Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Produktion Haus fliegen Carboxylesterase Proteine in Vitro mit einem Baculovirus vermittelte Insekt Ausdruck Zellsystem und später funktionell charakterisieren ihre Rolle bei der Metabolisierung Permethrin, dadurch konferieren pyrethroid Widerstand von zellbasierten MTT-Assay und in-vitro- metabolische Studien.
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Methodenartikel
Funktionelle Charakterisierung von Carboxylesterases in Insektizid gegen Stubenfliegen, Musca Domestica
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Carboxylesterase vermittelte Stoffwechsel wird gedacht, um in Insektizid Widerstand bei verschiedenen Insekten eine wichtige Rolle spielen. Mehrere Carboxylesterase Gene wurden bis in die resistenten Haus fliegen Belastung geregelt gefunden, während ihre Rolle bei der Übertragung der Insektizid Widerstand blieb um erkundet zu werden. Hier haben wir ein Protokoll für die funktionelle Charakterisierung von Carboxylesterases entwickelt. Drei Beispiel-Experimenten werden dargestellt: (1) Ausdruck und Isolation von Carboxylesterase Proteinen durch ein Insekt Baculovirus-vermittelten Zellsystem Ausdruck Spodoptera Frugiperda (Sf9); (2) eine zellbasierte MTT (3-[4, 5-Dimethykthiazol-2-Yl] -2, 5-Diphenyltetrazolium-Bromid) Zytotoxizität Assay, Messen Sie die Toleranz von Insektenzellen gegenüber verschiedenen Permethrin Behandlungen; und (3) in-vitro- metabolische Studien, die metabolische Funktionen des Carboxylesterases in Richtung Permethrin zu erkunden. Die Carboxylesterase gen, die MdαE7 aus einem beständigen Haus geklont wurde Belastung ALHF fliegen und verwendet, um eine rekombinante Baculovirus für Sf9 Zellen Infektion zu konstruieren. Die Zelle künstliche gegen verschiedene Permethrin Behandlungen wurden mit dem MTT-Assay gemessen. Die verbesserte Zell Toleranz der Versuchsgruppe (MdαE7-rekombinante Baculovirus infizierte Zellen) im Vergleich zu den Kontrollgruppen (CAT-rekombinante Baculovirus infiziert und GFP-rekombinante Baculovirus infizierte Zellen), permethrin in metabolisierenden Insektizide, dadurch Schutz der Zellen vor chemischen Schäden vorgeschlagenen Behandlungen die Funktionen des MdαE7. Darüber hinaus wurden Carboxylesterase Proteine in Sf9 Insektenzellen ausgedrückt und isoliert, um eine in-vitro- metabolische Studie durchzuführen. Unsere Ergebnisse zeigten eine signifikante in Vitro stoffwechseleffizienz des MdαE7 in Richtung Permethrin, direkt auf die Einbeziehung der Carboxylesterases in metabolisierenden Insektizide und verleiht somit Insektizid Widerstand im Haus fliegt.
Einleitung
Insektizid-Widerstand ist derzeit ein wichtiges Thema der Haus Fliegenbekämpfung weltweit1,2. Bemühungen um den Mechanismus der Insektizid Widerstand bestimmen erleichtert dieses Problem besseren zu verstehen und somit für neue Strategien, um effektiv zu verhindern oder zu minimieren die Ausbreitung der Widerstand Entwicklung3. Carboxylesterases, haben eine Menge Aufmerksamkeit für ihre Rollen in Sequestrierung und metabolisierenden Insektizide in verschiedenen Insekten4,5,6als eines der wichti....
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Protokoll
1. Ausdruck und Isolation von Zielproteinen mit einem Insekt Zelle Baculovirus-vermittelten Expressionssystem
- Direktional Klonen Sie PCR-Produkte von Zielproteinen von Stubenfliegen Blunt beendet.
- Design-PCR Primer grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und das Haus fliegen MdαE7 gen basierend auf ihre Sequenzen und die besonderen Anforderungen des gewählten Vektors (Tabelle 1).
- Verwenden Sie ein Lektorat, thermostabile DNA-Polymerase und Primer aus Schritt 1.1.1 150 µL-PCR-Reaktion (30 µL Puffer Reaktion, 3 µL 10 mM dNTPs, 1,5 µL DNA-Polymerase, 6 µL Haus fliegen Schablone DNA, 7,5 µL vorwärts Grundierung durchführen 7,5 µL....
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Ergebnisse
Die Zellviabilität gegenüber verschiedenen Permethrin Behandlungen (MTT-Assay)
Die Zytotoxizität von Permethrin wurde im MdαE7-rekombinante Baculovirus infiziert Sf9 (Versuchsgruppe) und CAT-rekombinante Baculovirus (bereitgestellt von Baculovirus infiziert Kit) infizierte Zellen (Kontrollgruppe) untersucht. Die verstärkte Zelle Toleranzen zu Permethrin in MdαE7 mit dem Ausdruck Zellen stark unterstützen die metabolische Rollen die.......
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Diskussion
In den letzten Jahrzehnten haben heterologen Expressionssysteme verbreitet zu äußern und große Mengen von Proteinen, so dass Biochemische und funktionelle Bestimmung und Charakterisierung der Enzyme in Vitrozu isolieren. Bisher wurden mehrere verschiedene Modellsysteme wie Escherichia coli, Pichia Pastoris, Sacccharomyces Cerevisiaeund Spodoptera Frugiperda angepasst für rekombinante Proteinexpression und die Wahl des der in-vitro- System ist entscheidend für groß ang.......
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel-Extraktionskit | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Klonierungskit mit einem Schuss TOP10 Chemisch kompetente E. coli | Invitrogen von life technology | K240020 | S.O.C. Medium und universelle M13-Sequenz-Primer waren in diesem Kit enthalten. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen von life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Enzymmischung für BaculoDirectTM Kits | Invitrogen von life technology | 11791-023 | |
| BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit | Invitrogen von life technology | 12562-019 | Cellfectin Transfektionsreagenz und Ganciclovir waren in diesem Kit enthalten |
| pENTR-CAT Plasmid | Invitrogen von life technology | Enthalten im BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, Konzentration: 0,5 μg/μl | |
| Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, zertifiziert | von Gibco by Life Technologies | 10082-139 | |
| Sf9-Zellen in Sf-900 III SFM | Gibco von Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insektenzellproteinextraktion & Lysis Buffer | G Biosciences von A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1&fach;) Serum Free Medium Complete | Gibco von Life Technologies | 12658-019 | |
| Grace's Insect Medium, unsupplementiert | Gibco von Life Technologies | 11595030 | |
| Permethrin (Isomere) analytischer Standard | SUPELCO von Solutions WithinTM | 442748 | |
| Methanol (analytisch bewertet) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitril (analytisch sortiert) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Spritzenvorsatzfilter mit 0,45 μ m GHP-Membran (HPLC-zertifiziert) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 HPLC System | Waters | ||
| T100 Thermal | Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. | ||
| Nanodrop 2000/2000c Spektralphotometer | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
Referenzen
- Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
- Li, M., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
