Methodenartikel

Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

DOI:

10.3791/58034

⸱

16. August 2018

 ,  , 
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Protokoll wollen wir beschreiben eine reproduzierbare Methode für Kombination dissoziiert menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet Neuronen und Astrozyten gemeinsam in 3D Kugel Kokulturen, pflegen diese Kugeln in den frei schwimmenden Bedingungen und anschließend Messung der synaptischen Schaltung Aktivität der Kugeln mit Immunoanalysis und multielectrode Array-Aufnahmen.

Zusammenfassung

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Ein Hindernis zum Verständnis, wie verschiedene Zelltypen und Signale an synaptischen Schaltung Funktion beitragen ist der Mangel an entsprechenden Modellen für das Studium des menschlichen Gehirns. Eine neue Technologie zur Behebung dieses Problems ist die Verwendung von drei dreidimensionale (3D) neuronalen Zellkulturen, "Organellen" oder "Sphäroide", für die dauerhafte Erhaltung der interzelluläre Wechselwirkungen einschließlich extrazellulärer Adhäsionsmoleküle bezeichnet. Diese Systeme sind jedoch zeitaufwendig und nicht systematisch erzeugt. Hier wir ausführlich eine Methode, um schnell und konsequent produzieren 3D Kokulturen von Neuronen und Astrozyten aus menschlicher pluripotenter Stammzellen. Erste, bereits differenzierte Astrozyten und neuronalen Vorläuferzellen sind getrennt gezählt. Als nächstes werden Zellen im Bereich Bildung kombiniert Gerichte mit einem Rho-Kinase-Inhibitor und in bestimmten Verhältnissen Sphären reproduzierbare Größe produzieren. Nach mehreren Wochen der Kultur als schwimmende Kugeln sind Kokulturen ("Asteroiden") schließlich für Immunostaining geschnitten oder überzogen auf multielectrode Arrays, synaptische Dichte und Stärke zu messen. Im Allgemeinen wird erwartet, dass dieses Protokoll neuronale 3D-Kugeln, die anzeigen Reife Zelltyp eingeschränkt Marker erzielt werden, funktionale Synapsen bilden und zeigen spontane synaptischen Netzwerkaktivität platzen. Dieses System ermöglicht zusammen, Drogen-Screening und Untersuchungen zu Mechanismen der Krankheit in einem geeigneteren Modell im Vergleich zu Monolayer-Kulturen.

Einleitung

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Astrozyten sind ein sehr reichlich glialen Zelltyp innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) mit einer Vielzahl von funktionalen Aufgaben über strukturelle Unterstützung. Astrozyten Beihilfen durch Sekretion von löslichen Synaptogenic Faktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) bei der Schaffung und Bündelung von Reifen Synapsen während Entwicklung1. Sie auch spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit und der Plastizität der Synapsen durch extrazelluläre Signal2,3,4,5, und tragen zur langfristigen Stabilität der homöostatischen Umgebungen durch Regulierung der extrazellulären Kalium sowie Glutamat und die Sekretion von Energie-Substrate und ATP6,7,8. Endlich, sie können dazu beitragen, Neurotransmission durch Beeinflussung der extrasynaptic Ströme9, und Aktivität durch andere Zelltypen wie die Förderung der Myelinisierung10indirekt beeinflussen können. Wichtig ist, weil zu viele Neurodevelopmental Syndrome und Erwachsenen Neuropathologie Anomalie oder Dysfunktion der Astrozyten führen kann, gibt es offensichtlich notwendig, damit eine verbesserte Astrozyten neben Neuronen innerhalb veränderter neuronaler Netze enthalten Modell der endogenen Gehirn Umwelt. Ein integraler Bestandteil Astrozyten ist ihre Fähigkeit, Form dynamischer Interaktion mit neuronalen Synapsen1,11,12. In Ermangelung der Glia bilden Neuronen eine begrenzte Anzahl von Synapsen, die in der Regel auch funktionale Reife13 fehlt.

Menschliche Astrozyten morphologischen, transkriptionelle und funktionellen Merkmale darstellen – wie zunehmende Größe und Komplexität der Verzweigung sowie artspezifische Gene –, sind nicht in Nagetieren12,14, rekapitulierte 15. Infolgedessen Studien unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete neuronalen Zellen werden akzeptiert als ein Mittel der CNS-Erkrankungen in-vitro- Prüfung, bei der Entwicklung neuartiger Therapien, Verletzungen Modelle und Kultur Paradigmen16 ,17. Darüber hinaus ermöglichen hPSCs die Studie der menschlichen Synapse Entstehung und Funktion ohne die Notwendigkeit für primäre Gewebe18,19.

Ein Hindernis zum Verständnis, wie verschiedene Zelltypen und Signale an synaptischen Schaltung Funktion beitragen ist der Mangel an entsprechenden Modellen des menschlichen Gehirns. Besteht ein Bedarf für eine geeignete Plattform zu ihrer synaptischen Netzwerke mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu rekapitulieren. Vor kurzem, hat Interesse in der Produktion von 3D Culture Systeme entstanden (allgemein bekannt als "Organellen," "Sphäroide" oder "Mini-Köpfe")20 bis komplexe dreidimensionale (3D) Modell Strukturen auf der zellulären und Makroebene. 3D Culture-Systeme behalten ECM und Zell-Zell-Interaktionen, die normalerweise nicht vorhanden oder nur während der typischen 2D Coculture Paradigmen21,22. Eine Fülle von Techniken existieren für die Kultivierung 3D neuronale Sphäroide23,24,25; jedoch erfordern viele langwierige Kultur Zeiträume (Monate bis Jahre) für spontane Entwicklung und Erhaltung der Layer, mit dem Benutzer präsentiert sehr wenig Kontrolle über den Ausgang.

Hier zeigen wir eine systematische Methode, um schnell und konsequent Biotechnologe neuronalen Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen (Pre-differenzierten Neuronen und Astrozyten) abgeleitet von hPSCs durch den Zusammenbau von Zellen in Bereich Kokulturen ("Asteroiden")26 rekapitulieren, die Mensch-spezifische morphologische Komplexität in 3D. Dieses High-Density neuronalen System erzeugt gleichmäßig verteilten neuronalen Untertypen, die übernehmen ältere Eigenschaften im Laufe der Zeit und können gezeigt oder in gewissem Sinne Hochdurchsatz-untersucht. Wir zeigen erstmals, dass menschliche Astrozyten synaptischen Netzwerkaktivität platzen in dieser 3D Kokulturen induzieren. Darüber hinaus ist dieses Protokoll leicht anpassbar, Kugeln in verschiedenen Größen, um Zellen angegeben, um unterschiedlichen regionalen Identitäten des ZNS zu nutzen und Interaktionen von mehreren anderen Zelltypen wie gewünscht zu studieren zu generieren.

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Protokoll

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(1) Zell-Kultur und Reagenz Vorbereitung

Hinweis: Die Protokolle in diesem Abschnitt sind in der Reihenfolge geschrieben, in denen sie in der Differenzierung-Protokoll (Abschnitt 2 erscheinen). Sehen Sie die Tabelle der Materialien für Materialien und Katalognummern.

  1. Zellkultur beschichtete Platten vorbereiten.
    1. Verdünnen Sie die extrazelluläre Matrix (ECM) Beschichtungslösung mit DMEM/F12 Medien 1 mg/mL Stammlösung vorbereiten. Aliquoten verdünnte ECM Lösung in 30 konische Rohre von 3 mL auf Lager und sofort speichern bei-20 ° C. Aufschwemmen Sie für eine funktionierende Lösung 3 mL ECM Lager in 33 mL vorgekühlt DMEM/F12-Medien, das Gesamtvolumen auf 36 mL bei einer Konzentration von 80 µg/mL zu bringen.
    2. 1 mL pro Bohrloch einer 6-Well-Zelle-Kultur-Platte mit ECM funktionierende Lösung zu beschichten. Fügen Sie eine zusätzliche 1 mL DMEM/F12 pro Bohrloch (falls erforderlich), um sicherzustellen, dass die Oberfläche des Brunnens vollständig bedeckt ist. Ermöglichen Sie die beschichteten 6-Well-Zelle Kultur Platten bei Zimmertemperatur mindestens 1 Stunde vor Gebrauch zu sitzen.
      Hinweis: Beschichtete Platten können im Inkubator oder bei 4 ° C bis zu 2 Wochen aufbewahrt werden.
  2. Bereiten Sie Medien Formulierungen, Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle.
    1. Um 500 mL menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) mittlere27vorzubereiten, dazugeben Sie 20 X 500 X Ergänzungen nach Herstellerangaben.
    2. Um 500 mL neuronale Medium (NM) vorzubereiten, fügen Sie Heparin hinzu, eine Endkonzentration von 2 mg/mL, 1 X Antibiotikum/antimykotische Lösung, 1 x B27 Ergänzung oder 1 x N2 Ergänzung zu einer 500 mL Flasche DMEM/F12 mit L-Glutamin ergänzen als zuvor detaillierte28.
    3. Zur Vorbereitung einer 10 mM (1, 000 X) Lösung der Rho-Kinase Inhibitor Y27632 (Y) auf Lager, fügen Sie 10 mg Pulver in 3 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Filter zu sterilisieren, Aliquot, und Lagerung bei-20 ° C. Verwenden Sie bei 10 µM arbeiten Konzentration in den Medien.
    4. Zur Vorbereitung einer 20 mM (10, 000 X) Lösung der SB431542 auf Lager, fügen Sie 10 mg Pulver in 1,3 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Zur Vorbereitung einer 2 mM (1, 000 X) Lösung der DMH1 auf Lager, fügen Sie 10 mg Pulver in 13,1 mL DMSO. Filter zu sterilisieren, Aliquot, und speichern Sie jede Lösung bei-20 ° C. Verwenden Sie jeweils eine 2 µM arbeiten Konzentration in den Medien (NM + SB431542 + DMH1).
      Hinweis: Dieses Protokoll empfiehlt 2 µM arbeiten Konzentrationen der beiden SB431542 und DMH1 basierend auf unseren Beobachtungen und Berichte von anderen29 besagt, dass diese Konzentration effektiv neurale Induktion von hPSCs fördert. Höhere Konzentrationen wurden auch gemeldeten30. Darüber hinaus hat mit alternativen Medien es auch gezeigt, dass kleine Moleküle nicht für hohe neuronale Conversion31notwendig sind. So arbeiten Konzentrationen variieren je nach alternativen Zelle Kultur Umgebungen und optimale Konzentrationen einzelner Forscher getestet werden sollte.
    5. Zur Vorbereitung der einzelnen 100 µg/mL (10, 000 X) Stammlösungen der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF2), fügen Sie jeweils in 10 mL PBS + 0,1 % BSA 1 mg. Aliquoten EGF und FGF2 Lösungen in 50 µL-Aliquots auf Lager und Lagerung bei-80 ° C. Verwenden Sie bei 10 ng/mL arbeiten Konzentration in den Medien; z. B.hinzufügen 5 µL EGF und 5 µL FGF2 bis 50 mL nm (NM + EGF + FGF2).
    6. Zur Vorbereitung einer Stammlösung von Doxycyclin Hydrochlorid (Dox) zuerst auflösen Pulver in DMSO bis 100 mg/mL und Lagerung bei-20 ° C. Weiter verdünnen es zu 2 mg/mL (1, 000 X) Lager Lösung im PBS und Store bei-20 ° C. Verwenden Sie bei 2 µg/mL arbeiten Konzentration in den Medien; z. B.hinzufügen 50 µL Dox, 50 mL von NM (NM + Dox).
      Hinweis: Nicht wieder frieren Sie Lösungen nach dem Auftauen ein.

2. Generation der neuronalen Subtypen von humanen induzierten pluripotenten Zellen (hPSCs)

Hinweis: Alle Zellkulturen aufzubewahren in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C. Diese Kulturen sind bei Zimmer Sauerstoffgehalt, beibehalten, obwohl untere Ebenen genutzt werden können.

  1. Generieren Sie und pflegen Sie Astrozyten Stammväter (hAstros) von hPSCs.
    Hinweis: Dieser Abschnitt enthält eine kurze und vereinfachte Differenzierung-Protokoll. Für eine detaillierte Beschreibung (mit Embryoid Körper Bildung, Rosette Auswahl und regionale Strukturierung Schritte) beziehen sich auf die zuvor beschriebene Protokoll28 (Abbildung 1A, Greenbox punktiert).
    1. Saatgut-Cluster des hPSCs (Abbildung 1 b) auf ECM-beschichteten 6-Well-Platten (siehe Punkt 1.1) mit 2 mL hPSC Medium + Y pro Bohrloch. Jeden Tag, bis sie etwa 50 % konfluierende und Split nach Bedarf sind die Stammzellen zu ernähren.
      1. Um hPSCs zu teilen, Brunnen 1 mL Reagenz passagierung hinzu und Aspirieren nach 1 min. inkubieren Zellen bei Raumtemperatur für 5 min, 1 mL der hPSC Medium hinzufügen und Aggregate 01:10 auf neue ECM-beschichtete Brunnen in 2 mL hPSC Medium + Y pro Bohrloch aufgeteilt.
    2. Die Stammzellen zu erhalten, bis sie ca. 50 % Zusammenfluss, dann Änderung Medien NM + SB431542 + DMH1 induzieren neuronale Differenzierung (Tag 0) sind. Wenn Zellen sind etwa 95 % Zusammenfluss, 1:6 in neuen ECM-beschichteten Bohrungen im gleichen Medium aufgeteilt.
    3. Am 14. Tag distanzieren Sie sich die Zellen mit Ablösung Lösung und Transfer zum einem unbeschichteten Kolben mit Y, Bildung von Aggregaten zu fördern.
      Hinweis: Die Zugabe von Y wird genutzt, um überleben und Kugel Zellbildung fördern aber ist nicht im Preis inbegriffen bei jeder Fütterung.
    4. Verwenden Sie für die Erzeugung von neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen (hNeurons) diese Tag-14 Zellen wie unten beschrieben. Alternativ benutzen Sie diese Zellen zu späteren Zeitpunkten Monolage oder Kugel Kulturen, bevor neuronale Reifung tritt oder Gliogenesis beginnt.
      Hinweis: Standardmäßig produziert dieses Protokolls dorsale kortikale Astrozyten. Astrozyten Subtypen können jedoch regional durch die Zugabe von Musterung Morphogens,28,32,33auf Wunsch angegeben werden. Retinsäure (RA) kann hinzugefügt werden, um Zellen in Rückenmark caudalize geglättet Phänotypen, während sonic Hedgehog (SHH) Agonist (SAG), oder Purmorphamine ventrale Phänotypen produzieren wird.
    5. Für die Generation der Astrozyten Stammväter und Astrozyten in spontan gebildeten 3D Aggregate (hAstrospheres) wechseln Sie zu NM + EGF + FGF2 und ernähren Sie wöchentlich (oder je nach Bedarf zu stabilen pH zu gewährleisten) als zuvor detaillierte34zu.
      1. Distanzieren Sie sanft hAstro Aggregate mit Ablösung Lösung Wenn dunkle Zentren erscheinen und Sphären, die spontan Anhängen zu entfernen. Zu brechen Kugeln sanft einmal pro Woche zur Erhaltung der Bereich Gesundheit und nekrotischen Kerne zu vermeiden.
        Hinweis: Überschreiten Sie 5 min Behandlung mit Ablösung Lösung nicht.
      2. Nach 4-6 Monaten Expansion bestätigen Einfrieren Zelle Identität und entweder in Kryokonservierung Medium (nach Herstellerangaben) oder alternative Lagerung Bedingungen zur Langzeitarchivierung in flüssigem Stickstoff oder Verwendung sofort für experimentieren.
    6. Um einen gefrorenen bestand von hAstrospheres tauen, tauen Sie schnell ein Fläschchen bei Raumtemperatur, Transfer, den Inhalt in eine leere 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 300 X g für 1 min. sorgfältig Aspirieren überstand, Waschen mit DMEM/F12, und wiederholen Sie für insgesamt zwei waschen auf Schritte. Fügen Sie eine T25-Flasche mit einem Gesamtvolumen von 6 mL NM + EGF + FGF2 + Y hinzu (oder je nach Bedarf skalieren Sie).
  2. Generieren Sie und pflegen Sie induzierbare Neuronen (iNeurons) von hPSCs.
    1. Samen transgenen hPSCs (mit einem stabilen Doxycyclin-induzierbaren Neurogenin 2 Transgen35) auf ECM-beschichteten 6-Well-Platten mit 2 mL hPSC Medium + Y pro Bohrloch (wie für nicht-transgenen Linien oben beschrieben). Füttern Sie jeden Tag mit 2 mL Medien pro Bohrloch, bis sie bereit sind, bei 70 % Konfluenz zu heben. Teilen Sie Zellen, wie unter Punkt 2.1.2 beschrieben.
    2. Wenn Zellen sind etwa 35 % konfluierende, fügen Sie NM + Dox um Differenzierung in iNeurons induzieren. Pflegen Sie als Monolayer Kultur mit NM + Dox für 2 Tage bevor Sie zu Schritt 3.2.
      Hinweis: Zellen den Übergang in neuronalen Vorläuferzellen, aber wird nicht noch verlängern Neuriten (Abbildung 1).

3. Vorbereitung und Wartung von 3D Kugel Kokulturen

  1. HAstros von 3D Aggregate in der Schwebe (wie in Schritt 2.1.5.1 beschrieben) zu distanzieren.
  2. HNeurons oder iNeurons aus einem 2D monomolekularen Film zu distanzieren.
    1. Entfernen Sie Medien aus 6-Well-Platte und jeweils gut Monolayer-Kulturen fügen Sie 500 µL Ablösung Lösung hinzu. Inkubation bei 37 ° C für 5 min. sanft fügen Sie 2-3 mL DMEM/F12, angeschlossene Zellen zu entfernen.
    2. Sammeln Sie Zellen und Medien in einem 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 300 X g für 1 min. Aspirat überstand, fügen Sie 1 mL frische Medien, und rauf und runter pipette vorsichtig mit einer Mikropipette 1.000 µL einer einzigen Zellsuspension zu erreichen.
  3. Form 3D-Kugeln Microwell Kultur Platten verwenden.
    1. Bereiten Sie Platte durch Zugabe von 0,5 mL Spüllösung Anti-Einhaltung in jede Vertiefung der Microwell Platte vor. Zentrifugieren Sie Platte bei 2.000 X g für 5 min. Aspirat Spüllösung, fügen Sie 1 mL DMEM/F12 in jede Vertiefung zu waschen und wieder abzusaugen.
      Hinweis: Vergewissern Sie sich, dass während des Gebrauchs die Zentrifuge ausgeglichen wird.
    2. Zählen Sie jeder Zelltyp mit einem Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler. Fügen Sie gewünschte Verhältnis von dissoziierten hAstros und hNeurons oder iNeurons, in jede Vertiefung in einem Gesamtvolumen von 2 mL NM + Y (Dox gehören, wenn iNeurons verwendet werden). Platte 100 X g für 3 min zentrifugieren und zurück in den Inkubator.
      Hinweis: Microwell 24-Well-Platten (siehe die Tabelle der Materialien) enthalten 300 Mikrovertiefungen pro Bohrloch. Fügen Sie ein Minimum von 6 x 105 Zellen (für Kugeln 2 x 103 je Zellen) und maximal 6 x 106 Zellen (für Kugeln 2 x 104 je Zellen) in 2 mL Medien pro Bohrloch. Verwenden Sie für tragfähige Sphären einer bestimmten Dichte in diesem Bereich eine definierte Menge von Zellen und dividieren durch 300, die Anzahl der Zellen pro Kugel zu berechnen. Alternative Kugel Formen, Methoden und Werkzeuge kann auch genutzt werden, falls gewünscht. Anweisungen des Herstellers akzeptable Reichweiten von Zelldichten.
    3. Können Sie Zellen in dicht gepackten Kugeln innerhalb Microwell Platten in den nächsten 2 Tagen (Abbildung 2A) selbst zusammenstellen. 50 % Medien zu ersetzen, wenn die Kultur Vergilbung ist.
      Hinweis: Nur die Hälfte Medien auszutauschen und pipette vorsichtig entfernen und Hinzufügen von Medien nicht zu Kugeln zu stören. Kugeln können heben aus Mikrovertiefungen und verschmelzen zusammen mit höherer Gewalt.
    4. Entfernen Sie nach 2 Tagen vorsichtig Kugeln aus Mikrovertiefungen mit einer Mikropipette 1.000 µL (Abbildung 1). Leicht Kraft auf der Unterseite der Mikrovertiefungen mit Medien, zusätzliche eingehalten Kugeln zu entfernen. Lassen Sie die Kugeln in einem 15 mL konische Röhrchen zu begleichen, Aspirieren Sie die alten Medien und neue Medien hinzufügen.
  4. Die Spinner Kolben bioreaktorsystem zur Bildung von 3D-Kugeln eingerichtet.
    1. Reinigen Sie die Oberfläche einer magnetischen rühren-Platte mit 70 % Ethanol, legen Sie sie in eine Zelle Kultur Brutkasten. Autoklaven einzelne Spinner Fläschchen zu sterilisieren.
    2. Kugeln mit einem Minimum von 50 – 60 mL Medien zu jedem Spinner Kolben hinzufügen (Abbildung 1, Einpresstiefe). Legen Sie den Kolben auf die magnetische rühren Platte bei 60 u/min eingestellt. Kultur-Kugeln in Spinner Fläschchen bis sie bereit sind für die Datenerfassung.
      Hinweis: Mindestens 3 Wochen in der Kultur ist für Synapse Bildung benötigt. Wenn der Spinner Kolben bioreaktorsystem nicht gewünscht wird, können unter stationären Bedingungen in Zellkulturflaschen oder Gerichte Sphären kultiviert werden. Kugeln können auch in ECM oder Hydrogel eingebettet werden.

4. Messung der Live synaptischen Physiologie mit Multielectrode Arrays (MEAs)

  1. Zellkultur MEAs vorbereiten.
    1. Saubere Oberfläche der einzelnen MEA mit 1 mL Waschmittel für 1 h Spülen mit sterilem deionisiertes (DI) Wasser, spülen Sie mit 70 % Ethanol zu sterilisieren und dann an der Luft trocknen in biologische Kabinett unter UV-Licht.
      Hinweis: MEAs können in VE-Wasser bei 4 ° C unter sterilen Bedingungen bis zum Gebrauch gespeichert werden.
    2. Bereiten Sie eine 0,5 mg/mL Lösung von Poly-Ornithin (PLO) durch Auflösen von 50 mg der PLO in 100 mL Borsäure Puffer. Mantel der Oberfläche der einzelnen MEA mit 1 mL der PLO zum Rendern der Oberfläche hydrophil und Inkubation bei 37 ° C für mindestens 4 Std. Entfernen der PLO, waschen Sie die Oberfläche mit VE-Wasser, fügen Sie 1 mL der ECM (siehe Schritt 1.1.1), und bei 37 ° C für mindestens 4 h inkubieren.
    3. ECM und Kugeln in 1,5 mL der Medien auf eine MEA-Oberfläche, um sicherzustellen, dass die Kugeln über die Elektrode positioniert sind (Abbildungen 3A, 3A'). 2 Tage lang halten lassen. Ändern Sie die Hälfte der Medien alle 2 – 3 Tage (oder öfter, wenn nötig), um sicherzustellen, dass die Kugeln nicht gestört werden.
      Hinweis: Zugabe von Wachstumsfaktoren kann Kultur überleben und Reifung verbessern.
  2. Elektrische Aktivität der neuronalen Kugeln zu messen.
    1. Ein multielectrode Array (MEA) System mit einer temperaturgesteuerten Headstage einrichten. Erstellen Sie ein Softwareprogramm mit 5 Hz Hochpass-Filter, und 200 Hz Tiefpass Filter und einen Spike-Schwellenwert von 5 X Standardabweichung (SD).
    2. Legen Sie die MEA auf Headstage und Record spontane elektrische Aktivität (Abb. 3 bB'). Raw-Daten einschließlich der Spike-Frequenz und Amplitude für die statistische Analyse zu retten.
      Hinweis: Eine Perfusion System kann mit den MEA pharmakologische Wirkstoffe hinzufügen oder neue Medien für Langzeitaufzeichnung erhöhen genutzt werden. Zusätzliche Nachbearbeitung von Spikes kann als gewünschte36,37durchgeführt werden.

5. Messung der synaptische Dichte mit Immunocytochemistry

  1. Vorbereitung der Reagenzien.
    1. Fügen Sie 400 mL 1 X PBS um eine 500 mL Stammlösung von 4 % Paraformaldehyd (PFA) zu machen hinzu, ein Becherglas oder einen Teller rühren in einem gelüfteten Abzug. Stir Bar und Hitze bis 60 ° C unter Rühren hinzufügen; nicht kochen lassen. Die beheizten PBS-Lösung 20 g PFA Pulver hinzu und erhöhen Sie den pH-Wert auf 6,9 durch langsam 1 N NaOH tropfenweise hinzufügen.
      Hinweis: 4 % PFA Lösung kann bei 4 ° C gelagert und regelmäñig bis zu einem Monat sein.
    2. 100 mL PBS zu 20 % und 30 % Lösungen von Saccharose, bzw. Fügen Sie 20 g oder 30 g Saccharose hinzu.
    3. 10 mL PBS, bereiten Sie eine 10 %-Stammlösung fügen Sie 1 mL Spülmittel hinzu. Invertieren Sie mehrmals zu homogenisieren.
    4. Fügen Sie 250 µL 10 % Waschmittel Stammlösung (Endkonzentration von 0,25 %) und 500 µL von Ziege und Esel Seren (Endkonzentration von jeweils 5 %) auf 10 mL PBS, den primäre blockierenden Puffer vorzubereiten.
    5. 10 mL PBS zur Vorbereitung des sekundären blockierenden Puffers fügen Sie 100 µL der Ziege und Esel Seren (Endkonzentration von 1 % hinzu).
  2. Die Proben vorbereiten.
    1. Übertragen Sie die Kugeln in einem 15 mL konische Röhrchen, lassen Sie sich an der Unterseite des Rohres und Aspirieren Sie die alten Medien. Spülen Sie die Kugeln mit 500 µL PBS, lassen Sie sich niederlassen und Aspirieren PBS. Hinzufügen von 500 µL 4 % PFA (oder genug, um Kugeln zu decken) und bei 4 ° C für 30 min inkubieren.
    2. Aspirieren der PFA und vorsichtig zweimal mit PBS waschen. 20 % Saccharoselösung hinzufügen und bei 4 ° C inkubieren Sie für mehrere Stunden oder über Nacht. Sorgfältig abzusaugen, 30 % Saccharoselösung hinzufügen und mehrere Stunden bei 4 ° C inkubieren oder über Nacht.
      Hinweis: Proben können bis zu 1 Woche bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren bei 4 ° C in PBS oder Saccharose gespeichert werden. Nicht schneiden, pflegen als 3D-Kugeln (Abbildung 4A-C) in einer 1,5 mL Tube und fahren Sie mit Schritt 5.3.
    3. Wenn die Kugeln schneiden, übertragen Sie sorgfältig Kugeln auf ein Einbettungs kryogenen Schimmel auf Trockeneis. Aspirieren Sie die 30 % Saccharose-Lösung und Gießen Sie langsam Gewebe einbetten Lösung in die Form, bis sie vollständig die Probe bedeckt, Vermeidung von Luftblasen. Warten Sie, bis die Lösung gefriert und bei-80 ° C bis zur Kryostat schneiden lagern.
    4. Verwenden einen Kryostaten bei-20 ° C, Scheibe die eingebetteten Blöcke in 30 µm-Abschnitte (oder wie gewünscht) und Transfer zum Glas-Objektträger. Lagerung bei-80 ° C bis zu beflecken.
  3. Immunostain die Kugeln.
    1. Skizzieren Sie die Kanten der Folien mit einem hydrophoben PAP-Stift, Flüssigkeit auslaufen zu verhindern. Bereiten Sie primäre und sekundäre blockierende Lösungen mit Antikörpern (siehe die Tabelle der Materialien vor). Jede Folie oder Rohr 500 µL des primären blockierende Puffers hinzu und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.
    2. Entfernen Sie die Flüssigkeit, 500 µL frische primäre blockierende Puffer mit verdünnter Primärantikörper für jede Folie oder Rohr hinzufügen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren Entfernen Sie Primärantikörper Lösung und waschen Sie 3 X mit PBS für 10 Minuten.
    3. Jede Folie oder Rohr 500 µL des sekundären blockierende Puffer mit verdünnter Sekundärantikörper hinzu und bei 4 ° C inkubieren Sie für 1 h. Sekundärantikörper Lösung entfernen und Waschen 3 X mit PBS für 10 Minuten.
      Hinweis: Eine Liste von empfohlenen Antikörper wird in der Tabelle der Materialienbereitgestellt. Andere Antikörper oder Farbstoffe verwendet werden wie gewünscht. Nicht setzen Sie fluoreszierende Proben (vorwärts Schritt 5.3.3) dem Licht aus.
    4. Fügen Sie 50 µL Montagelösung tropfenweise zu bedecken die Oberfläche und legen Sie ein Deckglas vorsichtig über die Folie, Vermeidung von Luftblasen. Ermöglichen Sie die Folien bei Zimmertemperatur 24 Stunden trocknen und Lagerung bei 4 ° C.
  4. Bild der Folien.
    1. Konfokale oder zwei-Photon fluoreszierende Mikroskop mit einem 63 X Öl eintauchen soll Bild Pre- und Post-synaptischen Protein Fülle und ns1 im Bereich Scheiben (Abbildung 4) verwenden. Verwenden Sie ein 20 X oder 40 X Objektiv, um morphologische Merkmale von den hAstros zu visualisieren.
    2. Offenen Fluoreszenz-Image-Dateien mit ImageJ-Software. Pre- und Post-synaptische Puncta manuell mithilfe der Zelle Zähler Plug-in, verwenden eine unvoreingenommene Zählmethode als zuvor detaillierte38oder mit alternativen Methoden zu zählen.

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Ergebnisse

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Wenn Sie richtig durchgeführt wird, wird dieses Protokoll definierte Populationen von funktionalen Kokulturen Astrozyten28,33,34 und Neuronen35 aus hPSCs (Abbildung 1A-1C), erzeugt als produzieren. detaillierte zuvor26 und hier in Schritten 2.1-2.2 beschrieben. Dieses schrittweisen Verfahren, mit dem Ei...

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Diskussion

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In diesem Protokoll beschreiben wir eine systematische Methode zur Herstellung von 3D-Kugeln neuronale Kokulturen. Die Kugeln bestehen aus Astrozyten und Neuronen, die unabhängig von hPSCs abgeleitet werden. Obwohl nicht der Schwerpunkt dieses Protokolls, die Erzeugung von reinen Populationen von Astrozyten aus hPSCs28 ist ein entscheidender Schritt und technisch anspruchsvoll, wenn ohne Vorkenntnisse durchgeführt werden kann. Dieser erste Schritt bei der Erzeugung von diesen synaptischen Mikrosch...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten danken Dr. Erik Ullian (UCSF) für geistigen Beitrag auf die Gestaltung dieser Verfahren, Dr. Michael Ward (NIH) für technische Beratung bezüglich iNeuron Differenzierung und Saba Barlas für vorläufige Bildanalyse.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Well-PlatteFisher Scientific08-772-1B
15 mL konische RöhrchenOlympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100MLAblöselösung
AggreWell PlatteStemcell Technologies34850
Anti-Adhärenz-SpüllösungStemcell Technologies7010Zelle verhindern Adhäsion auf Mikrotiterplatten
Anti-/Anti-Thermofisher15240062
B27Thermofisher17504044Media Supplement
BrainPhys neuronales MediumStemcell Technologies5790Neurophysiologische Alternative zum Basalmedium
Runde GlasdeckgläserNeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Stemcell Technologies7930Kryokonservierungsmedium mit 10 % DMSO
DMEM/F12Thermofisher10565-042Mit GlutaMAX-Zusatz
DMH-1Stemcell Technologies73634GEFAHR: Giftig bei Verschlucken. Arbeitsschwerpunkt: 2 μ M
Donkey SerumLampire Biological Laboratories7332100Arbeitskonzentration: 5% im primären Blockierungspuffer, 1% im sekundären Blockierungspuffer
Doxycyclinhydrochlorid (Dox)SigmaD3072-1mlGEFAHR: Giftig für schwangere Frauen. Arbeitsschwerpunkt: 2 μ g/mL
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)PeprotechAF-100-15Arbeitskonzentration: 10 ng/mL
Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF)Peprotech100-18BArbeitskonzentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G EinbettlösungSouthern Biotech0100-01
ObjektträgerFisherbrand22-037-246
ZiegenserumLampire Biological Laboratories7332500Arbeitskonzentration: 5 % im primären Blockierungspuffer, 1 % im sekundären Blockierungspuffer
Hämazytometer oder automatischer ZellzählerLife TechnologiesAMQAX1000
HeparinSigmaH3149-50KUArbeitskonzentration: 2 mg/ml
MagnetplatteDLAB8030170200
Matrigel-MembranmatrixCorning354230ECM-Beschichtungslösung. Arbeitsschwerpunkt: 80 μ g/ml. Bereiten Sie auf Eis vor und stellen Sie sicher, dass Pipetten, Röhrchen und Medien vorgekühlt sind.
MEA 2100 SystemMultichannel SystemsMEA2100
Eindecklösung
N2Thermofisher17502048Media Supplement
OCTTissue-Tek4583Gewebeeinbettungslösung für Kryosektionen
Pap Pen (Aqua Hold)Wissenschaftliches Gerät Labor9804-02
Paraformaldehyd ( PFA)Acros Organics169650025GEFAHR: Giftig bei Einatmen. Arbeitskonzentration: 4% in PBS
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Stemcell TechnologiesCA008-300
Poly-l-Ornithin (PLO)SigmaP3655-100MGArbeitskonzentration: 0,5 mg/mL
Rechteckige GlasdeckgläserFisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRStemcell Technologies5872Ablösung und Passage Reagenz
Rho-Kinase-Inhibitor Y27632- (Y)Tocris1254Arbeitskonzentration: 10
μM SB431542Stemcell Technologies72234Arbeitskonzentration: 2 μ M
SpinnerkolbenFisher Scientific4500-125
SaccharoseFisher ChemicalS5-3Arbeitskonzentration: 20% oder 30% in PBS
T25 KulturkolbenOlympus Plastics25-207Belüftete Kappen
T75 KulturflascheOlympus Plastics25-209Belüftete Kappen
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EAReinigungsmittel. Arbeitskonzentration: 1%
TeSR-E8 BasalmediumStemcell Technologies5940Medium für humane pluripotente Stammzellen (hPSC)
TeSR-E8 ErgänzungenStemcell Technologies5940Nahrungsergänzungsmittel für humanes pluripotentes Stammzellmedium
TritonX-100SigmaX100-500MLDetergens für die Zellpermeabilisierung. Arbeitskonzentration: 0,25 % in Blockierungspuffer
TrypanblauInvitrogenT10282
Antikörper
AlexaFluor 488ThermofisherA-11029Sekundärantikörper
AlexaFluor 594ThermofisherA-11037Sekundärantikörper
EzrinThermofisherMA5-13862Primärer Antikörper; Astrozyten perisynaptisch
GFAP ChemiconMAB360Primärer Antikörper; Astrozyten
GFPAvesGFP-1020Primärer Antikörper; Astrozyten
Glt1Geschenk von Dr. Jeffrey Rothsteinn/aPrimärer Antikörper; Astrozyten
HomerSynaptic Systems160 011Primärer Antikörper; Neuronen, postsynaptisch
MAP2Synaptische Systeme188 004Primärer Antikörper; Neuronen
PSD95Abcamab2723Primärer Antikörper; Neuronen, postsynaptisch
S100Abcamab868Primärer Antikörper; Astrozyten
Synapsin 1 Synapsin 1Synaptische Systeme106 103Primärer Antikörper; Neuronen, präsynaptisch
TuJ1/β 3-Tubulin (TUBB3)CovanceMMS-435PPrimärer Antikörper; Neuronen

Referenzen

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