann labyrinten er pålitelige måter å teste minnet i gnagere, presenterer de komplikasjoner for noen forskere. Begge labyrinter bruke deprivasjon eller sterk aversive stimuli som forsterkning1. Radial arm labyrinten bruker mat deprivasjon for å sikre at gnagere er riktig motivert til å finne en næringen belønne. I Morris vann labyrinten, kan effekten av stress indusert av en tvunget svømme endre resultatene i mus2.
Barnes labyrinten er en alternativ romlige bevissthet oppgave som krever gnagere lære plasseringen av hull for å unnslippe den lyse, åpne labyrint overflate3. Svak aversive stimulering (lys eller lyd) brukes deretter for å øke sannsynligheten for at mus vil flykte fra plattformen. Barnes labyrinten krever ikke mat deprivasjon, så dyr forberedelse er mindre enn i radial arm labyrinten. Den kan brukes uten konflikt av forskere som undersøker atferd eller molekyler forbundet med spise, hormon regulering eller hypothalamus trasé.
Barnes labyrinten har også fordeler over Morris vann labyrinten. Det er mindre stressende enn Morris vann labyrinten, forårsaker mindre forhøyede nivåer av corticosterone i mus4. Dessuten, det er mye enklere å montere og krever mindre dedikert plass under testingen prosedyre og lagring.
Jomfru i nød analysen er en enkel todelt eksperiment som kan vurdere locomotor aktivitet etterfulgt av Piezo2. Jomfru i nød analysen er utformet for å vurdere utforskende atferd og sosial respons av en mannlig gnager svar på en fanget kvinnelige gnagere. Brukte metode for å vurdere omgjengelighet (samt preferanse for sosiale nyhet) er bruken av Crawley tre-kammer omgjengelighet test, som vurderer den frie valget av en mus til å tilbringe tid i nærheten eller andre mus5.
Ligner Crawley tre-kammer omgjengelighet test, jomfru-i-nød analysen måler også fritt valg om hvordan å bruke tid i nærvær av en annen mus, men det gir også målene for dypere aspekter av sosial funksjon: 1) i den Jomfru i nød analysen, fanget kvinnelige musen holdes i midten av et åpent felt, så hannens potensielle aversjon til et åpent felt er pitted mot sin kjøre å sosialt utforske eller undersøke en fortvilet kvinne conspecific. 2) jomfru-i-nød modellen gir også en måte å vurdere prosocial og empatiske atferd svar på fanget musen, som ikke har vært vanlige utforsket i mus.
Dyr empati er definitivt observerbare og målbare, men ikke mange paradigmer finnes for dette formålet. For eksempel i rotter, kan en fanget bur kompis indusere en tilstand av prosocial motivasjon, der rotter fungerer gratis fanget dyret. Faktisk vil rotter velge å fanget dyret selv før du åpner en lignende beholder som inneholder en sjokolade snack, deretter tilgang sjokolade og dele den med den nylig frigjorte rotte6.
Tiltak av empati i mus omfatter vanligvis påføre smerte; faktisk er mus som ser andre mus i smerte mer følsomme for smerte seg7,8. Tilbakeholdenhet stress er en preget fenomen i gnagere og har vært kombinert med sjokk å undersøke stressresponser, som et mål på empati i mus9,10.
Det er Etiske Betraktninger knyttet indusert smerte eller sjokk, så stress-inducing alternativer er nødvendig. Vi utviklet jomfru-i-nød paradigmet som et mål på empatiske atferd i fravær av smerte eller sjokk behandling. Fanget musene i våre jomfru-i-nød protokoll viser åpenbare tegn på distress etter bare flere øyeblikk som de ikke klarer å snu i små beholderen, men de er uskadd samtidig som det gir en mulighet for andre mus å svare på deres nød.
For å begynne jomfru-i-nød vurdering, er mannlige musen plassert i en stor romanen arena som inneholder en liten tomt sentrale sylinder. Utforskende atferd registreres i flere minutter, inkludert hvor mange deler av arenaen er krysset og hvor mye tid i det sentrale åpne området. Denne metoden gir en rask og enkel måte å utelukke locomotor underskudd som en potensiell confounder i læringssituasjon som krever koordinert bevegelse for vellykket gjennomføring. Det gir også et grunnleggende mål på hvor mye aversjon mot åpne center-feltet finnes. Begge målene kan påvirke Barnes labyrint ytelse.
Etter innledende leting, mannlige fjernes fra arena og kvinnelige musen er plassert i en innesluttet, liten klart sentral sylinder (samme som brukes til å samle blod fra mus). Deretter opprinnelige mannlige musen er gjeninnføres inn i arena, og utforskende atferd er igjen scoret. Jomfru i nød paradigmet vurderer om en mus er interessert i en sosial interaksjon basert på endringer i atferdsmønster når en fanget kvinner er gave (scoret av tiden i sentrum torget og antall graving episoder), og om den musen har Piezo2 mot den fangede kvinnelige (scoret av mengden sylinder undersøkelser og kontakt hendelser med fanget kvinnelige). Jomfru i nød analysen kan brukes til å måle en tilbøyelighet for sosiale nyheten (ligner på Crawleys tre-kammer omgjengelighet test) avhengig av om forskere trap en kjent eller romanen mus.
Sammen, tillate Barnes labyrinten og jomfru-i-nød eksperimenter nøyaktig evaluering av musen læring evner og sosiale respons i fravær av ekstremt stressende stimuli. Som med alle opptreden analyser, bør disse eksperimentene utføres med stor følsomhet overfor dyr opplevelsen, minimere ubehag oppleves av dyret.
Som de fleste labyrinter, kan forskjeller i locomotor aktivitet påvirke ytelsen på Barnes labyrinten, så forskerne bør også vurdere locomotor aktivitet, særlig når benytter Barnes labyrinten for å vurdere læring i mus med mutasjoner som kan forringe bevegelse (som finnes i Huntingtons sykdom musen modeller eller de utsettes for giftstoffer som kan føre til hyperaktivitet eller retard bevegelsen som etanol). I tillegg labyrinten og chamber overflater skal rengjøres grundig og sengetøy endret mellom hvert dyr å unngå duft stikkordet forundrer.
Viktigere, alle materialer kan fremstille på stedet med minimal økonomisk investering og små fysiske fotavtrykk av disse analyser betyr at disse eksperimentene kan replikeres under nesten alle forhold, gir stor fleksibilitet. Denne typen tilgjengelighet gjør god vitenskap utføres på mindre institusjoner med begrensede ressurser eller i situasjoner der forsøksdata må samles raskt i fravær av betydelig støtte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Hampden-Sydney høyskole eller Randolph-Macon College (der noen var tidligere utført).
1. grunnleggende bolig av mus
- Huset musene i plastmerder med solid bunnen og sidene og et lag med mykt sengetøy og hekke materiale som papir shredding. Bruk sengetøy som består av makulert korn cobs eller tre barbering, og sikre at sengetøy endres regelmessig for sanitær.
- Gi tilgang til mat og vann ad libitum. Toppen av plast buret huser en mat hopper. Dispensere riktig formulert musen mat pellets fra mat hopper og gi en vannbeholder. Kontroller at de bur inneholder luftfilteret for å beskytte mus fra utenfor forurensninger.
- Opprettholde den naturlige biologiske rytmer av mus etter en 12-timers lys og mørke syklus i boliganlegget. Gjennomføre atferdsmessige testing på samme tid på dagen, helst under dyrets mørke syklus, som i løpet av kveldstimene.
Merk: Forsiktighet bør utvises skille mus i huset. Ulike metoder for skille mus er tilgjengelig, som øret slag, øret koder og hale markeringer.
2. Barnes labyrint Testing: konstruksjon
- Få en sirkulær treplate som er 120 cm i diameter.
- Klipp 20 runde hull (4,5 cm i diameter) rundt omkretsen av sirkelen. Plasser hvert hull skal 2,5 cm fra labyrint kanten og 13 cm fra nærliggende hull.
- Jevne ut overflatene og male dem skinnende hvit (en lys farge anbefales).
- Angi en side i labyrinten styret for innsetting av liten kopp kroker ca 2-3 cm fra 20 hull og plassere to kroker for hvert hull (en på hver side av hvert hull).
- Bruke grunne svart (plast) disker for å dekke hull på siden av labyrint med kroker. Bruk kroker for å sikre tykk gummi band for å holde diskene på bunnen av labyrinten.
- Sikkert montere Barnes labyrinten 120 cm over bakken og fra andre tilsvarende høye objekter som tabeller eller stoler. En avføring eller kan brukes til å støtte midten av labyrinten.
- Plass store hvite plakater med én figur på hver vegg (trekant, sirkel og kryss) som ekstra-labyrint signaler på 3 sider av labyrinten. Opprettholde plakater på veggene rundt i labyrinten for hvert forsøk.
- På siste side av labyrinten, sette opp en solid svart gardin skjule observatører slik at data kan registreres nøyaktig uten forskerne blir synlig for mus på labyrinten.
- Suspendere en video kamera over arenaen med et fugleperspektiv over hele labyrint overflaten.
- Rengjør hver overflate labyrinten (svart disker og mål-boksen inkludert) med vann da en 70% etanol løsning før og etter hver musen prøve.
- Plasser en 100 W lyskilde 25 cm over midten av labyrinten (slå av/på på start og mål for rettssaken) og sørg for å ha disker og kroker mot gulvet.
Merk: Alle andre indirekte lys i rommet bør være deaktivert under testing. Tillegg av en ultralyd støy-maker hang ved 100 M lys anbefales. Slå den av/på på start og mål for hvert forsøk.
3. Barnes labyrint Testing: prosedyre
Merk: Kontroller at alle labyrint komponentene rengjøres med vann og 70% etanol løsning før og etter hvert forsøk, slik at for tid til å tørke før testing igjen. Vær sikker på har rengjøring forsyninger klar samt tidtakere for forsøkene.
- Huset alle mus i grupper ved bruk av en pålitelig metode. Hold mus utenfor testing rommet når de ikke aktivt kjører på labyrinten. Dette er å sikre de ikke utsettes for den ultrasoniske noisemaker for tidlig.
- Håndtere mus ved å forsiktig plukke opp og holde dem fra bunnen av halen, med labber på en hånd.
- For trening, har du mus kjører på labyrinten daglig én gang per dag i 7 dager på rad for å vurdere læring/kjøp.
Merk: En enkelt langsiktige prøveversjon kan gjøres på et senere tidspunkt å vurdere minne/oppbevaring. Gjeldende protokollen utdannet ungdom mus begynner på postnatal dag 32 og en langsiktig rettssak ble utført i voksne på 4 måneder av alderen. - Tilfeldig tilordne hver musen til målet hull skal brukes i tester periode. Hullene kan merkes 1-20 på bunnen av labyrinten eller på utsiden av labyrinten omkrets, der de ikke er synlige for musen i labyrinten.
- Erstatt tildelte hull disken med en liten svart boks (23 x 11 cm). Feste det til Barnes labyrinten med gummistrikk koblet til nærmeste krokene.
Merk: Mål-boksen er grunne nok slik at musen kan lett gå til det eller inneholder et trinn for å sikre at musen ikke har å hoppe ned i den. - Plass musen på midten av labyrinten under en kopp å acclimate i 30 sekunder til testen begynner. Start videoinnspilling.
- Slå på lyset og ultralyd noisemaker. Løft koppen via en streng mekanisme for å unngå biasing første overskriften av dyret. Starter en tidtaker og sitte bak forhenget å observere.
- Etter musen inn målet hullet, dekket hullet med samme ugjennomsiktig cup brukes ved starten av rettssaken eller bindemiddel og deaktivere den ultrasoniske noisemaker. Hvis musen ikke har kommet målet etter 5 minutter har gått, innhegningen musen til målet hullet.
- Sikre musa går inn i hullet. Når musen er i mål-boksen, dekket hullet og slukke noisemaker. La musen for å forbli i mål-boksen i 1 minutt uforstyrret.
- Selv om målet hullet forblir konstant hvert musen hele opplæringen perioden, kjøre mus i tilfeldig rekkefølge hver dag for å sikre at de ikke følger noen signaler/dufter etter forrige musen.
4. Barnes labyrint Testing: Dataanalyse
- Under Barnes labyrint prøvelser posten tidsbestemt følgende data: total tid brukt på labyrinten, tid til å finne mål og tid til å angi målet hullet hvis målet er angitt.
- Spore overordnede musen for å bestemme antall feil (antall feil hull utforsket) før og etter målet er funnet. Også ta avstanden fra målet hullet til det første hullet utforsket (avstanden er målt i antall hull unna), sammen med noen bemerkelsesverdige grooming atferd.
- Spore bevegelsene til hvert dyr på et stykke papir med et diagram av labyrinten under hvert forsøk og bruke den til å analysere strategier, samt bestemme antall hull som ble undersøkt i kvadranten overfor målet. Bruk videoanalyse for å bekrefte banene.
5. jomfru-i-nød Testing: konstruere tilbakeholdenhet kammeret
- Kuttet en klart sylinder til en lengde lik ¾ av lengden på kvinnelige musen fra bunnen av halen til nesen. Kontroller at sylinderen er slik at musen plassert inne ikke snu.
Merk: Vi kuttet membran slutten av en 50 mL konisk rør nedover en 4 cm lange rør for 1-måned gamle mus og en 8 cm lange rør for 4 måneder gammel mus. - Cap begge ender av sylinderen slik at en av caps kan fjernet og reattached. 3-4 hull, ca 0,5 cm hver, i hver cap. Kontroller at hullene er stor nok til å tillate nese-rørende mellom mus og puste12.
Merk: Alternativt en enhet for musen tilbakeholdenhet under blod samling kan brukes.
6. jomfru-i-nød Testing: forbereder Arena
- Kontroller at arena er en ugjennomsiktig toppløs plast firkantet boks på 38 x 38 cm med 19 cm vegger. Fylle den jevnt med mais sengetøy til en høyde på ca 2,5 cm.
Merk: Corncob sengetøy gjør graving hendelser lettere å oppdage. - Suspendere en video kamera over arenaen slik at hele arena er i sikte.
7. jomfru-i-nød Testing: utforskende opptreden mål
- Plass lukket og tom stress kammeret i midten av arenaen.
- Begynn med suspendert kameraet.
- Velg en mannlig mus. Hvis mus er merket for identifikasjon, Merk denne mannlige identitet; Hvis ikke, merke denne musen slik at den kan skilles etter retur til buret.
- Forsiktig plassere mannlige musen under en kopp nederst i venstre hjørne i arena. Etter 30 sekunder, fjerne koppen via en streng mekanisme.
- Lar musen å utforske for 10 min, ta vare for å bo ut av sitt utsyn under opptak. På slutten av 10 min, fjerne musen fra arena og returnere det til en holde bur for de neste 5 min12.
- Stoppe innspillingen, og lagre videofilen med en identifikator.
8. jomfru-i-nød Testing: sosiale respons mål
- Bruk samme arena og opptak oppsett som utforskende opptreden mål.
- Velg en kvinnelig mus. Hvis mus er merket for identifikasjon, Merk denne kvinnens identitet; Hvis ikke, merke denne musen slik at den kan skilles etter den returneres til buret.
Merk: En littermate, bur kompis eller romanen musen kan brukes, avhengig av problemet. Hvis flere forsøk blir utført, opprettholde relasjonstypen over alle forsøk. - Hold kvinnelige musen forsiktig ved foten av halen eller halsen tvang, om nødvendig, og senk det i tilbakeholdenhet kammeret. Lukke den åpne enden bak og sikre ikke å snu.
Merk: Vurdere iført bitesikker hansker, kvinnelige musen blir motstandsdyktig mot inn i tilbakeholdenhet kammeret. - Begynn med suspendert kameraet.
- Plasser til tilbakeholdenhet kammeret fanget kvinnelige musen inne i midten av empati arena og tillate kvinner å acclimate i 10 min. Ta vare for å forbli ut av kvinnens synsfelt.
- Etter kvinnelige musen har blitt i tilbakeholdenhet kammeret i 5 min, plassere merket mannlige musen tilbake i empati arena ved hjelp av samme prosess som før. Tillate mannlige musen en ekstra 5 min å utforske arena, igjen å ta vare for å forbli ut av synsfeltet av mus.
- Stoppe innspillingen, og lagre videofilen med en identifikator.
- På slutten av 5 min, fjerne begge musene fra arena og plassere dem i deres burene. Erstatt korn sengetøy og rense både arenaen og stress chamber med 70% etanol12.
9. jomfru-i-nød Testing: dataanalyse
- Sporing kan brukes, men videoen kan også analyseres manuelt. Når videofilen er synlige på datamaskinen, overlappe en gjennomsiktig ark over skjermen og skissere kvadratet av arenaen med en markør. Del torget arena i ni like avdelinger.
- Se video dataene for den første 5 min av første utforskende tiltaket. Registrere rom krysset (locomotor aktivitet/utforskende atferd), tid brukt i sentrum for den arena (åpen aversjon), grave og grooming episoder og antall ganger musen rørte den tomme center tilbakeholdenhet kammeret.
Merk: Scoring er ikke gjort for andre 5 min hannens 10 minutters første leting, heller for 10 min kvinnelige er fanget i sentrale kammer i fravær av mannlige. - Dataen video for 5 min av sosiale respons tiltaket umiddelbart etter hannen er gjeninnføres inn i arena med fanget kvinnelige. Spille inn de samme dataene som den opprinnelige utforskende mål, men i tillegg registrere antall ganger mannlige musen rørt nesen med fanget kvinnelige musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Barnes labyrinten
For å illustrere hvordan Barnes labyrinten kan brukes, undersøkt vi om en enkelt tidlig etanol eksponering forårsaket en forskjell i å lære i løpet av musen utvikling. C57Bl6/J mus ble enten injisert med en 2.5 g/kg etanol løsning (n = 8) eller med saltvann (n = 6) to ganger to timer fra hverandre, på postnatal dag 6. Vi trente dyrene på Barnes labyrinten i ungdomsårene (P30), og deretter utføres en enkelt langsiktige rettssak i voksen alder (4 måneder). Våre innsamlede data kan deles inn i flere hovedkategorier: 1) nøyaktigheten av tid og feil, 2) mål inngang og 3) kartlegging leting banen.
Nøyaktigheten av tid og feil:
Tidsmålinger omfatter flere viktige aspekter: ventetiden å nå det første hullet (tiden det tar for musen for å undersøke noen første hullet etter rettssaken) illustrerer Hvis musen er å lære at det skal gå finne escape hull ( Figur 1A). Ventetiden å finne målet hullet (scoret av en innledende senking av nesen over flyet av målet hullet) er kjøpedyktig finner riktig hullet (figur 1B). Med hver økt, bør tid til å kjøre treningsøkten redusere, som indikerer at dyrene lærer labyrinten.
Antall feil hull undersøkelser (betegnes feil) musen utfører før finne riktig hullet (figur 1 c) angir om dyret er kjøpedyktig gå relativt rett til målet escape hullet. Totalt antall ganger en mus utforsker en feil hull i løpet av rettssaken gir et enkle mål på locomotor aktivitet og utforskende atferd. (Figur 1 d). Alle mus var med hell trent på Barnes labyrinten over en 7-dagers testperiode i ungdomsårene (her representert ved daglig økter på postnatal dager 32-39), angitt av en nedgang i feil og tid å finne målet hullet. Det var ingen statistisk forskjell i læring mellom etanol og kontroll dyrene i løpet av opplæringen perioden.
Målet oppføring pris:
Ventetiden å faktisk gå inn målet hullet er ofte brukt som vilkår for vellykket labyrint ferdigstillelse, men sannsynligvis gir ikke så mye informasjon som andre aspekter av testing. Inntreden i målet kan også være scoret som 0 eller 1. Hvis musen inn i målet før 5 min gå, testing anses vellykket, men hvis musen ikke inn målet, en dokumentordner eller boken bør brukes til corral dyret i målet så opplever at kammeret under. På de første dagene, bør det forventes å se lave priser for innreise i målet og dyr som tar i sin helhet 5 minuttene på labyrinten. I senere dager, skal testing ta mindre tid.
Gjør flere feil når målet angir lav motivasjon til å angi mål-boksen, og kan også detektere unormal komfort med en situasjon som er vanligvis aversive til mus (opphøyd plattform, lys lys, åpne felt, ultralyd støy). En stor forskjell mellom feil gjort før målet og antall hull undersøkelser under et prøveabonnement angir dårlig motivasjon for å angi målet escape kammeret (figur 2A). Hvis mus ikke er inn målet escape hullet etter oppdagelsen, kan sterkt lys eller støy legges til testing situasjonen som mildt skadelige stimuli.
I vårt eksperiment lagt en ultralyd støy sender over labyrinten på test-dagen 5 å innføre ekstra motivasjon til å angi målet. Før innføringen av ultralyd støy, hadde ingen saltvann behandlet mus angitt målet, men innganger piggete etter innføringen av støy. Betydelig mer mus (saltvann og etanol kombinert) angitt mål på prøve 6 forhold til rettssaken 4 (t-test, p = 0.0014) (figur 2B).
Banen kartlegging:
Tilordne banen til musen kan hjelpe vurdere informasjon oppbevaring og innlæring strategisk, også. Avstanden mellom det første utforskede hullet og målet hullet er en god indikator på minne for målplassering, som denne spor hvor musen går først og hvor tett de er til målet (figur 3A). Forventer dette tiltaket varierer svært mye i begynnelsen av trening, men det første hullet besøkte bør flytte nærmere målet som mus lære målplasseringen.
Selv om ingen statistisk forskjell i læring funnet mellom etanol og kontroll dyrene i løpet av opplæringen perioden, når disse musene re kjøres som voksne benytter en enkelt langsiktige prøve (på 4 måneder), hatt etanol-injisert dyrene vanskeligere husker hvor målet hullet lå (figur 3B)12. Denne forskjellen i minnet oppbevaring ble ikke funnet i første Barnes labyrinten opplæring, bruk labyrinten igjen på et senere tidspunkt tillatt oss for å plukke opp små forskjeller i læring/minne, som finnes med en enkelt utviklingsmessige etanol rus hendelse. En representant diagram av Barnes labyrint overflate gjør forskere til å tilordne banen musen tok, inkludert antall feil og en oversikt over det første hullet besøkte (Figur 3 c).
Tid brukt i motsatt kvadranten tilsvarer tiden mus utforsker en del av labyrinten over andre, spesielt en motsatt av målet. Det er mulig for en forsker skaffer og beregne alle andre tiltak som musen kjører labyrinten, men dette målet krever analyse senere. En mus som lærer bør redusere tidsbruk utforske hull i motsatt kvadranten. På den langsiktige voksen rettssaken, etanol behandles mus utforsket betydelig flere hull i motsatt kvadranten fra målet, som indikerer en feil å huske den riktige generelle romlige plasseringen (p = 0,03) (figur 4A).
Det er viktig å bryte opp denne tilordningen målinger i feil gjort før og etter faktisk finne målet. Antall feil før målet kan avsløre om læring skjer, men det også kan fortelle oss om musen er strategi. I stedet for tilfeldig besøke hull, kan musen vedta en strategi for å raskt finne målet. Under langsiktige rettssaken, brukes alle dyrene etanol-behandlet en sekvensiell hull-til-hulls søk i en ringformede mote til hullet ble funnet, mens betydelig mindre saline behandlet mus ansatt denne teknikken (p = 0.004) (figur 4B og 4 D). Mus kan også målrette en retning av labyrinten (figur 4C), som indikerer at romlig læring skjer og dyret vil trolig bruke eksterne signaler til hodet for nærheten av målet hullet.
Jomfru i nød
Jomfru-i-nød arenaen ble bygget og brukt til å teste utforskende og sosiale atferden til C57Bl6/J mus på begge 1M (n = 15) og 4M (n = 12) alder. En empati arena ble benyttet der mannlige musen plassert i et hjørne (figur 5A). Utforskende museinnstillinger er kvantifisert som antall ruter krysset i 5 min i romanen arena. Våre resultater viser at eldre mus (4 mnd) krysser flere felt enn yngre mus (1 måned) (p < 0,0001) (figur 5B).
Deretter ble fanget kvinnelige plassert i en sylinder i arenaen (figur 5A). Når hunnen er fanget i kammeret, kvantifiseres utforskende oppførsel igjen som antall ruter krysset. Tilstedeværelsen av fanget kvinnelige påvirker mannlig utforskende adferd. Uansett alder utforske mannlige mus mindre i nærvær av en fanget kvinne. Unge menn utforsket arena mindre (målt etter antall ruter krysset i nærvær av en fanget kvinnelig mus enn når alene (på en måned: t-test, p = 0,001; mener mann alene 46 ± 4.34 firkanter vs med kvinnelige 26.13 ± 3.42 ruter). Denne forskjellen var også tydelig hos voksne (på 4 måneder: t-test, p < 0.000001, mener mann alene 151.5 ± 5.31 rutene vs med kvinnelige 103.08 ± 0.3.59 ruter) (figur 5B).
Dessuten, bør hvor mye tid en mus i den midtre firkanten over en 5-minutters periode også vurderes. Tid brukt i sentrum torget skal sammenlignes i tilstedeværelse og fravær av kvinnelige som et mål på sosiale interesse. Våre resultater viser at menn bruker mer tid i midten torget i nærvær av fanget kvinnelige. Unge menn brukte mer tid på å utforske sentrum av arenaen i nærvær av en fanget kvinnelig mus enn når alene (på en måned: p = 0,05, mener mannlige alene 13.14 ± 2.79 s vs kvinnelige 33.42 ± 9.32 s). Denne forskjellen ble også sett hos voksne (på 4 måneder: p = 0,001; mener mannlige alene 14.80 ± 1.89 s vs kvinnelige 52.87 ± 8,9 s) (figur 5C).
I tillegg bør forskere også kvantifisere antall graving hendelser i arena, som kan være et mål for angst eller Piezo2 mot den fangede kvinnelige. Dette tiltaket var signifikant forskjellig i nærvær av kvinnelige for 1 måned (1 M) mus men 4 måneders (4 M) mus. Unge menn tilbrakte mer tid graving under sin tid i arena i nærvær av en fanget kvinnelig mus enn når alene (på en måned: p = 0,027; mener mannlige alene 0,4 ± 0,27 ganger vs med kvinnelige 3,2 ± 1.09 ganger). Denne forskjellen ble ikke sett på voksne (på 4 måneder: p = 0,65; mener mann alene 1,33 ± 0.54 ganger vs. med kvinnelige 1 ± 0.49 ganger) (figur 5 d).
Antall ganger en mannlig berører tilbakeholdenhet kammeret som inneholder fanget kvinnelige og antall ganger dyrene rørt nesen gjennom luft hullene er tiltak av Piezo2. I resultatene, mannlige mus rørt røret som inneholder fanget kvinnelige betydelig oftere som voksne (4 måneder) enn som yngel (1 måned) (p = 0,00001; bety 1 måned 4.73 ± 0,95 ganger vs. 4 måneder 15.92 ± 1.64 tider) (figur 5E). Voksne menn også startet mer fanget kvinnelige kontakt hendelser. Mannlige mus rørt nesen med det fangede kvinnen gjennom luft hullene betydelig oftere som voksne (4 måneder) enn som yngel (1 måned) (p = 0,002; bety 1 måned 3.93 ± 1 ganger vs 4 måneder 8.67 ±.94 tider). (Figur 5F).
Ultralyd opptaksutstyr ble brukt til å lytte etter ultralyd vocalizations over 20 kHz av kvinnelige mus, og det ble også brukt til å lytte etter ultralyd vocalizations av fanget mannlige mus i en "bachelor-i-nød" reversering paradigmet. Ingen vocalizations ble oppdaget i hver situasjon, som er som forventet siden tidligere undersøkelser fant ingen ultralyd vocalizations mus under aversive stimuli eksponering (som fysisk selvbeherskelse eller elektrisk støt)11.
Figur 1 : Barnes labyrint nøyaktighet representant resultater av tid og feil. Mus ble enten injisert med en 2.5 g/kg etanol løsning eller saltvann to ganger to timer fra hverandre på postnatal dag 6. Vi trente dyrene én gang daglig for 7 dager i ungdomsårene, så utføres en enkelt langsiktige rettssak i voksenlivet11. (A) ventetiden å nå den første hull (tiden det tar for musen for å undersøke noen første hullet etter rettssaken) avslører Hvis musen er å lære å finne escape hullet. (B) ventetiden å finne målet hullet (scoret av en innledende senking av nesen over flyet av målet hullet) er kjøpedyktig finner riktig hullet. (C) antall feil hull undersøkelser (betegnes feil) musen gjør før finne riktig hullet angir om dyret er kjøpedyktig gå relativt rett til målet escape hullet. (D) totalen antall ganger en mus utforsker en feil hull i løpet av rettssaken gir et enkle mål på locomotor aktivitet og utforskende atferd. Feilfelt representerer SEM11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Vellykket Barnes labyrint fullført. Ventetid å faktisk gå inn målet hullet er ofte brukt som vilkår for vellykket labyrint ferdigstillelse, men dyr kan ikke angi målet hullet etter oppdagelsen. (A) A forskjellen mellom feil gjort før finne målet og antall hull undersøkelser under et prøveabonnement angir dårlig motivasjon for å angi målet escape kammeret. I vårt eksperiment, ble en ultralyd støy lagt på prøve 5 å indusere mus inn målet. (B) betydelig mer mus (saltvann og etanol kombinert) angitt mål på prøve 6 forhold til rettssaken 4 (t-test, p = 0.0014). Ingen etanol mus holdt å utforske etter å finne målet av dag 7. Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Barnes labyrint motivasjon. Tilordne musen baner kan gi informasjon om motivasjon. (A) avstanden mellom det første utforskede hullet og målet hullet er en god indikator minne for målplassering, som denne mål spor hvor musen går først og hvor langt de er fra målet. (B) selv om ingen statistisk forskjell i læring funnet mellom etanol og kontroll dyrene i løpet av opplæringen perioden, når disse musene re kjøres som voksne benytter en enkelt langsiktige prøve (på 4 måneder), etanol-injisert dyrene hadde en vanskeligere tid å huske hvor målet hullet var plassert. (C) en representant diagram av Barnes labyrint overflate gjør forskere til å tilordne banen musen tok, inkludert antall feil og en oversikt over det første hullet besøkte. Denne musen gikk rett til målet innen 16 sekunder, men aldri angitt det i løpet av 5 minutter og utforsket 41 hull etterpå. Dette angir lav motivasjon for å angi målet. Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Barnes labyrint strategi. Tilordne musen baner kan avdekke strategier og gi informasjon om læring strategi. (A) på den langsiktige voksen rettssaken, etanol behandles mus utforsket betydelig flere hull i motsatt kvadranten fra målet, som indikerer en feil å huske den riktige generelle romlige plasseringen (* p = 0,03). (B) under langsiktige rettssaken, brukes alle dyrene etanol-behandlet en sekvensiell hull-til-hulls søk i en ringformede mote til hullet ble funnet, mens betydelig mindre saltkildene behandlet mus ansatt denne teknikken (** p = 0.004) (B D). Prøve dag 6 resultater er avbildet i en (C) saline behandlet mus og (D) etanol behandlet mus. Mus kan målrette en retning av labyrinten (C), som indikerer at romlig læring skjer og dyret vil trolig bruke eksterne signaler til hodet for nærheten av målet hullet. Kvadrant score er vanligvis mye bedre for mus benytter denne strategien. (D) sekvensiell hull-til-hullet søk er en ring strategi, der musen går til en kant av labyrinten og ser i hvert hull å finne målet. Kvadrant score er dårlig med stor variasjon når mus bruker ring strategien. Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Pike-i-nød. (A) jomfru-i-nød arena er delt inn i 9 firkanter. Mannlige musen er plassert i et hjørne og mannlig adferd er observert. Kvinnelige musen, fanget i en sylinder beholder, plasseres i den sentrale plassen arenaen. (B) utforskende atferd i Vikingskipet øker mellom ungdomsårene (1 måned = 1 M) og voksen (4 måneder = 4 M). Samlet, mannlige mus utforsket mindre i nærvær av en fanget kvinne. I tillegg, juvenile mus utforsket mindre enn voksne mus i nærvær av fanget kvinnelige. (C) sosiale respons kan også måles når musen tilbringer i sentrum torget hvor fanget musen holdes. Både unge og voksne menn brukte mer tid i midten torget i nærvær av fanget kvinnelige. (D) unge menn tilbrakte mer tid graving under sin tid i arena i nærvær av en fanget kvinnelig mus enn når alene. (E) mannlige mus rørt røret som inneholder fanget kvinnelige betydelig oftere som voksne enn som yngel. (F) voksne hanner innledet også mer fanget kvinnelige kontakt hendelser enn yngel. Feilfelt representerer SEM (*** p < 0,0001, ** p 0,001, * p 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Barnes labyrinten og jomfru-i-nød eksperimenter er billig, rask og relativt lett måter å evaluere romlige læring, locomotor aktivitet og Piezo2 i mus. Andre fordeler inkluderer fravær av utilslørt stressorer, smerte eller maten begrensningen for dyret. Som de fleste læring/minne paradigmer er en ulempe av Barnes labyrinten antall forsøk kreves for dyr å lære hvor målet hullet ligger og angi.
Datainnsamling:
Data skal være konsekvent samlet da observere musen er aktiviteter og atferd i begge paradigmer. For Barnes labyrinten inkluderer dette tidsregistreringen det første hullet er nådd, antall feil/feil hull den Utforsker, tiden der det når målet hullet, og tiden som den kommer inn målet hullet. I tillegg bør forskere tilordne banen til hver musen på labyrinten. Data kan spores ved hjelp av et kart av Barnes labyrinten samtidig som musen kjører labyrinten og timing og hull tallene kan være bekreftet bruker video-opptakene. Når sporing dyr, kan det være nyttig å endre pennefarger en gang hvert minutt å holde styr på potensielt overlappende hull undersøkelser. Computer-assistert sporingssystemer er tilgjengelig for å sikre nøyaktighet og pålitelighet, som idTracker, Ctrax eller tracktor, og noen er gratis eller åpen kildekode.
For Pike-i-nød analysen, bør registrerte data omfatte hvor mange firkanter mannlige inn, tiden det tar for den mannlige å nå kvinnelige, hvor mye tid mannlige bruker i sentrum torget når fanget kvinnelige sammenlignet med bare tomme sylinderen , hvor mange kontakt hendelser der er med sylinderen, antall ganger dyr berørt nesen gjennom kammeret, og hvor mange ganger graving hendelser skjedde generelt og i midten torget.
Konstanter i atferdsdata testing:
Som med alle opptreden tester, er det avgjørende at forholdene holdes konstant mellom og dyr forsøk å sikre at miljøvariabler ikke forvirre resultatene av studien. Visuell, auditiv eller olfactory stimuli i eksperimentell miljøet kan føre til atferdsendringer i mus, om beregnet eller ikke13. Slik bør forsiktighet utvises å skjerme musene distraherende eksterne stimuli14. Både arenaen brukes til jomfru-i-nød scenariet og Barnes labyrinten burde være renset etter hver prøve med vann og renovert med 70% etanol slik at ingen langvarig indikatorer tidligere mus påvirke en senere rettssak. I tillegg bør sengetøy endres etter hver jomfru-i-nød analysen. Datainnsamling skal alltid registreres på video å tillate forskere å gjennomgå dataene og sikre nøyaktig analyse. Det kan være en utfordring for forskeren forblir skjult bak en gardin eller ellers ute av syne mens samle dataene, men dette er viktig å opprettholde en konstant, distraction-ledig setting for mus.
Barnes labyrint paradigme design og modifikasjoner:
Det er flere publiserte paradigmer i bruk for Barnes labyrinten. Barnes labyrint trening protokoller vanligvis varierer fra 7-15 dager, men protokollen kan forkortes. Noen ganger avkorte antall økter å lære oppgaven vanskeligere kan isolere forskjeller at lengre protokoller savner15. Den kan brukes med bare en overhead lys (som i den opprinnelige Barnes studien), eller andre elementer kan legges (for eksempel en lysere lys, en fan eller støy) for å gjøre mus mer motivert til å angi de flykte chamber3,16. Hvis du observerer dårlig motivasjon til å angi mål-boksen under en pilotstudie, anses tillegg av disse elementene under den faktiske treningen.
Inntreden i riktig målet hullet vil sannsynligvis oppstå mindre raskt uten disse elementene, men forskere bør være klar over at disse tilleggene kan være stress-inducing stimuli. Tilstedeværelse eller fravær av aversive stimuli kan manipuleres for å vurdere motivasjon for å angi målet hullet. Vår studie viste at prenatal etanol hatt en effekt på sannsynligheten for at en mus ville inn escape hullet under opplæringen perioden da bare sterkt lys ble brukt, og dette fenomenet var forskjellig fra faktisk lære der målet hullet ble plassert.
Som sett i dager 1-4 av våre protokollen, var mus ikke veldig motivert til å angi hullet, om de syntes å finner det lett nok. Men når ultralyd støy ble plassert over labyrinten på dag 5, score forbedret på de fleste Barnes tiltak, inkludert sannsynligheten at mus angi målet kammeret etter å finne den. Støy syntes å dramatisk redusere antall overflødig hull undersøkelser på prøve dag 6 og 7, og dag 7 ingen etanol mus holdt utforske etter å finne målet (figur 2A). Om det er mulig Dette er en naturlig konsekvens av læring labyrinten, dyrene vises mer opphisset etter innføringen av ultralyd støy og mindre sannsynlighet for å utforske labyrinten. At kammeret å være en givende situasjon for mus, forskerne må også være forsiktig med å deaktivere aversive stimuli (dekket hullet og slå av støy) og tillate dyr å forbli uforstyrret i chamber for den tildelte utvinning tid før dyret.
Utformingen av Barnes labyrinten kan ha innvirkning på læring og hukommelse vurdering. Gjeldende protokollen bruker ekstra-labyrint stikkord. I tillegg til asymmetri av testing rommet, ble plakater av fire enkle svart-på-hvitt-bakgrunn figurer (square, trekant, sirkel, kryss) montert på veggene i rommet som visuelle stikkord. Barnes labyrinten kan løses med eller uten den distale signaler på veggene i den testing rom eller kan løses ved hjelp av en seriell strategi. Derfor overser bruker bare en "første hullet avstand fra målet" måling relevante forskjeller i måten musen løser labyrinten og kan ikke skille romlige ikke-romlige evner17. Flere analyse tiltak bør brukes som også undersøke antall hull utforsket i motsatt firkant eller antall feil før målet. Mønsteret av strategi kan også analyseres.
Ulike innavlet stammer mus kan ha variabel ytelse på Barnes labyrinten, muligens på grunn av forskjeller i synsskarphet. Hvis en stamme av mus med dårlig synsskarphet velges for bruk i Barnes labyrinten, kan tillegg av en liten vegg rundt kanten av labyrinten øke thigmotaxis (vegg-hugging atferd) og øke bruken av en ikke-visuell strategi. Menn hadde lære bedre ytelse enn kvinner i DBA/2J og C3H/HeJ stammer, og selv om bare menn ble brukt i gjeldende protokollen, C57/Bl6 mus har ikke blitt funnet for å vise Kjønnsforskjeller i minnet på Barnes labyrint18.
Jomfru i nød paradigme design og modifikasjoner:
For Pike-i-nød eksperimentet er en stor begrensning at det er ingen måte for utforskende musen til gratis kvinnelige musen eller "jomfru," fra tuben midt på arenaen. Omstruktureringen kammeret inneholder en release mechanism ville være en interessant fremtidig endring. En ulempe ved jomfru-i-nød er fravær av komparative studier bruker paradigmet, som det er en ny vurdering for å måle Piezo2.
Jomfru-i-nød kunne bli ytterligere endret for å vurdere omgjengelighet (definert som tilbøyelighet til å tilbringe tid med en annen mus), preferanse for sosiale nyheten (tilbøyelighet til å undersøke romanen mus sammenlignet med en kjent mus), mating eller aggressiv atferd (fangst en kvinne i estrus eller en roman mann i chamber) og evolusjonsbiologi problemer, for eksempel virkningen av delt genetisk bakgrunn på altruistiske oppførsel tendenser (svaret en fanget littermate sammenlignet med en fanget ikke-littermate mus)19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi på Hampden-Sydney College gi anerkjennelse og takknemlighet til Sean Walden, Zach Leitner, Hunter Lee og Anton Kheirani for deres engasjement i testing protokoller for Barnes labyrinten og jomfru-i-nød eksperimenter. Vi vil også gjerne takke James Foster på Randolph-Macon College for bygging av Barnes labyrinten og Randolph-Macon College Institutt for biologi for å gi testing plass.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Damsel-in-Distress | |||
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Any brand of 50 mL conical tube will work |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| hammer | Grainger | 6R252 | Any standard hammer will work |
| nail (size 8D) | Grainger | 4NFE3 | Similarly-sized nails should work just as well |
| opaque, topless plastic box | AcmePlastics | CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025 | Opaque plastic, cut to size (30 cm L x 19 cm W x 3-6 cm H). Step may be added to ensure no more than a 3.5 cm entrance depth for the mouse. |
| video camera (smartphone) | N/A | N/A | Any camera-equipped smartphone will work |
| bite-resistant gloves | Kent Scientific | GLVDYN02 | Any brand offering appropriate protection |
| transparency sheet | Staples | 954145 | Any brand of clear plastic sheet will work, used for scoring |
| Barnes Maze | |||
| Petri Dishes | Corning | 353025 | Spray painted and used as covers for Barnes maze holes |
| Plywood (3/4 in.) | LP Building Products | 22487 | To construct Barnes maze |
| Spray Paint | Krylon | 1274937 | Used to paint petri dish caps black, white paint used to paint plywood |
| Cup Hooks (5/8 in.) | Ace Hardware | 5360615 | 2 used on either side of ventral hole surfaces; Rubber band wraps around hooks to hold cap flat |
| Poster Board | Creatology | n/a | Used at edges of maze as extra cues |
| Light Bulbs | Phillips | n/a | 100W light bulb, used to during the trials |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| Ultrasonic noisemaker | Victor mini PestChaser | M753SN | Used as aversive stimuli |
References
- Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Protocol Exchange. 2007, (2016).
- Vorhees, V., Williams, M. T. Assessing Spatial Learning and Memory in Rodents. ILAR Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 93 (1), 74-104 (1979).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behavioural Brain Research. 198 (1), 247-251 (2009).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 490 (2010).
- Bartal, I. B. A., Decety, J., Mason, P. Empathy and pro-social behavior in rats. Science. 334 (6061), 1427-1430 (2011).
- Langford, D. L., et al. Social modulation of pain as evidence for empathy in mice. Science. 312 (5782), 1967-1970 (2006).
- Smith, M. L., Hostetler, C. M., Heinricher, M. M., Ryabinin, A. E.
- Melia, K. R., Ryabinin, A. E., Schroeder, R., Bloom, F. E., Wilson, M. C. Induction and habituation of immediate early gene expression in rat brain by acute and repeated restraint stress. Journal of Neuroscience. 14 (10), 5929-5938 (1994).
- Watanabe, S. Empathy and reversed empathy of stress in mice. Public Library of Science (PloS) One. 6 (8), e23357 (2011).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (1), 28-34 (2007).
- Houlé, K., Abdi, M., Clabough, E. B. D. Acute ethanol exposure during late mouse neurodevelopment results in long term deficits in memory retrieval, but not in social responsiveness. Brain and Behavior. , (2017).
- Sales, G. D., Wilson, K. J., Spencer, K. E., Milligan, S. R. Environmental ultrasound in laboratories and animal houses: A possible cause for concern in the welfare and use of laboratory animals. Laboratory Animals. 22, 369-375 (1988).
- Crabbe, J. C., Walhsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: Interactions with laboratory environment. Science. 248, 1670-1672 (1999).
- Attar, A., Liu, T., Chan, W. T. C., Hayes, J., Nejad, M., Lei, K., Bitan, G. A shortened Barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PloS One. 8 (11), (2013).
- Inman-Wood, S. L., Williams, M. T., Morford, L. L., Vorhees, C. V. Effects of prenatal cocaine on Morris and Barnes maze tests of spatial learning and memory in the offspring of C57BL/6J mice. Neurotoxicology and Teratology. 22 (4), 547-557 (2000).
- Harrison, F. E., Reiserer, R. S., Tomarken, A. J., McDonald, M. P. Spatial and nonspatial escape strategies in the Barnes maze. Learning and Memory. 13 (6), 809-819 (2006).
- O'Leary, T. P., Savoie, V., Brown, R. E. Learning, memory and search strategies of inbred mouse strains with different visual abilities in the Barnes maze. Behavioural Brain Research. 216 (2), 531-542 (2011).
- Kaidanovich-Beilin, O., Lipina, T., Vukobradovic, I., Roder, J., Woodgett, J. R. Assessment of social interaction behaviors. Journal of Visualized Experiments. 48, (2011).
