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Methodenartikel

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

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DOI:

10.3791/58079

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29. August 2018

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1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Polysome Profilierung auf das Herz isoliert PERFUNDIERTEN Maus durchführen. Wir beschreiben Methoden für Herz Perfusion, Polysome Profilierung und Analyse der Polysome Fraktionen in Bezug auf mRNAs, MiRNAs und Polysome Proteom.

Zusammenfassung

Studien in dynamischen Änderungen im Protein Übersetzung erfordern spezialisierte Methoden. Hier untersuchten wir Veränderungen in neu synthetisierten Proteine als Reaktion auf Ischämie und Reperfusion mit isoliert PERFUNDIERTEN Maus Herzen gepaart mit Polysome Profilierung. Um die dynamischen Änderungen im Protein Übersetzung besser zu verstehen, wir zeichnen die mRNAs, die wurden mit cytosolische Ribosomen (Polyribosomes oder Polysomes) geladen und auch erholt mitochondriale Polysomes und verglichen mRNA und Protein-Verteilung in der Hocheffizienz Fraktionen (zahlreiche Ribosomen an mRNA befestigt), niedrig-Effizienz (weniger Ribosomen befestigt) darunter auch mitochondriale Polysomes und die Fraktionen nicht übersetzen. MiRNAs können auch mit mRNAs, die übersetzt werden werden, wodurch die Effizienz der Übersetzung zuordnen, untersuchten wir die Verteilung der MiRNAs in die Brüche. Die Verteilung der mRNAs, MiRNAs und Proteine wurde unter basalen PERFUNDIERTEN Bedingungen am Ende des 30 min des globalen keine-Flow-Ischämie und nach 30 min der Reperfusion untersucht. Hier präsentieren wir Ihnen die Methoden verwendet, um diese Analyse zu erreichen – unter anderem wurde der Ansatz zur Optimierung der Proteingewinnung aus Saccharose Neigung, als dies nicht vor beschrieben — und einige repräsentative Ergebnisse liefern.

Einleitung

Das Herz reagiert auf die Verletzung von (I) Ischämie und Reperfusion (R) in einer dynamischen Art und Weise. Allerdings gibt es wenig Einblick in akute Veränderungen bei der Proteinsynthese während der Reaktion. Um dieses Problem anzugehen, wir nutzten die etablierte Methode der Polysome Profilierung1 zur Identifizierung von Änderungen im Protein-Überfluss, die Umverteilung von Ribosomen und Translationale regulatorische Faktoren vom Zytosol zu Polysomes, zu reflektieren und die Anstieg der neu synthetisierten Proteine (NSP). In der Umgebung von I / R, die Zunahme der neuen Protein-Synthese erfolgt in einem Zeitrahmen, die nicht übereinstimmen mit Transkription des neuen mRNAs2; Darüber hinaus wurde Discordance zwischen mRNA Ausdruck und Protein Fülle gemeldeten3. Aus diesen Gründen haben wir die Änderungen in der dynamischen Proteomforschung zu analysieren, wie Protein Übersetzung widerspiegelt. Um dies zu tun, wir mRNA in den Polysome Fraktionen zu quantifizieren, und analysieren die Proteinzusammensetzung in den Polysome Fraktionen. Schließlich, da MicroRNAs (MiRs) Verfügbarkeit von mRNAs für die Übersetzung zu regulieren und Effizienz von Protein Übersetzung4,5stören können, untersuchten wir die Verteilung der MiRs in den Polysome Fraktionen, mit Schwerpunkt auf der Antwort auf I / r.

Wir entschieden uns für die isolierten Langendorff Perfusion Mausmodell und geernteten Gewebe unter basalen Bedingungen der kontinuierliche Perfusion, nach 30 min global keine-Flow-Ischämie und nach 30 min von Ischämie, gefolgt von 30 min der Reperfusion verwenden. Wir dann solubilisiert Herzgewebe und Polysomes über einen Saccharose Gradienten getrennt gefolgt von Proteomic Analysen und selektive Detektion von mRNAs und MiRNAs durch PCR und Microarray, beziehungsweise. Diese Kombination von Methoden steht einen leistungsfähigen Ansatz zum Verständnis der dynamischen Proteom, ermöglicht simultane Detektion von mRNA und MiRNA, Nadel-, sowie die Umverteilung von regulatorischen Proteinen, MiRNA und mRNA zwischen nontranslating Brüchen, niedrige Effizienz Polysomes und Hochleistungs-Polysomes (siehe Abbildung 1). Einblicke in die dynamische Regulierung dieses Prozesses werden durch weitere Analysen der Phosphorylierung wichtige regulatorische Faktoren wie eIF2α oder mTOR verlängert werden. Diese einzelnen Schritte sind nun detailliert beschrieben.

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Protokoll

Alle Tierversuche in Übereinstimmung mit Richtlinien durchgeführt und von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee of Cedars-Sinai Medical Center genehmigt.

(1) Langendorff Perfusion der Maus Herz

  1. Langendorff Perfusion der Maus Herz mit Ischämie und reperfusion
    1. Verwalten intraperitoneale Pentobarbital-Natrium 70 mg/kg an die Erwachsenen Maus (8 Woche alt, männlich, C57BL6/j). Bestätigen Sie Tiefe Narkose durch Mangel an Rückzug bis zu den Zehen Prise.
    2. Anticoagulate mit intraperitonealer Heparin 500 U/kg.
    3. Öffne die Truhe über sternale Schnitt. Öffnen Sie das Zwerchfell und entlang der Küsten Grenze zur vorderen axillären Achse schneiden. Dann schneiden Sie die vordere Axilläre Achse bis zu der vordergliedmaße, vollständig den Brustkorb zu öffnen. Nach Visualisierung von Herzen, Klemmen Sie der Aorta ascendens mit Pinzette und Verbrauchsteuern Sie rasch das Herz. Der Tod ist durch Entbluten. Legen Sie das Herz in kalten Krebs (NaCl 6,9 g/L KCl 0,35 g/L, Nahco33 2,1 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, Glukose 2 g/L und CaCl2 0,373 g/L).
    4. Cannulate der Aorta mit einer stumpfen Spitze Nadel und Herzen doppelthebel mit Krebs Lösung im Modus konstanter Druck durchspülen.
    5. Nach einer Stabilisierung von 15 min vorbehaltlich der Herzen eine globale Ischämie der keine-Flow für 30 min, gefolgt von Reperfusion für 30 min.
    6. Ernten Sie Herz, nach 15 min Baseline Perfusion, nach 30 min Ischämie oder nach 30 min Reperfusion. Schneiden Sie die Vorhöfe und Snap-Einfrieren des Gewebes in flüssigem Stickstoff.
    7. Bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren

(2) Gewebe Homogenisierung, Solubilisierung und Saccharose Dichte Gradienten Sedimentation

  1. Gradient Vorbereitung
    1. Bereiten Sie 2 Lösungen (15 % und 50 %) von 100 mL Saccharose, Mischen von 4 mL NaCl 2,5 M;
      0,8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 15 g oder 50 g Saccharose (für 15 % und 50 %, beziehungsweise); Reinstwasser, 100 mL zu erreichen; und Xylol Cyanol (0,02 mg/mL) um die 15 % ige Lösung zu färben
    2. Jede Lösung (0,22 µm Filter) filtern
    3. Der Tag ist der Farbverlauf verwendet werden, bereiten Sie 40 mL jeder Saccharose-Lösung und jede Lösung Endkonzentration von 100 µg/mL zu erreichen fügen Cycloheximide hinzu
      1. Verwenden Sie eine Farbverlauf Maker, um eine Mischung zwischen 15 % und 50 % Saccharose-Lösungen vorzubereiten
      2. Füllen Sie das linke Fach mit 5 mL 15 % Saccharose-Gradienten
      3. Füllen Sie das richtige Fach mit dem 50 % Saccharose-Gradienten
      4. Öffnen Sie den Hahn und schalten Sie die Pumpe zwei kleine Fächer mit Magnetrührer gerührt
      5. Verwendung einer Röhre in Verbindung mit dem zweiten Hahn die gemischte Saccharoselösung fließen in einem Ultra-Zentrifugation Rohr mit dünnen Wänden ermöglichen. Endvolumen werden ca. 10 mL.
    4. Halten Sie die Steigungen bei 4 ° C (Übernachtung bei Bedarf, aber nicht länger)
  2. Homogenisierung von Herzgewebe
    1. Homogenisieren frische oder gefrorene Herz mit Polytron in gefilterten Lyse Puffer (modifiziert für Saccharose gradient Fraktionierung) mit 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4 % NP-40. Enthalten Sie Cycloheximide 100 µg/mL um Polysome Struktur, 0,1 U RNase-Inhibitor und Protease-Inhibitor cocktail (1 Tablette für 50 mL) erhalten.
    2. Inkubieren der lysate 15 min auf Eis.
    3. Zentrifugieren Sie bei 18.000 X g für 15 min bei 4 ° C zu unlöslichen Material entfernen und den überstand zu sammeln.
    4. Reservieren Sie 50 µL zur Proteinbestimmung, RNA Isolation und RNA Integritätsanalyse (siehe Abbildung 2).
    5. Schicht des Überstands (500 – 100 µL) auf den Steigungen und das Gleichgewicht der Rohre mit Lyse Puffer.
  3. Sedimentation und Sammlung von Fraktionen
    1. Durchführen Sie Ultrazentrifugation für 120 min bei 37.000 u/min bei 4 ° C in einem schwingenden Rotor Eimer. Dies entspricht laut Hersteller 228.000 X g bei maximaler Radius.
    2. Jeder Verlauf als 17 Brüche (rund 600 µL Bruch) zu sammeln, in Mikrozentrifugenröhrchen mit kontinuierlicher Überwachung der Extinktion bei 254 nm (OD-254).
    3. Programm der Fraktionssammler wie folgt:
      1. Entsorgen Sie die erste 3 min Sammlung (entsprechend der Flüssigkeit in den Röhrchen vor der Steigung)
      2. Von 4 bis 19 min sammeln Sie die Fraktionen mit der Geschwindigkeit von 1 mL/min in 17 Fraktionen.
    4. Legen Sie die Fraktionen auf Eis, sobald jeder gesammelt werden. Eingefroren Sie Proben bei-80 ° C, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden. Eine typische UV densitometrische Rückverfolgung des Farbverlaufs wie sie erfasst werden, ist in Abbildung 1dargestellt.

3. Isolierung und Analyse von mRNAs aus Polysome und Nontranslating Brüche

  1. Gewinnung von mRNA
    1. Tauen Sie die Fraktionen auf dem Eis auf, wenn sie Blitz eingefroren nach der Entnahme waren
    2. Übertragen Sie 200 µL der einzelnen Fraktionen zu einem frischen Schlauch
      Hinweis: In diesem Schritt können zwei oder mehr aufeinander folgenden Fraktionen zusammengefasst werden. Es sollte sorgfältig durchgeführt werden, nach der Analyse der OD254 Grafik, so dass Polysome und nicht Polysome Fraktionen nicht durcheinander geraten.
    3. Fügen Sie 10 ng der Luciferase RNA als interne Kontrolle für jede Probe für Normalisierung Zweck.
      Hinweis: Luciferase Primer sollte als interne Kontrolle verwendet werden, um die Ergebnisse zu normalisieren.
    4. Jedes Rohr 700 µL RNA-Extraktion-Reagenz (monophasisch Lösung von Phenol und Guanidin erfolgt; siehe Tabelle of Materials) hinzufügen. Mischen Sie gut und inkubieren Sie die Rohre für 5 min bei RT (Raumtemperatur).
    5. Fügen Sie 140 µL Chloroform und Wirbel für 15 S. Inkubation für 2-3 min bei RT
    6. Zentrifugieren Sie Proben für 15 min bei 12.000 X g bei 4 ° C.
    7. Übertragen Sie die oberen wässrige Phase sorgfältig auf einen neuen Schlauch.
    8. Da der RNA-Gehalt der Fraktionen nicht hoch ist, fügen Sie hinzu, 10 µg von Glykogen als Träger jedes Rohr.
    9. Jedes Rohr 350 µL Isopropanol hinzufügen. Gut mischen und Inkubation bei-20 ° C für 1 h, um den Ertrag zu steigern.
    10. Zentrifuge für 15 min bei 12.000 X g bei 4 ° C.
    11. Verwerfen Sie den überstand und fügen Sie 700 µL Ethanol 75 % um die RNA-Pellet zu waschen.
    12. Zentrifuge für 5 min bei 7.500 X g bei 4 ° C.
    13. Ethanol zu entfernen und die Pellet-Luft für 10 – 15 min. trocknen lassen.
      Hinweis: Über Trocknung der RNA-Pellet wird seine komplette Solubilisierung im Wasser verhindern.
    14. Aufschwemmen der RNA Pellet in 50 μl RNase-freie ultrapure H2O.
    15. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei 55 ° c
    16. Verwenden Sie 2 μL jeder Probe zu messen, die Qualität und Quantität der extrahierten RNA und speichern den Rest bei-80 ° C.
  2. Reversen Transkription und qPCR
    1. Verwenden Sie 4 μL der reversen Transkription cDNA Synthese kit (siehe Tabelle der Materialien) für eine 20 μL Reaktion. Vorbereiten der Supermix entsprechend der Anzahl der Proben. Jedes Rohr 5 μL der Eingabe RNA hinzufügen und das erforderliche Volumen auf jedes Rohr übertragen. Dieses Volumen kann korrigiert werden, um für den Bereich der Taq Polymerase Arbeitsbedingungen relevant sein.
    2. Inkubieren Sie die Rohre in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm vom Hersteller empfohlen: 5 min bei 25 ° C, 20 min reversen Transkription für 20 min bei 46 ° C und Inaktivierung der reversen Transkriptase für 1 min bei 95 ° C.
    3. Das optimierte Programm für jedes Paar Zündkapseln qPCR mitlaufen.
      Hinweis: Um das Vorhandensein bestimmter mRNAs in Sekundenbruchteilen zu erkennen, sollte gleiches Volumen aus jeder Fraktion (der isolierten RNA) für reverse Transkription verwendet werden.
  3. Analyse der Ergebnisse
    1. Verwenden Sie den Ct Wert interessiert Gens und die Luciferase Delta Ct-Werte berechnen
    2. Zum Ausdruck bringen Sie jeden Bruchteil Delta Ct Wert als Prozentsatz des Gesamtwerts mRNA enthalten in allen Fraktionen, die Verteilung der mRNA über die verschiedenen Fraktionen (Tabelle 1) zu visualisieren

4. Isolierung und Analyse von MiRNAs aus Polysome Brüche und Nontranslating Brüche

  1. Gewinnung von mRNA und miRNA
    Hinweis: Dieses Protokoll folgt des Herstellers, mit ein paar Änderungen.
    1. Tauen Sie das Glykogen und das Spike-Steuerelement. Halten Sie auf dem Eis.
    2. 200 µL der gepoolten Probe 700 µL MiRNA Extraktion Reagenz hinzufügen.
    3. Fügen Sie 1 µg/µL von Glykogen und homogenisieren Sie es mit der Pipette zu. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. 3,5 µL 1,6 x 108 Spike-Steuerelement hinzufügen und mischen.
    5. Fügen Sie 200 µL Chloroform und Vortex es mindestens 15 Sekunden lang.
    6. 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Zentrifuge bei 12.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
    8. Mit einer Pipette, den überstand auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen. Die mittleren und unteren Phasen zu verwerfen.
    9. Der Überstand 1,5 X Volumen von 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie es.
    10. Übertragen Sie 700 µL dieser Mischung auf die MiRNA-Extraktion-Spalte und Zentrifugieren sie mit voller Geschwindigkeit für 15 s bei RT und entsorgen der durchströmten; Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer verbleibenden Probe.
    11. Die Spalte 700 µL Puffer 1 hinzu und Zentrifugieren sie mit voller Geschwindigkeit für 15 s bei RT; entsorgen Sie den Durchfluss.
    12. Die Spalte 500 µL Puffer 2 hinzufügen und Zentrifugieren sie mit voller Geschwindigkeit für 15 s bei RT; entsorgen Sie den Durchfluss.
    13. Die Spalte 500 µL von 80 % Ethanol hinzu und mit voller Geschwindigkeit für 2 min bei RT Zentrifugieren; entsorgen Sie den Durchfluss.
    14. Die Spalte, um eine neue 2 mL uncapped Rohr, öffnen Sie den Deckel und Zentrifugieren es bei RT 5 min mit voller Geschwindigkeit zu übertragen; entsorgen Sie den Durchfluss.
    15. Hinzufügen der Spalte und die Zentrifuge es bei voller Geschwindigkeit für 1 min bei RT. halten Sie das Eluat auf Eis oder bei-80 ° C zur späteren Analyse speichern 16 µL RNAse-freies Wasser.
      Hinweis: Zwei Mikroliter jeder Probe kann für OD Analyse verwendet werden.
  2. Reverse Transkription
    1. Vorbereitung auf dem Eis. Fügen Sie für jeweils 20 µL RT-PCR-Reaktion 4 µL des Puffers MiRNA RT, 2 µL von Nukleinsäuren, 9 µL Gesamt-RNS, 2 µL Enzym und 3 µL RNAse-freies Wasser hinzu; mischen und kurz nach unten zu drehen.
    2. Richten Sie den Thermocycler folgendermaßen:
      37 ° C für 60 min;
      95 ° C für 5 min;
      4 ° C zu halten.
    3. Entfernen Sie die Rohre aus den Thermocycler und fügen Sie 200 µL RNAse-freies Wasser hinzu. Bei-20 ° C lagern Sie oder fahren Sie mit der Real-Time PCR.
  3. Real-Time PCR
    Hinweis: Dieses Protokoll folgt 96-well-Platte-Format. Bereiten Sie die Reaktion Mischung auf Eis.
    1. Bereiten Sie PCR Reaktion Mischung zu und cDNA (von MiRNAs oben) nach der Reihe durch das Protokoll angenommen. Mehrfache Reaktionen können im Batch vorbereitet werden.
    2. Fügen Sie eine Gesamtmenge von 25 µL des PCR-Mixes + cDNA in jede Vertiefung.
    3. Die Dichtplatte mit einer optischen Platte Dichtung.
    4. Zentrifugieren Sie die Platte für 1 min bei 1.000 X g bei Raumtemperatur.
    5. Programm der Echtzeit-Cycler wie folgt:
      Erstaktivierung Schritt bei 95 ° C für 15 min;
      3-Stufen-Radfahren: Denaturierung bei 94 ° C für 15 s; Glühen bei 55 ° C für 30 s; Erweiterung bei 70 ° C für 30 s (Fluoreszenz-Datenerfassung durchführen); Hinzufügen von 40 Zyklen;
      Schmelzen-Kurve nach Cycler Standard.
  4. Vergleichende Analyse
    1. Beispiel der Normalisierung (siehe Tabelle 2):
      1. Finden Sie der SCM minimalen Wert.
      2. Die SCM-Werte auf das Minimum zu normalisieren.
      3. Dieser Wert von der Ct-Werte von MiRNAs (MOI) und Referenz-gen (REF) subtrahieren.
      4. Analysieren von Daten mit Hilfe der Formel 2-ΔCt .

5. Proteomic Analysen

  1. Extraktion von Proteinen aus Polysome Brüche
    1. Kombinieren Sie gesammelten Saccharose Brüche in drei Endkörnungen. Markieren Sie die Brüche als schwere (hocheffiziente Polysomes in gepoolten Bruchteilen 4, 5, 6 und 7 mit der höchsten Konzentration von Saccharose, Boden des Röhrchens gradient), Licht (geringe Effizienz Polysomes in gepoolten Bruch 8, 9, 10 und 11; Mitte der Gradient Rohr) und nicht zu übersetzen (gepoolte Brüche 12, 13, 14 und 15 mit der niedrigsten Konzentration von Saccharose; Oberseite des Gradienten Rohres). Führen Sie Protein Assay auf gepoolten Brüche.
    2. 100 % Aktien der Trichloressigsäure Säure (TCA) bereiten und bei 4 ° C im Dunkeln lagern. Mischen Sie 0,5 mL der Probe mit 60 µL 100 % TCA und bei-20 ° C über Nacht im Dunkeln inkubieren.
      Hinweis: Verwenden Sie 1,5 mL eiweißarme Aufbewahrung Rohre (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Nach der Inkubation über Nacht Auftauen der Probe auf Eis und Zentrifuge bei 15.000 X g, 4 ° C für 30 min. verwerfen überstand.
      Hinweis: 100 µg des gesamten Proteins in Probe gibt sichtbar Protein Pellet am unteren Rohr.
    4. Pre-chill Aceton bei-20 ° C-Gefrierschrank. Die Protein-Pellet und Zentrifuge bei 15.000 X g, 4 ° C für 15 min. verwerfen überstand 0,5 mL kaltem Aceton hinzufügen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
    5. Das Pellet der Luft trocknen lassen. Das Pellet in 360 µL 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8) aufzuwirbeln.
      Hinweis: Bei Bedarf verwenden Sie eine Puls-sonikator um das Pellet aufzuwirbeln.
    6. Hinzufügen von 40 µL 0.1 M Dithiothreitol (Endkonzentration 10 mM) und inkubieren Sie bei 55 ° C auf Shaker für 45 min. hinzufügen 50 µL 0,15 M Iodoacetamide (Endkonzentration 17 mM) und bei Raumtemperatur auf Shaker für 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.
    7. Bereiten Sie Trypsin Lösung: 20 µg von Trypsin in 100 µL 50 mM Ammonium Bicarbonat aufzuwirbeln. Probe bei 01:50 (w/w) entsprechende Volumen der Trypsin-Lösung hinzufügen Trypsin: Protein-Verhältnis zu gewährleisten, dass pH ist 8 und über Nacht auf Shaker bei 37 ° C inkubieren.
      Hinweis: Fügen Sie 1 M Ammonium Bicarbonat pH 8 zu bringen.
    8. Nach Trypsin-Verdauung coole Probe, Zentrifuge in Bank-Zentrifuge, kurz hinzufügen, 10 % Ameisensäure pH 2 – 3 und die Trypsin-Aktivität zu stillen, und fahren mit der Probe Entsalzung.
      Hinweis: Verwenden Sie µ-Elution Platte für Probe Entsalzung.
    9. Zustand der Sorbens in den Vertiefungen der 96-well-Platte mit 200 µL Methanol mittels Vakuum dreimal gefolgt von Konditionierung von 200 µL 0.1 % Ameisensäure dreimal. Probe zu laden und eine Probe waschen mit 200 µL 0.1 % Ameisensäure dreimal durchführen. Eluieren Sie die Probe mit 100 µL 50 % acetonitrile/0.1% Ameisensäure zweimal in eiweißarme Aufbewahrung 0,5 mL Röhrchen.
      Hinweis: Eluieren Probe langsam zunächst mit Gravitation gefolgt von Grobvakuum auf.
    10. Verdampfen Probe Eluat, Trockenheit mit Konzentrator und entweder direkt durchführen, Massenspektrometrie-Analyse oder Store bei-80 ° C bis zur Verwendung.
  2. Massenspektrometrie-Analyse
    1. Jedes Pellet (bestehend aus den Folgen Peptide) in 50-100 µL rekonstruieren und in Massen-Spektrometer 1 µL injizieren.
      Hinweis: Optimieren Sie Rekonstitution und Injektion Bände um maximale Intensität, die LC/MS/MS-signal zu erhalten. In unserem Fall das maximale Signal (total Ionenstrom; TIC) in das Herz des Scans war im Bereich der 1E8, 2E9.
    2. Verwenden Sie eine Trap-Säule C18 (i.d. 300 µm x 5 mm, 5 µm, 100Å) gefolgt von Peptid-Abscheidung mittels C18-Säule (i.d. 75 µm x 250 mm, 2 µm, 100Å) mit einem Fluss Kursstellung bei 300 nL/min Set Nano Quelltemperatur Kapillare bis 275 ° C und die Spray-Spannung, 2 kV.
    3. Beantragen Sie einen linearen Farbverlauf von 5 – 35 % B für 90 min, 35 – 95 % B für 3 min bei 95 % B für 7 min und Gleichgewichtherstellung at 5 % B für 25 min (A: 0,1 % Ameisensäure/Wasser und B: 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril). MS2-Spektren für die 15 höchsten Intensität Ionen aus jedem MS1-Scan mit CID-Modus zu erwerben. Verwenden Sie 3 Massenspektrometrie Wiederholungen für jede Probe analysiert.
      Hinweis: Optimieren Sie und nutzen Sie die experimentellen Bedingungen und Parameter, die für Ihre Proben auf dem bestimmten Massenspektrometrie Instrument geeignet sind. In Abschnitt 5.2 genannten Bedingungen/Parameter. verwendet wurden und in unserem Labor optimiert.
  3. Protein-Identifikation/Quantifizierung
    1. Nach Analyse der Massenspektrometrie wandeln Sie die rohen Spektren Dateien in kompatibel MzXML Dateien mit MSConvert Software (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. Senden Sie die konvertierten Dateien in SEQUEST Suchmaschine mit den Suchkriterien, z. B. UniProtKB/Swiss-Prot Maus Datenbank (aktuellsten kanonische überprüft); Semi-Enzym Digest mit Trypsin (nach KR /-); mit bis zu 2 verpasste Spaltungen; Vorläufer Massenbereich: 400 bis 4.500 amu; statische Änderung: Carbamidomethyl (C) 57,021465 amu; Peptid Masse Toleranz: 50 ppm; Masse Typ Fragment: Monoisotopic.
      Hinweis: Andere Protein-Datenbank-Suche Motoren und Daten Pipelines können verwendet werden. Wenn Datenbank für z.B. Ratte, die als Datenbanken für Maus und Mensch weniger abgeschlossen ist, müssen Sie gegen/Maus (oder Menschen) suchen Datenbanken Proteom Abdeckung zu erhöhen. In diesem Fall müssen die Redundanz in Protein-Namen entfernt werden.
    3. Führen Sie eine Post-Suche-Analyse. Setzen Sie Filter für die Anzeige der Daten. Legen Sie beispielsweise eine minimale Protein Wahrscheinlichkeit (Protein-Schwelle) als 95 % oder 99 %, d. h. , die nur die Proteine, für die eine statistische Analyse 95 % oder 99 % Wahrscheinlichkeit beinhaltet des Seins in der Probe vorhanden, angezeigt werden. Setzen Sie den Filter für Peptid-Schwelle (z.B. 95 %), d. h. eine minimale Wahrscheinlichkeit, die bei der Bestimmung, ob ein Spektrum eine Peptid identifiziert verwendet werden. Wählen Sie die Mindestanzahl von Peptiden, die bestimmen, ob ein Protein vorhanden ist (2 Peptide als ein Minimum für Proteinidentifizierung wird empfohlen).
    4. Identifizierte Proteine für Qualität/Quantität zu bewerten. Stellen Sie sicher, dass Proteotypic Peptide für die Quantifizierung verwendet werden. Wenn Isoform identifiziert wird sicherstellen Sie, dass es basiert auf der Beobachtung eines tryptic Peptids, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz für die Spezifische Isoform eindeutig ist. Alle "ähnlich" oder hypothetische Proteine sollten unterziehen Vergleich zu sehen, ob die beobachteten Peptide entsprechen zu einem bekannten Protein.

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Ergebnisse

mRNA-Analyse
mRNA-Ergebnisse können als Gewinnausschüttung einer bestimmten mRNA in jedem Bruchteil (Abbildung 3A); Kombinieren Sie für die Quantifizierung polyribosomal Übersetzung Brüche und vergleichen Sie nicht übersetzen Bruchteil (Abb. 3 b), präsentiert ein Verhältnis von mRNA Fülle nontranslating Fraktionen zu übersetzen. Weitere Informationen gewinnt man durch die Untersuchung der hocheffiziente Polysome Frakt...

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Diskussion

Polysome Profilanalyse ermöglicht die Untersuchung von Protein-Übersetzung durch die Analyse von translationalen Bundesstaat eine spezifische mRNA oder die ganze Transkriptom-6,-7. Es ist auch eine große Hilfe, wenn lokale Übersetzung werden, wie z. B. Synaptosomes8 untersucht muss. Diese Methode umfasst traditionell die Trennung von Mono - und Polyribosomes und die damit verbundenen mRNAs auf einer Saccharose-Steigung welche mit genomisch...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand Frauen-Herz-Zentrum (RAG, JVE), Dorothy und E. Phillip Lyon Stuhl in Molekulare Kardiologie (RAG), Erika Glazer Stiftungslehrstuhl im Herzgesundheit der Frau (JVE) und Tschechische Akademie der Wissenschaften Institutionelle Unterstützung RVO: 68081715 (MS).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PentobarbitalVortech Phamaceuticals9373für die Euthanasie
Heparin-Agent103424in Langendorff-Präparationszangen verwendet
Fine Science Tools91110-10zum Aufhängen des Herzens
Langendorff-SystemRadnoti + hausgemachtn/aEin 'Vier-Herz'-System bestehend aus speziell mundgeblasenem Glas, Schläuchen und Wasserbädern
NaClSigma S7653-5KGKrebs Puffer und Saccharose
Gradient KClSigmaP5405Krebs Puffer und Lyse Puffer
KH2PO42SigmaP-5504Krebs
Puffer MgSO4SigmaM7774-500GKrebs
Puffer GlucoseSigmaG5767Krebs-Puffer
CaCl2SigmaC1016-500GKrebspuffer
SaccharosepulverSigmaS0389-1KGSaccharosegradient
MgCl2Sigma208337Saccharosegradient und Lysepuffer
Tris-BaseSigmaT1503-1KGSaccharosegradient und Lysepuffer
XylolcyanolSigmaX-4126Saccharosegradient
CycloheximidSigma-aldrich239763Saccharosegradient und Lysepuffer
RNaseOUTLife TechnologiesC00019RNAse-Inhibitor für Lysepuffer
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021Lysepuffer
Proteasehemmer Cocktailtabletten, EDTA-freiRoche5056489001
Röhrchen, dünnwandig, ultraklar, 13,2 mL, 14 mm x 89 mmBeckman Schar344059
UltrazentrifugeBeckmanLE-80KUltrazentrifugation der Gradienten
RotorBeckman SW41Ultrazentrifugation der Gradienten
Biologic LP (Pumpe)Biorad731-8300Fraktionierung der Gradienten
BioFracBiorad741-0002Fraktionierung der Gradienten
Eppendorf RNA/DNA LoBind Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL RöhrchenSigmaZ666513-100EAGradientenfraktion und RNA-Extraktion
TRIzol ReagentLife technologiesAM9738RNA-Extraktion
Luciferase Control RNAPromegaL4561RNA-Extraktion
ChloroformFisher ScientificC606-4RNA Extraktion
Glykogen, RNA-QualitätThermo Fisher ScientificR0551RNA-Extraktion
IsopropanolSigmaI9516RNA-Extraktion
EthanolSigmaE7023-1LRNA-Extraktion
iScript cDNA-SynthesekitBioRad170-8891Reverse Transkription
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122Quantatives PCR
miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084Kit für die Gesamt-RNA-Isolierung
miScript II RT Kit (50)Qiagen218161Kit für die reverse Transkription
miScript Sybr Green PCR Kit (200)Qiagen218073Kit für die Echtzeit-PCR-Expressionsanalyse von miRNAs
Zentrifuge 5424REppendorfZum Zentrifugieren von 1,5 mL oder 2,0 mL Röhrchen bei unterschiedlichen Temperaturen. Maximale Geschwindigkeit - 21130 x g
Zentrifuge 5810REppendorfFür die Echtzeit-PCR-Plattenzentrifugation bei verschiedenen Temperaturen. Maximale Geschwindigkeit - 2039 x g
My Cycler Thermal CyclerBio-RadFür die reverse Transkription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal CyclerBio-RadFür die Echtzeit-PCR-Analyse
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-SteuerungQiagen219610Für die Qualitätskontrolle der RNA-Isolierung
Hartschalen-96-Well-PCR-Platten, flaches Profil, dünnwandig, umrandet, grün/transparentBio-RadHSP9641Für die Echtzeit-PCR-Analyse
Microseal 'B' PCR-Plattenversiegelungsfolie, selbstklebend, optischBio-RadMSB1001Für die Echtzeit-PCR-Plattenversiegelung
Research plus Einkanalpipette, Grau; 0,5-10 & Mikro; LEppendorfUX-24505-02Zum Pipettieren
PIPETMAN Classic Pipetten, P20GilsonF123600GZum Pipettieren
PIPETMAN Classic Pipetten, P200GilsonF144565Zum Pipettieren
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µ LGilson17011782Zum Pipettieren von
Glykogen, RNA-QualitätThermo Fisher ScientificR0551Verbessert die Gesamteffizienz der RNA-Isolierung
Posi-Click 1,7 mL Röhrchen, naturfarbenDenvilleC2170RNA-Isolierung und -Lagerung; Reagenzienmischung
Thermal Cycling Tubes -0,2 mL Individual Caps, Standard 0,2 mL Tubes mit optischDenvilleC18098-4 (1000910)Reverse Transkriptionsreaktion
Sharp 10 Präzisions-BarrierespitzenDenvilleP1096-FRZum Pipettieren
Sharp 20 Präzisions-BarrierespitzenDenvilleP1121Zum Pipettieren
Sharp 200 Präzisions-BarrierespitzenDenvilleP1122Für Pipettierspitzen
LTS 1 mL FilterRaininRT-L1000FZum Pipettieren
miScript Primer Assay ( 200)Qiagen(es ändert sich entsprechend der miRNA)Für die Echtzeit-PCR-Analyse
Gradient Master Version 5.3 Modell 108BioComp InstrumenteZur Herstellung von Saccharosegradienten
TrichloressigsäureSigma AldrichT6399
AcetonSigma Aldrich650501 Trishydrochlorid
AmrescoM108
DithiothreitolFisher ScientificBP172
IodacetamidGbiosciencesRC-150
modifiziertes Trypsin in Sequenzierungsqualität,Schweine PromegaV5111
AmmoniumbicarbonatBDHBDH9206
Ameisensäure, Optima LC/MSFisher ChemicalA117
Methanol, Optima LC/MSFisher ChemicalA454
Acetonitril, Optima LC/MSFisher ChemicalA996
Protein LoBind Röhrchen 0,5 mLEppendorf AG22431064
Protein LoBind Röhrchen 1,5 mLEppendorf AG22431081
HLB & micro; Elutionsplatte 30 & Mikro; mOasis186001828BA
SpeedVac KonzentratorThermo ScientificSavant SPD2010
UltraschallgerätQsonicaOasis180
ZentrifugeThermo ScientificSorvall Legend micro 21R
LC Fallensäule PepMap 100 C18Thermo Scientific160454
LC Trennsäule PepMap RSLC C18Thermo Scientific164536
MassenspektrometerThermo ScientificOrbitrap Elite Ionenfallen-Massenspektrometer
MSConvert SoftwareProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST SoftwareSage-N Research, Inc.

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