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Methodenartikel

In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (THGM)

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DOI:

10.3791/58087

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10. September 2018

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1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Immunology Programme, Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Cancer Science Institute of Singapore, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM)-Helferzellen von naiven CD4 + T-Zellen, einschließlich Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen, Differenzierung von THGM, zu differenzieren und Analyse von differenzierten Zellen THGM. Diese Methode kann auf Studien der Verordnung und Funktion von THGM Zellen angewendet werden.

Zusammenfassung

Der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF)-Herstellung von T-Helfer (THGM)-Zelle ist eine neu identifizierten T Helfer Zelle Teilmenge, die überwiegend sondert GM-CSF ohne Herstellung von Interferon (IFN) γ oder Interleukin (IL)-17 und wird festgestellt, dass Spielen Sie eine wesentliche Rolle in der autoimmunen Neuroinflammation. Eine Methode zur Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen aus einer einzelligen Aussetzung der splenocyten und THGM Zellgeneration von naiven CD4 + T-Zellen wäre eine nützliche Technik in der Studie von T zellvermittelte Immunität und Autoimmunerkrankungen. Hier beschreiben wir eine Methode, die Maus naive CD4 + T-Zellen in THGM Zellen gefördert durch IL-7 unterscheidet. Das Ergebnis der Unterscheidung wurde durch die Analyse der Zytokine Ausdruck mit verschiedenen Techniken, einschließlich intrazelluläre Zytokin Färbung kombiniert mit Durchflusszytometrie, eine quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR), beurteilt und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA). Mit dem T-H-GM Differenzierung Protokoll wie beschrieben hier, etwa 55 % der Zellen ausgedrückt GM-CSF mit einem minimalen Ausdruck IFNα oder IL-17. Der vorherrschende Ausdruck von GM-CSF von THGM Zellen wurde durch die Analyse des Ausdrucks von GM-CSF, IFNα und IL-17 mRNA und Protein Ebene bestätigt. So können mit dieser Methode, naive CD4 + T-Zellen, T zu unterscheidenHGM Zellen in Vitro, die werden in der Studie von THGM Zellbiologie.

Einleitung

CD4 + T-Helferzellen (TH) sind wesentliche Bestandteile des Immunsystems, da entscheidende Rollen in der Wirt Verteidigung gegen mikrobielle Krankheitserreger, in der Krebs-Überwachung, und Autoimmunität1,2,3. Bei der T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierung naive CD4 + T-Zellen differenzieren sich in TH1, TH2, TH 17 oder regulatorischen T (Treg) Zellen unter dem Einfluss von verschiedenen Zytokin Milieus2,4, 5. vor kurzem eine neue Untergruppe von TH Zellen, die überwiegend GM-CSF produziert, wurde identifiziert und benannt THGM6. Die Differenzierung der Zellen THGM treibt IL-7 durch die Aktivierung von einem Signalwandler und Aktivator der Transkription 5 (STAT5). Diese Zellen eine große Menge von GM-CSF zum Ausdruck bringen und dabei eine geringe Expression von anderen T-H-Handy-Signatur Zytokine wie z. B. IFNγ und IL-176. GM-CSF erwies sich als eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von CD4 + T-Zell-vermittelten Neuroinflammation7,8. GM-CSF mit dem Ausdruck T Zellen im Vergleich zu IFNγ oder IL-17-exprimierenden autoreaktiven T-Zellen, in Wildtyp übertragen (WT) Mäusen verursacht ein früher Krankheitsbeginn und höheren Schweregrad der Erkrankung. Darüber hinaus scheiterte Csf2- / - T-Zellen induzieren Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) nach adoptively auf WT-Empfänger übertragen werden, während T-Zellen IFNγ oder IL-17A fehlt die Fähigkeit, EAE7vermitteln beibehalten. Darüber hinaus verbessert eine Blockade von GM-CSF mit neutralisierenden Antikörpern EAE Krankheit schwere8. Darüber hinaus führte ein Mangel an STAT5 in T-Zellen in Mäusen in einer verminderten THGM-Generation und somit in einen Widerstand von den Mäusen EAE Entwicklung6. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von GM-CSF mit dem Ausdruck TH Zellen in autoimmune schwere Krankheit. So wäre eine Methode um GM-CSF mit dem Ausdruck TH Zellen von naiven CD4 + T-Zellen zu unterscheiden in der Untersuchung der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen Neuroinflammation und T-Zell-vermittelten Immunantwort wichtig. Allerdings erzeugt ein Protokoll, das effizient THGM Zellen aus murinen naive CD4 + nicht etabliert hat.

Hier präsentieren wir eine Methode, die naive CD4 + T-Zellen murine THGM Zellen unterscheidet. Dieses Protokoll beschreibt das gesamte Verfahren, einschließlich der Entnahme der Milz von der Maus, die Vorbereitung eine einzellige Suspension, die CD4 positive Selektion, die Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und die TH Zelle Differenzierung und Analyse. Die differenzierte T-Helferzellen werden analysiert, indem intrazellulären Zytokin Färbung kombiniert mit Durchflusszytometrie zu bestimmen, die Cytokine Ausdruck Ebene einzellige durch eine quantitative Echtzeit-PCR die Zytokin-Expression auf mRNA-Ebene zu bestimmen und von ELISA die Zytokin-Expression auf proteinebene zu bewerten. Diese Methode kann auf Studien von THGM Zellbiologie unter verschiedenen Bedingungen, wie z. B. EAE, angewendet werden, wo GM-CSF eine wichtige Rolle in der Pathogenese spielt.

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Protokoll

Alle Mäuse, die in diesem Protokoll verwendeten waren auf den genetischen Hintergrund der C57BL/6 und unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen an der National University of Singapore untergebracht. Alle Experimente wurden durchgeführt mit Protokollen, die durch die institutionellen Animal Care and Use Committee von der National University of Singapore genehmigt.

(1) Reagenz und Vorbereitung des Materials

  1. Bereiten Sie 500 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), enthält 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA vor).
    Hinweis: Halten Sie den Puffer auf dem Eis während des gesamten Verfahrens um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  2. Bereiten Sie 50 mL komplette RPMI Medium mit RPMI 1640, 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin vor. Verwenden Sie vollständige RPMI Medium mit 50 µM β-Mercaptoethanol fürH-GM T-Zell-Differenzierung. Fügen Sie der β-Mercaptoethanol in einer Dampfhaube.
  3. Bereiten Sie 7,5 mL eines Anti-CD3e-Antikörper-Gemisches durch Anti-CD3e konzentriert Lager 3 μg/ml in PBS verdünnen. Beschichten Sie 48-Well Platten zu, indem jedes gut 150 μL der Antikörper-Mischung hinzufügen und über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für mindestens 1 h oder bei 4 ° C.
  4. Sterilisieren Sie ein paar Scheren und Pinzetten zu und halten sie in 70 % igem Ethanol zwischen Sezierungen.

2. Vorbereitung des murinen Splenocyten

  1. Einschläfern die Maus (von 6 – 8 Wochen alt) mit einem institutionell genehmigt CO2 Erstickung oder Zervikale Dislokation. Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol und Klebe es auf polystyrolblock auf dem Rücken. Übertragen Sie die Maus zu einem biologischen Sicherheitsschrank mit den folgenden Schritten fortfahren.
  2. Halten Sie die Haut mit einer Pinzette und schneiden Sie die Haut unterhalb des Brustkorbs auf der linken Seite für ca. 4 cm, mit einer Schere. Öffnen Sie die peritoneale Sac zu entlarven die Milz und sterilen Pinzette verwenden, um die Milz zu extrahieren.
  3. Legen Sie ein 70 μm Zelle Sieb auf eine 50 mL-Tube und vornässen Sie es mit 2 mL des Puffers. Legen Sie die Milz auf der Zelle-Sieb (2 – 3 Milz für eine Zelle Sieb) und mazeriert mit Ende des Spritzenkolbens eine 5 mL.
  4. Spülen Sie den Filter und Schlauch mehrmals mit 1 – 2 mL Zelle isoliert Puffer bis alle Zellen in das Rohr gespült werden. Entsorgen Sie die Zelle Sieb und Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
  5. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 5 mL kalt (4 ° C) Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lyse Puffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0, 1 mM Na2EDTA; pH 7,2-7,4) und vorsichtig mischen sie für 2 min. Fügen Sie 10 mL komplette RPMI-Medien, die ACK zu neutralisieren Puffer und sofort Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie den überstand nach der Zentrifugation.

3. Isolation der CD4 + T-Zellen mit magnetischen CD4 Microbeads und eine Zelle Trennsäule

  1. Die Zelle Pellet in 5 mL Zelle isoliert Puffer aufzuwirbeln. Filtern Sie die Zellsuspension mit Vorabscheidung Filter (30 μm) in eine neue 15-mL-Tube, um alle Ablagerungen zu entfernen.
  2. 10 μL der Zellsuspension und machen Sie eine 10 X Verdünnung durch Zugabe von 90 μL des Puffers. Nehmen Sie 10 μl verdünnter Zellsuspension und mischen Sie es mit 10 μL Trypan blau für Zellzählung. Zählen der Zellen in einer Hemocytometer, die Rendite der lebensfähigen Zellen bestimmen.
  3. Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C und den überstand verwerfen.
  4. Die Zellen in 90 μL des Puffers pro 107 Zellen aufzuwirbeln. Fügen Sie 10 μL der magnetischen CD4 Microbeads pro 107 Zellen. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei 4 ° c Um optimale Ergebnisse zu erzielen Mischen der Zellsuspension sanft alle 5 Minuten während der Inkubation.
  5. Während die Zellen Inkubation werden, setzen Sie eine Trennsäule auf die magnetische Halterung. Vornässen der Spalte mit 2 mL des Puffers.
  6. Am Ende der Zelle/Wulst Inkubation waschen Sie die Zellen mit 5 mL des Puffers und Zentrifugieren sie 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
  7. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL des Puffers, laden Sie die Probe in die Zelle Trennsäule und lassen Sie es fließen. Verwenden Sie ein 15-mL Zentrifugenröhrchen, um den Anteil der CD4-Zellen zu sammeln. Fügen Sie 1 mL des Puffers, das Reservoir zu waschen, bevor er trocken ist. Wiederholen Sie Waschschritt 2 X.
  8. Entfernen Sie die Zelle Trennsäule aus der Magnetstativ und legen Sie es auf einem neuen Zentrifugenröhrchen 15 mL. Die Zelle Trennsäule 2 mL Zelle isoliert Puffer hinzu und wenden Sie den Kolben fest, um die Zellen aus der Spalte zu erzwingen.
  9. Zentrifugieren Sie den Bruch bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C, CD4 +-Zellen zu erhalten. Verwerfen Sie den überstand.

4. Reinigung der Naive CD4 + T-Zellen (CD4+CD25–CD44loCD62LHallo) durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und THGM Differenzierung

  1. Die erhaltenen CD4 + Zellen Pellet in 500 µL Puffer aufzuwirbeln. Mischen Sie die Zellen mit einem Leuchtstoff-konjugierten Antikörpern Gemisch mit CD4-PerCp (2,8 µg/mL), CD44-APC (2,4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL), und CD62L-FITC (10 µg/mL) (Tabelle 1). Inkubieren Sie die Zellen für 20-30 min auf Eis und vor Licht zu schützen.
    Hinweis: Die Konzentrationen der Antikörper wurden bisher im Labor optimiert. Die Anzahl der Antikörper aufgeführt ist für Zellen von 1 – 2 Mäuse.
  2. Nach der Inkubation der Zellen mit 5 mL des Puffers zu waschen und Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min bei 4 ° c
  3. Den überstand verwerfen und Zellen in 500 µL Puffer aufzuwirbeln. Filtern Sie die Zellen wieder mit einem Nylon-Netzgewebe.
  4. Übertragen Sie die Zellsuspension auf einen FACS-Schlauch für Zellsortierung. Precoat FACS primärgefäßen mit 500 µL Puffer.
  5. Erhalten eine CD4+CD25–CD44loCD62LHallo Bevölkerung (der naiven CD4+ T Zellen) durch FACS sortieren. Tor auf CD4+CD25– erste, und wählen Sie dann CD44loCD62LHallo Zellen aus dieser Population.
  6. Sammeln Sie die naiven CD4+ T Zelle Fraktionen in einem neuen 15-mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C und den überstand verwerfen.
  7. Aufzuwirbeln Sie die naive CD4 + T-Zellen in einer Konzentration von 106 Zellen/mL in komplette RPMI Medium mit 50 µM β-Mercaptoethanol.
  8. Aspirieren Sie die Anti-CD3e-Antikörper für die anschwemmung in der 48-Well-Platte verwendet. 0,25 Millionen (250 µL) Samenzellen in jede Vertiefung mit IL-7 (2 ng/mL), Anti-CD28 (1 µg/mL) und Anti-IFNγ (10 µg/mL) (Tabelle 1).
    Hinweis: Die Konzentrationen von Antikörpern und Zytokinen wurden bisher im Labor für ein THGM Zelldifferenzierung optimiert.
  9. 3 Tage inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2 . Ändern Sie das Medium nicht während der Inkubation.

5. Analyse der Maus THGM Zellen erzeugt In Vitro

  1. Überprüfen Sie unter Verwendung eines Mikroskops, die Zelldifferenzierung 3 d nach der Differenzierung. Ernten der Zellen und Zentrifugieren sie 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Waschen Sie die Zellen 2 X mit kompletten RPMI-Medien.
    Hinweis: Differenzierte Zellen sind größer als naive CD4 + T-Zellen.
  2. Die Zellen in 1 mL der komplette RPMI Medien aufzuwirbeln. Nehmen Sie 10 μl Zellsuspension und mischen Sie es gut mit 10 μL Trypan blau, um die Anzahl von Zellen mit einer Hemocytometer zu bestimmen. Teilen Sie differenzierte Zellen in drei Tränke für eine Restimulation und Analyse.
    Hinweis: Intrazelluläre Zytokin Färbung und ELISA-Assays erfordern ≥0.5 Millionen Zellen und qPCR Analyse erfordert ≥ 1 Million Zellen.
  3. Für intrazelluläre Zytokin Färbung, restimulieren Zellen mit Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) (100 ng/mL) und Ionomycin (1 μg/mL) in Anwesenheit von Protein-Transport-Inhibitor (1 µL/mL) für 4 – 6 h.
    1. Ernten der Zellen und Färben sie mit Anti-CD4 Antikörper (PerCP konjugiert, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung; oder FITC-konjugiert, 0,5 mg/mL, 1: 100 Verdünnung) für 30 min.
    2. Befestigen Sie die Zellen mit 200 μl Puffer Fixierung für 20 – 60 min. Waschen Sie nach der Fixierung der Zellen 2 X mit 1 mL Permeabilisierung Puffer.
    3. Führen Sie intrazelluläre Färbung mit Antikörper gegen GM-CSF (PE-konjugiert, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung), IL-17A (FITC-konjugiert, 0,5 mg/mL, 1: 100 Verdünnung; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung), IL-4 (APC-konjugiert, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung) und IFNγ (APC-konjugiert, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, 1: 100 Verdünnung) für 30 min in der Dunkelheit.
  4. Aktivieren Sie für eine qPCR-Analyse der Zytokin-Genexpression durch differenzierte Zellen die Zellen mit Platte gebundene Anti-CD3e (3 μg/mL) (auftragwerk der Platte wie unter Punkt 1.3 beschrieben). Um 3 Uhr nach der Stimulation Ernte der Zellen, um die Gesamt-RNS mit ein Phenol RNA-Extraktion-Reagenz zur cDNA Vorbereitung das qPCR zu isolieren. Die Grundierungen und Programm für die qPCR verwendet sind in den Tabellen 2 und 3, aufgeführt.
  5. Restimulieren Sie für die Analyse der Zytokin Protein Sekretion von differenzierten Zellen Zellen mit Platte gebundene Anti-CD3e (3 μg/mL) für 24 h (auftragwerk der Platte wie unter Punkt 1.3 beschrieben). Ernten Sie die Zellkultur überstand für IL-17 und GM-CSF ELISA ihre Konzentration zu bestimmen.

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Ergebnisse

Naive CD4 + T-Zellen, die aus zwei 8 Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen isoliert wurden in drei Teile unterteilt. Ein Teil der Zellen unterschieden wurde in THGM Zellen nach dem Protokoll beschrieben. Ein weiterer Teil wurde unter einer Bedingung THGM in Anwesenheit von Anti-IL-4 Antikörper (10 µg/mL) kultiviert, um den Einfluss einer IL-4-Blockade bei der Differenzierung von THGM zu testen. Der letzte Teil war unter einer TH17 Differenzieru...

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Diskussion

Wir beschrieben hier ein Protokoll von einer in-vitro- THGM Differenzierung von Maus-naive CD4 +-Zellen, gefolgt von einer Analyse der differenzierten Zellen, die Methode zu validieren. Der Hinweis Milz und Lymphknoten naive CD4 + T-Zell-Reinigung und THGM Differenzierung einsetzbar. Die Cytokine Ausdruck von intrazellulären Zytokin Färbung kombiniert mit Durchflusszytometrie zeigte, dass etwa 55 % der Zellen bestimmt waren veranlasst, GM-CSF-exprimierenden Zellen unter der Bedingung T...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National University Health System of Singapore (T1-2014 12. Oktober und T1-2015-10 Sep).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RPMI 1640BiowestL0500-500
FBS HitzeinaktivierterSteinbockFBS-HI-12A
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
1x PBS1. BaseBUF-2040-10Verdünnt auf 1x PBS in sterilem Wasser
EDTA1. BaseBUF-1053-100ml-pH8.0
10x ACK PufferBiolegend420301in sterilem Wasser verdünnt
ZellsiebSPL Life Sciences93070
CD4 MikrokügelchenMiltenyi Biotec130-049-201
2-MercaptoethanolSigmaM7522
LS SäuleMiltenyi Biotec130-042-401
MagnetständerMiltenyi Biotec130-042-303
1 mL SpritzeTerumoSS+01T
ZentrifugeEppendorfEppendorf 5810R
Sony SY3200 ZellsortiererSonySony SY3200 Zellsortierer
50 mL konisches ZentrifugenröhrchenGreiner Bio-One210261
15 mL konisches ZentrifugenröhrchenGreiner Bio-One188271
FACS RöhrchenCorning352054
24-Well-ZellkulturplatteGreiner Bio-One662160
Anti-Maus CD4 PerCP-eFluor 710eBioscience46-0041-82
PE konjugiertes Anti-Maus CD25 (IL-2Ra, p55)eBioscience12-0251-82
Anti-Mensch/Maus CD44 APCeBioscience17-0441-82
Anti-Maus CD62L FITCeBioscience11-0621-85
Neubauer-verbesserte ZählkammerMarienfeld640010
Hyclone Trypan Blue SolutionGE healthcare Life SciencesSV30084.01
MikroskopNikonNikon Elipse TS100
gereinigt  Anti-Maus CD3e  AntikörperBiolegend100314
Gereinigter Hamster Anti-Maus CD28BD Biosciences553295
Gereinigte Ratte  Anti-Maus-IFNγ  eBioscience16-7312-85
Aufgereinigter Anti-Maus-IL-4-AntikörperBiolegend504102
rekombinantes Maus-IL-7-ProteinR& D-System407-ML
rekombinantes humanes TGF-betaF& T & D-System240-B-010
PMAMerck Millipore19-144
IonomycinSigmaI0634
GolgiPlug ProteintransportinhibitorBD Biosciences51-2301KZ
Intrazelluläre Fixierung& Permeabilisierungspuffer seteBioscience88-8824-00
Anti-Maus GM-CSF PEeBioscience12-7331-82
FITC Anti-Maus IL-17ABiolegend506908
APC Anti-Maus IFN-gammaBiolegend505810
GO Taq qPCR Master MixPromegaA6002
Maus GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!invitrogen88-7334-88
Maus IL-17A Uncouted ELISAinvitrogen88-7371-22

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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