Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Phycobiliprotein Inhalt in cyanobakteriums Synechocystis eine photometrische Methode quantitativ zu bestimmen. Extraktionsverfahren wurde auch erfolgreich auf andere Cyanobakterien und Algen Stämme angewendet; jedoch aufgrund von Variationen in Pigment Absorptionsspektren ist es notwendig, die photometrische Gleichungen für jede Belastung individuell zu testen.

Zusammenfassung

Dies ist ein einfaches Protokoll für die quantitative Bestimmung der Phycobiliprotein Inhalt in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Phycobiliproteins sind die wichtigsten Komponenten des Phycobilisomes, das großen Licht-ernten Antennen in Cyanobakterien und einige Algen Taxa. Die Phycobilisomes Synechocystis enthalten zwei Phycobiliproteins: Phycocyanin und Allophycocyanin. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, effiziente, und zuverlässige Methode zur quantitativen Bestimmung von Phycocyanin und Allophycocyanin in diesem Modell Cyanobakterium. Wir haben mehrere Methoden der Phycobiliprotein Extraktion und spektralphotometrische Quantifikation verglichen. Extraktionsverfahren wie in diesem Protokoll beschrieben wurde auch erfolgreich auf andere Cyanobakterien Stämme wie Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., angewendet. und Nostoc SP., Rotalgen Porphyridium Cruentum. Jedoch die vom Aussterben bedroht-Koeffizienten der spezifischen Phycobiliproteins aus verschiedenen Taxa können unterschiedlich sein und es empfiehlt daher, die photometrische Quantifizierungsmethode für jede einzelne Belastung individuell zu validieren. Das Protokoll erfordert nur geringen Zeitaufwand und kann in jedem standard Life-Science-Labor durchgeführt werden, da es nur standard-Ausrüstung erfordert.

Einleitung

fPhycobiliproteins sind wasserlösliche Pigment-Protein-komplexe, die Hauptkomponenten des Licht-ernten Antennen in prokaryotic Cyanobacteria (Cyanophyta) und mehrere eukaryotischen Taxa (Glaucophyta, Rhodophyta darstellen , und Cryptophyta)¹. Sie kommen hauptsächlich als supramolekulare komplexe Phycobilisomes genannt und sie hängen in der Regel an die Oberfläche der photosynthetischen Membranen auf der Stromale Seite, mit Ausnahme von Cryptophyta, wo die Phycobiliproteins, in lokalisiert sind der Thylakoidmembran Lumen². Vier Arten von Phycobiliproteins wurden auf dem neueste....

Protokoll

(1) Cyanobakterien Anbau

1. Synechocystis Zellen im Erlenmeyerkolben oder in Photobioreaktoren^10,19 in gepufferten BG11 Medium²⁰ einen pH-Wert von < 10 (z. B.mit 17 mM HEPES¹⁰) weiterhin zu pflegen.
   Hinweis: Standard Anbaubedingungen erfordern einen kontrollierten Temperatur (30 ° C, die optimale Temperatur ist in der Regel 35 ° C)²¹, Beleuchtung (in der Regel ein weißes Licht mit einer Intensität bis zu 800 µmol [Photonen] / [m²·s])²¹und ein CO ₂ Lieferung (....

Ergebnisse

Für die erste Methode Tests Synechocystis wurde angebaut als Batch-Kulturen im Erlenmeyerkolben auf einen Shaker in BG11 Anbau mittleren²⁰ (ergänzt mit 17 mM HEPES) bei 25 ° C, unter ein warmweißes Licht mit einer Intensität von 50 µmol (Photonen) / (m ²·s) und mit 1 % CO₂ in der Kultivierung Atmosphäre. Während des Anbaus der Kulturen wurden zu Safe-Lock Tubes abgetastet und zentrifugiert (15.000 X g bei Labor Temperatur für.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, schnelle und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der Phycobiliprotein Inhalt in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Verschiedene Methoden der Zelle Homogenisierung, Proteingewinnung und Phycocyanin und Allophycocyanin Quantifizierung werden verglichen und das endgültige Protokoll stellt eine Kombination der optimalen Schritte jedes einzelnen Verfahrens. Als repräsentative Daten wurde der Inhalt des Phycobiliproteins in Synechocystis Zellen unter E.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, Frankreich	6803	Cyanobakterienstamm
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland	9143.1	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4
Eppendorf Safe-Lock-Röhrchen	Eppendorf, Hamburk, Deutschland	30120086	Safe-Lock Röhrchen 1,5 ml
VWR 80-Platz Aufbewahrungssystem	VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA	30128-282	Halterung für Safe-Lock Röhrchen
RAININ 100 & micro; L -1000 &Mikro; l	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	17014382	Pipette
GP-LTS-A-1000µ L-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	30389272	Pipettenspitzen
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Deutschland	4701	Kühlzentrifuge für 1,5 ml Safe-Lock-Röhrchen und 15 ml konische Zentrifugenröhrchen
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Schweiz	9005382197172	Kühl- und Gefrierschrank -20  ° C
Revco ExF -86°; C Aufrechter Ultratiefkühlschrank	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	EXF24086V	Gefrierschrank -80  ° C
CoolSafe	LaboGene, Lillerø d, Dänemark	7.001.000.615	Gefriertrockner
UV-2600	Shimadzu, Kyoto, Japan	UV-2600	Spektralphotometer
Hellma Absorptionsküvetten, semi Micro	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z600288	VIS/UV-VIS Semi-Mikroküvetten 0,75-1,5 ml, Spektralbereich 200-2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	Homogenisator
Festglasperlen	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z273627	Glasperlen mit dem Durchmesser 2  mm
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Gö ttingen, Deutschland	SECURA225D-1OBR	Analysenwaagen
C-Phycocyanin von Spirulina sp.	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P2172	Phycocyanin Standard
Allophycocyanin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7472	Allophycocyanin Standard
Bicinchoninsäure Kit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	BCA1, B9643	Komplettkit für die Bestimmung von Gesamtproteinen
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drá sov, Tschechische Republik	AG 130-ECO	Kultivierungskammer für E.-Kolben, mit steuerbarem Licht und Atmosphäre
Photobioreaktor	Photon System Instruments Ltd., Drá sov, Tschechische Republik	FMT-150	Kultivierungsanlage für Cyanobakterien und Algen mit vollständig kontrollierbarer Umgebung
Cellometer	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA	Auto M10	Zellzähler
Corning 15 mL Zentrifugenröhrchen	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS430791	15 ml Zentrifugenröhrchen für die Probenahme mit trockenem Gewicht
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	51024579	Laminar-Strömungshaube