Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zusammenfassung

Zebrafisch wurden als zuverlässige genetische Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung, vor allem mit dem Aufkommen von Gen-Bearbeitung Technologien verwendet. Wenn Larven Phänotypen zu erwarten sind, kann DNA-Extraktion und Genotyp Identifizierung schwierig sein. Hier beschreiben wir eine effiziente Genotypisierung Verfahren für zebrafischlarven durch Rute zuschneiden, so früh wie 72 h nach Befruchtung.

Zusammenfassung

Zebrafisch (Danio Rerio) besitzen Orthologe 84 % der Gene bekannt, um menschliche Krankheiten zugeordnet werden. Darüber hinaus diese Tiere haben eine kurze Generationszeit, sind leicht zu verarbeiten, zeigen eine hohe Fortpflanzungsrate, low-cost, und sind leicht zugänglich, genetische Manipulationen durch Mikroinjektion von DNA in Embryonen. Die jüngsten Fortschritte im Gen Bearbeitungstools ermöglichen präzise Einführung von Mutationen und transgene im Zebrafisch. Erkrankung oft im Zebrafisch Modellierung führt zu Larven Phänotypen und frühen Tod die schwierig sein kann, um zu interpretieren, wenn Genotypen unbekannt sind. Diese Früherkennung von Genotypen ist auch im Experimente erfordern Probe zu bündeln, wie z. B. Gen Ausdruck oder Mass Spectrometry Studien. Jedoch wird umfangreiche genotypischen Screening von den traditionellen Methoden begrenzt, die in den meisten Labors nur auf Erwachsene Zebrafisch oder im Post-mortem Larven durchgeführt werden. Wir haben dieses Problem durch Anpassung eine Methode zur Isolierung von PCR-Ready genomische DNA aus live zebrafischlarven, die so früh wie 72 h nach Befruchtung (hpf) erreicht werden kann. Diese Zeit- und kostengünstige Technik, verbesserte sich von einer zuvor veröffentlichten Genotypisierung-Protokoll ermöglicht die Identifikation von Genotypen aus mikroskopischen Fin Biopsien. Die Flossen regenerieren schnell wie die Larven entwickeln. Forscher können dann auswählen und die gewünschte Genotypen bis zum Erwachsenenalter durch die Nutzung dieser Hochdurchsatz-PCR-basierten Genotypisierung Verfahren zu erhöhen.

Einleitung

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) ist ein fest gefügten Organismus verbreitet als Modell für die Untersuchung der Krankheit sowie für präklinische Tests von therapeutische Hypothesen^1,2,3. Diese Tiere haben eine kurze Generationszeit, sind leicht zu verarbeiten, zeigen eine hohe Fortpflanzungsrate, low-cost und genetische Manipulationen durch Mikroinjektion von DNA in Embryonen⁴leicht zugänglich sind. Durch die zunehmende Entwicklung neuartiger transgener und gen Bearbeitung Technologien wie Zinkfinger-Nukleasen (ZFN)⁵, TAL-wie Effektor Nukleasen (TALENs)^6,7, und die gruppierten regelmäßig dazwischen kurz Palindromische wiederholt (CRISPR) / CRISPR-assoziierten 9 (Cas9) System⁸, dem Zebrafisch wird balanciert, um das Verständnis der verschiedenen pathologischen Bedingungen wesentlich zu verbessern. Diese Technologien wurden verwendet, um gezielte Knockouts in beiden somatische erstellen und Keimbahnzellen im Zebrafisch, effizient erzeugt genetisch modifiziert Tiere⁸. Jüngste Beispiele in der Literatur sind die erfolgreiche Entwicklung von genetischen Modellen von Epilepsie und Stoffwechselstörungen im Zebrafisch^3,9,10,11,12 .

Mit den Fortschritten im Zebrafish Genom-Bearbeitung ist schnelle und zuverlässige Genotypisierung eine unbestreitbare Bandbreitenbegrenzung Schritt geworden. Identifizierung von spezifischen DNA-Mutationen angrenzend an den vorhergesagten Erbgut Bearbeitung Zielstandort ist eine wichtige Etappe des Protokolls. Traditionell, sind Genotypisierung Techniken von Fin Clipping in der Regel nur bei Jugendlichen oder Erwachsenen Zebrafisch. Aber der Zeitaufwand erhöhen Zebrafisch bis zum Erwachsenenalter (> 2 Monate) Fortschritte in der Forschung erheblich verzögert. In vielen Fällen kann durch den Knockout der wesentlichen Gene (z. B. in der Krankheit Modellierung) oder Gain-of-Function-Mutationen führen zu schädlichen phänotypischen Auswirkungen Erwachsenenalter erreicht werden. Darüber hinaus mehrere Assays erfordern, Bündelung von Larven, z. B. in RNA oder Metaboliten Extraktion und beinhalten damit vorherige Identifizierung der Genotypen, die schwierig sein kann, wenn nur post-Hoc Genotyping Techniken verfügbar sind. Diese genannten Beispiele unterstreichen die Bedeutung der Larven Genotypisierung Techniken die zur gleichen Zeit präzise und vollständige Genesung und die normale Entwicklung der Larven zu ermöglichen. Frühen Stadium Zebrafisch Genotypisierung scheinen derzeit nicht am meisten benutzt sein; Dies spiegelt sich durch aktuelle Publikationen der Krankheitsmodelle in denen Larven Genotypen über Post-Mortem-Genotypisierung anstatt Genotypisierung vor der Ausführung des Experiments^12,13,14identifiziert werden. In diesem Papier ist eine Larven Fin Clip Strategie vorgestellt, mit dem Ziel, vorher festgelegten Genotypisierung Verfahren zu verbessern.

In der Vergangenheit Leben Strategien beschäftigen Proteinase K-Verdauung, Genotyp Zebrafisch, die Larven zu Variablen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Effizienz¹⁵geführt haben. Obwohl mehr vor kurzem mikroskopische Schweif Biopsie Technik zur Verfügung gestellt viel versprechende Ergebnisse¹⁶veröffentlicht, waren wir und andere Gruppen nicht in der Lage, die hohe Effizienz und DNA Wiederherstellung berichtet von den Autoren zu reproduzieren. Ein schwerer Rückschlag des Protokolls von Wilkinson Et Al. beschrieben ¹⁶ kann die Übertragung des Gewebes Heck mit dem PCR-Rohr. Aufgrund seiner mikroskopischen Größe ist es hart, um sicherzustellen, dass die Flosse wurde ordnungsgemäß gesammelt und durch pipettieren verzichtet. Um diese Barriere zu begegnen, haben wir eine verbesserte Protokoll für die Genotypisierung zahlreicher live zebrafischlarven mit fast 100 % Wirkungsgrad⁹entwickelt. Mit einer Microscalpel, die Fin Schwanzspitze entfernt und auf ein Stück Filterpapier gelegt. Das Stück Filterpapier mit dem Gewebe kann leicht visualisiert und in ein PCR-Röhrchen korrekt platziert. Genomische DNA-Extraktion erfolgt dann, gefolgt von PCR-Amplifikation der Region von Interesse zum Genotyp der Probe. Die Vorteile dieser Methode sind eine hohe Effizienz der PCR, einer niedrige false-positive-Rate und eine niedrige Sterblichkeitsrate. Darüber hinaus ist die Genotypisierung einer großen Anzahl von Embryonen möglich unter Verwendung dieses Protokolls. Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht Fin-Clipping von Hunderten von Larven innerhalb von 2-3 Stunden mit diesem Ansatz und korrekte Identifizierung der genotypisiert Fisch und Schweif Regeneration innerhalb von zwei Tagen.

Protokoll

Verfahren mit tierische Themen genehmigt worden und sind nach Tierbetreuung Richtlinien zur Verfügung gestellt von der Canadian Council Tier Pflege und der University of Ottawa Tierbetreuung Ausschüsse.

1. Vorbereitung

1. Bereiten Sie die Dissektion Oberfläche durch Abkleben 9 cm Petrischale Deckel mit Autoklav Band über seine innere Oberfläche. Positionieren Sie es unter dem Stereo-Mikroskop.
2. Legen Sie 3 bis 5 Tage nach Befruchtung (Dpf) zebrafischlarven in ein Petri-Schale und in ˜1.5 mM Tricaine in 1 x E3 Embryo Medien (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄, pH 7,2) zu betäuben.
3. Zum Jahresende ein P1000 PIPETTENSPITZE mit einem Paar der Schere oder einer Rasierklinge auf einen Durchmesser von 2 mm bis 3 Dpf Larve mit minimalem Stress Platz abgeschnitten.

2. Fin Clipping von Zebrafischlarven

1. Einem narkotisierten Larve mit der modifizierten P1000 Mikropipette abholen und legen der Zebrafisch-Larve auf das positionierte Autoklav-Band auf dem Deckel der Petrischale.
2. Entfernen Sie überschüssige Tricaine Lösung rund um die Larve mit einer Mikropipette. Das Gebiet sollte so trocken wie möglich, erfolgreich Abschnitt und holen die Flosse aber noch feucht ist, Überleben zu sichern.
3. Verwenden ein Mikro Skalpell, Abschnitt der Schwanzflosse unter dem Stereo-Mikroskop, wie in Abbildung 1angezeigt, wie im Wilkinson Et al.¹⁶beschrieben. Während die Inzision gelten Sie stetigen Druck innerhalb der Pigment-Baulücke der Schwanzflosse, distale bis an die Grenze der Durchblutung (Abbildung 1A). Üben Sie sanften Druck zur Vermeidung von Schäden der Chorda.
4. Visualisieren Sie die geschnittenen Flosse unter dem Mikroskop und positionieren Sie das Stück auf der Spitze der Microscalpel Klinge (Abbildung 2A). Legen Sie die Microscalpel mit der Flosse auf der Oberfläche von einem kleinen Stück Filterpapier.
   Hinweis: Aufgrund des Vorhandenseins von Melanozyten in der durchtrennten Gewebes ermöglicht diesen Schritt Visualisierung der Finne als kleiner schwarzer Fleck (Abb. 2 b).
5. Mit Schere und Pinzette (Abbildung 2), übertragen Sie das Filterpapier mit der Flosse, eine 96-Well-PCR-Platte, enthält 25 μL 50 mM NaOH Lösung pro Bohrloch (Abb. 2D).
6. Bereiten Sie eine flach-Boden-96-Well-Platte, Nummerierung des Brunnens nach dem Etikett der PCR Platte. Mit der veränderten P1000 Pipette gefüllt mit 200 µL frische 1 x E3 Embryo Medien, sorgfältig sammeln Sie die Zebrafisch-Larven mit leichtem Druck. Die Larve in der Gewebekultur 96-Well-Platte im gleich gut wie die PCR-Platte (Abb. 2E) Nummer zu verzichten.
7. Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier gut in der Lösung (Abbildung 2F) untergetaucht ist. Reinigen Sie die Klinge des Microscapel und Pinzette zwischen jedem Schnitt um Kreuzkontaminationen zu vermeiden durch Eintauchen in 70 % EtOH Lösung. Wischen Sie die Klinge mit sauberem Papier Gewebe/wischen.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.7, bis alle Embryonen abgeschnitten worden.
9. Speichern Sie die Larven in 96-Well-Platte bei 28 ° C, bis die Genotypen identifiziert wurden.
   Hinweis: Der Embryo Medien muss nicht geändert werden, da das Protokoll bequem in weniger als 2 Tagen abgeschlossen werden kann. Wenn mehr Zeit erforderlich ist, empfiehlt sich ein Medienwechsel.

(3) genomische DNA-Extraktion

1. Versiegeln Sie die 96-Well-PCR-Platte und Zentrifuge, die die Proben bei 1.000 x g für 1 min um sicherzustellen, dass alle Filterpapiere innerhalb der NaOH-Lösung getaucht werden.
2. Erwärmen Sie für Gewebe Lyse die Proben in einem Thermocycler bei 95 ° C für 5 min, gefolgt von Kühlung auf 4 ° C für 10 min.
3. Fügen Sie 6 μL von 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 zu jeder Probe. Vortex.
4. Zentrifugieren Sie kurz die Platte bei 1.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
5. Verwenden Sie 1,5 μl des Überstands DNA pro PCR-Reaktion.
6. Bereiten Sie einer PCR Genotyp der Larven, wie in Tabelle 1-2.
   Hinweis: Dieses Protokoll wurde für zwei Anwendungen getestet: multiplex-PCR-Reaktionen enthüllt den Genotyp mit Agarose Gele⁹und Heteroduplex schmelzen Assay (HMA) enthüllt die Genotypen mit Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)¹⁷.

4. alternative genomische Extraktion mittels eine Komplexbildner Harz

1. Komplette Schritt 2.5 indem Filterpapier mit beschnittenen Fin zu einer 96-Well-PCR-Platte mit 30 μl 5 % chelatisierenden Harz (Styrol-Divinylbenzene-Copolymeren mit gekoppelten Iminodiacetate-Ionen).
   Hinweis: Diese Art des Harzes wird häufig für Gewebe-Lyse und Vorbereitung von PCR-Ready DNA in eine schnelle und effiziente Weise¹⁸verwendet.
2. Führen Sie die Schritte 2.6-2.8, wie angegeben.
3. Verschließen Sie die 96-Well-PCR-Platte und kurz Zentrifugieren Sie die Proben um sicherzustellen, dass alle Filterpapier innerhalb der Komplexbildner Harz eingetaucht ist.
4. Erwärmen Sie für Gewebe Lyse die Proben in einem Thermocycler bei 95 ° C für 15 min, gefolgt von Kühlung auf 4 ° C für 10 min.
   Hinweis: In diesem Schritt können Lyse und anschließende Bindung von polar harzkügelchen, zellulären Komponenten, während DNA und RNA in Lösung bleiben.
5. Zentrifugieren Sie kurz die Proben um die harzkügelchen pellet und die DNA in der Suspension zu erhalten.
6. Führen Sie die Schritte 3,5-3,6, Genotypisierung Verfahren abzuschließen.

5. Anwendung 1: Multiplex-PCR, gefolgt von Agarose-Gel-Analyse

1. Nach Tabelle 1, Einrichten einer Multiplex-PCR-Reaktion ermöglicht die Unterscheidung zwischen reinerbigen Mutanten, Heterozygote und WT-Larven. Verwenden einer 96-Well-Thermocycler, PCR-Reaktionen mit den Radsport in Tabelle 3beschriebenen Bedingungen durchzuführen.
   Hinweis: Die PCR-Reaktionen können auch in jeder anderen konventionellen PCR Thermocycler durchgeführt werden. Dieses Beispiel beschreibt die PCR-Strategie von Pena, Et Al. verwendet ⁹ , aldh7a1 WT und 5-bp Einfügung mutierten Allele in der gleichen Multiplex-Reaktion zu identifizieren.
2. Bereiten Sie eine 1 % Agarosegel in Natrium-Borat-Puffer, befleckt mit 1 X GelRed.
   Hinweis: 20 x Natrium-Borat ausgleichslagers 40 mL 10 M NaOH, 1800 mL DdH₂O, pH 8,5 mit 76 g Borsäure angepasst und anschließend zu 2 L Endvolumen mit DdH₂O. besteht aus
3. Führen Sie das Gel in 1 X Natrium-Borat-Puffer für 15 min bei 250 V. Um den Prozess zu erleichtern, verwenden Sie nach Möglichkeit ein Gel-System, das kompatibel mit Multichannel-mehrkanalpipette zu höheren Durchsatz ermöglichen durch die Reduzierung der Zeit zum Proben zu laden ist.
4. Bild das Gel unter ultraviolettem (UV) Licht um Diskriminierung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen.

6. Anwendung 2: Heteroduplex schmelzen Assay

1. Bereiten Sie Seite 12 % Gele mit 1,5 mm Spacer Platte und die 15-Proben Kämme. Bereiten Sie zwei Seite-Gele mit 12,21 mL DdH₂O, 2,52 mL 10 x Tris/Borat/EDTA (TBE), 10 mL 30 % Acrylamid, 250 μl 10 % Ammonium Bleichen (APS) und 20 μL der Tetramethylethylenediamine (TEMED). Verwenden Sie 1 X TBE-Puffer (0,089 M Tris-HCl, 0,089 M Borsäure und 0,002 M Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)) als Puffer ausgeführt.
2. Erhitzen Sie die PCR-Produkte bei 94 ° C für 5 min.
3. Cool die Rohre auf Eis oder in den Thermocycler für 10 min bei 4 ° C.
4. Last 10 μL pro PCR Probe und 8 μl Molekulargewicht Marker.
5. Führen Sie die Seite 150 V 1 x TBE mit einem vertikalen Elektrophorese-System für 1 h oder bis das Molekulargewicht Marker fast erreicht die Linie der Glasplatte.
6. Bild das Gel unter UV-Licht zur Diskriminierung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen.

Ergebnisse

Die Effizienz des Protokolls zeigte sich durch Genotypisierung der Nachzucht von einem heterozygoten Kreuz (aldh7a1^{+ / ot100}, hier dargestellt als aldh7a1^{+ /-}) ()Abbildung 3A- C)⁹. Die aldh7a1^ot100mutierten Allels hat eine 5-Basenpaaren (bp) Einfügung in die ersten kodierenden Exon der Zebrafisch- aldh7a1 -Gens, das führt zu Frameshif...

Diskussion

Gen Bearbeitungstools beschäftigt waren einzuführen genau Mutationen und transgene im Zebrafisch in den letzten Jahren^5,6,7,8. Wenn Sie Krankheit Modellierung im Zebrafisch durchführen, sind frühe Larven- oder juvenile Phänotypen oft^9,12,13,14beobachtet. Die hier vorg...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Petrischale	Corning	430167
Mikroskalpell	World Precision Instruments	500249
Stereomikroskop	Nikon	SMZ1500
Tricain/Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat	Sigma-Aldrich	E10521
96-Well-Gewebekulturplatte	Costar	3595
96-Well-PCR Teller	Fisher	14230232
NaOH	Fisher	S25548A
Tris-Basis	Sigma-Aldrich	T1503
NaCl	Fisher	BP358-10
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391
5% Chelex 100 Natriumform	Sigma-Aldrich	C7901
GelRed 1x	Biotium	41003
Borsäure	Sigma-Aldrich	B6768
Subzelle Modell 192 System	Bio-Rad
30 %ige Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5: 1	Bio-Rad
GoTaq Green Master Mix, 2X	Promega	M7123
Papiertücher (Kimwipes® Einwegwischer)	Sigma-Aldrich	Z188956
1kb-plus Molecylar Gewichtsmarker	Thermo Scientific	SM1343
Nukleasefreies Wasser	Sigma-Aldrich	W4502
Sub-Cell Modell 192 System (Hochdurchsatz-Agarose-Gel-System)	Bio-Rad
vertikales Gelelektrophoresesystem Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad