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Ein High-Performance Liquid Chromatography-Messung von Kynurenin und Kynurenic Säure: Biochemie zur Kognition und Schlaf bei Ratten

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DOI:

10.3791/58129

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19. August 2018

 ,  ,  , 
1Maryland Psychiatric Research Center, Department of Psychiatry, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Pharmacology, University of Maryland School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Änderungen in den Kynurenin Weg (KP) neuroaktive Metaboliten sind in psychiatrischer Erkrankungen verwickelt. Untersuchung der funktionellen Ergebnisse einer veränderten Kynurenin Weg Stoffwechsel in Vivo bei Nagern kann helfen, neue therapeutische Ansätze zu erläutern. Das aktuelle Protokoll verbindet biochemischen und Verhaltensstörungen Ansätze zur Untersuchung der Auswirkungen einer akuten Kynurenin Herausforderung bei Ratten.

Zusammenfassung

Kynurenin Weg (KP) der Abbau von Tryptophan hat bei psychiatrischen Erkrankungen verwickelt. Insbesondere die Astrozyten abgeleitet Metabolit Kynurenic Säure (KYNA), ein Antagonist an beide N-Methyl-d-Aspartat-(NMDA) und α7 Nikotinsäure Acetylcholin (α7nACh)-Rezeptoren, hat in kognitiven Prozessen in Gesundheit und Krankheit in Verbindung gebracht. Wie KYNA Ebenen in den Gehirnen von Patienten mit Schizophrenie erhöht sind, ist eine Störung an der glutamatergen und cholinergen Rezeptoren angenommen, kausal, Kognitive Dysfunktion, eine zentrale Domäne der Psychopathologie der Krankheit bezogen werden. KYNA kann bei Personen mit Schizophrenie eine Pathophysiologisch wichtige Rolle spielen. Es ist möglich, endogene KYNA im Nagetier Gehirn zu erhöhen, durch Behandlung von Tieren mit der direkten Bioprecursor Kynurenin und präklinische Studien an Ratten haben gezeigt, dass akute Erhebungen KYNA ihre lernen und Gedächtnis Prozesse auswirken können. Das aktuelle Protokoll beschreibt dieser experimentellen Ansatz im Detail und kombiniert (a) eine biochemische Analyse der Kynurenin-Spiegel im Blut und Gehirn KYNA Bildung (mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie), (b) Verhaltens Tests, um die Sonde die hippocampal-abhängige kontextuellen Speicher (passive Vermeidung Paradigma) und c) eine Bewertung der Schlaf-Wach-Verhalten [telemetrischen Aufnahmen kombinieren Elektroenzephalogramm (EEG) und Elektromyogramm (EMG) Signale] bei Ratten. Zusammen genommen, eine Beziehung zwischen erhöhten KYNA, Schlaf und Kognition untersucht wird, und dieses Protokoll beschreibt im Detail einen experimentellen Ansatz zum Verständnis der Funktion Ergebnisse der Kynurenin Höhe und KYNA Bildung in Vivo an Ratten. Ergebnisse, die durch Variationen dieses Protokolls werden die Hypothese zu testen, dass die KP und KYNA entscheidende Rolle in der Modulation, Schlaf und Kognition in Gesundheit und Krankheit Staaten dienen.

Einleitung

Der KP ist verantwortlich für fast 95 % der essentiellen Aminosäure Tryptophan1entwürdigend. In das Gehirn von Säugetieren ist in erster Linie durch das Enzym Kynurenin Aminotransferase (KAT) II2Kynurenin Astrozyten berücksichtigt in neuroaktive niedermolekularer KYNA metabolisiert. KYNA wirkt als Antagonist an NMDA und α7nACh Rezeptoren im Gehirn2,3,4, und auch Ziele Signalisierung Rezeptoren einschließlich der Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AHR) und dem G-Protein gekoppelten Rezeptor 35 (GPR35)5 ,6. Bei Versuchstieren Erhebungen im Gehirn KYNA nachweislich beeinträchtigen ihre kognitive Leistungsfähigkeit in einem Array von Verhaltensstörungen Assays2,7,8,9,10 . Eine neue Hypothese besagt, dass KYNA so weitere Unterstützung die Rolle der Astrozyten abgeleitete Moleküle Modulation der Neurobiologie des Schlafes eine wesentliche Rolle spielt bei der Modulation der kognitiver Funktionen durch Auswirkungen auf Schlaf-Wach-Verhalten-11, und Kognition-12.

Klinisch wurden Erhebungen KYNA im Liquor cerebrospinalis und Post-Mortem Hirngewebe von Patienten mit Schizophrenie13,14,15,16, eine lähmende psychiatrische Erkrankung gefunden gekennzeichnet durch kognitive Beeinträchtigungen. Patienten mit Schizophrenie sind oft auch von Schlafstörungen geplagt, die die Krankheit17verschlimmern können. Verständnis der Rolle der KP-Stoffwechsel und KYNA Modulation eine Beziehung zwischen Schlaf und Kognition, insbesondere zwischen Lernen und Gedächtnis, führen zu der Entwicklung neuartiger Therapien für die Behandlung von diese schlechte Ergebnisse bei Schizophrenie und anderen psychiatrischen Erkrankungen.

Eine zuverlässige und konsistente Methode zur Messung der KP Metaboliten ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Forschung aus verschiedenen Institutionen in das wissenschaftliche Verständnis der KP Biologie integriert werden kann. Heute beschreiben wir die Methodik zur Messung der Kynurenin im Ratte Plasma und KYNA im rattengehirn durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Das vorliegende Protokoll, das macht eine fluorimetrischen Erkennung im Beisein von Zn2 +nutzen, wurde zuerst von Shibata18 und mehr vor kurzem angepasst und optimiert, um mit 500 mM Zinkacetat als Post-Spalte-Reagenz, zulassend derivatize entwickelt die Erkennung von endogenen, nanomolaren Mengen von KYNA in der Gehirn-11.

Um die de Novo endogenen KYNA Produktion anregen wie in diesem Protokoll beschrieben, ist die direkte Bioprecursor Kynurenin intraperitoneal injiziert (i.p.) bei Ratten. In Kombination mit biochemischen Tests zu prüfen, inwieweit KYNA Produktion die Auswirkungen einer Kynurenin Herausforderung auf dem Hippokampus-abhängige Speicher (passive Vermeidung Paradigma) und ist auch der Schlaf-Wach-Architektur (EEG und EMG-Signale) untersuchten11. Eine Kombination dieser Techniken ermöglicht die Studie über die biochemische und funktionelle Auswirkungen eines Kynurenin Herausforderung in Vivo an Ratten.

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Protokoll

Unsere experimentelle Protokolle wurden von der University of Maryland institutionelle Pflege der Tiere und Use Committee genehmigt und gefolgt von den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

Hinweis: Erwachsene männliche Wistar-Ratten (250-350 g) wurden in allen Experimenten eingesetzt. Separate Kohorten von Tieren wurden für Biochemische Analyse, Verhaltensexperimente und Schlaf-Wach-Aufnahmen verwendet. Die Tiere wurden in einer temperaturgesteuerten Anlage des Maryland psychiatrischen Forschungszentrums untergebracht. Sie wurden auf einem 12/12 h Hell-Dunkel-Zyklus, mit Lichtern Zeitpunkt Zeitgeber (ZT) 0 und Licht aus bei ZT 12 übernommen. Die Tiere erhielten ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser während der Experimente. Die Anlage wurde von der American Association für die Akkreditierung von Laboratory Animal Care voll anerkannt.

(1) intraperitoneal Kynurenin Verabreichung an Ratten

Hinweis: In diesem Protokoll wurde Kynurenin an ZT 0 (Beginn der leichten Phase) verwaltet und Gewebe war gesammelt um ZT 2 und ZT 4 einen zeitlichen Verlauf für den Stoffwechsel von Kynurenin zu bestimmen. Kochsalzlösung injiziert Tiere dienten als Kontrolle. Zum Beispiel, wenn eine Ratte 500 g wiegt und die gewünschte Dosis 100 mg/kg beträgt, erhalten die Ratte eine 5 mL-Injektion von 10 mg/mL Lösung von Kynurenin.

  1. L-Kynurenin Sulfat ("Kynurenin") wiegen Sie ab und in eine 20 mL-Glasflasche. Achten Sie darauf, den Kynurenin auf Eis zu halten.
  2. Fügen Sie hinzu, um die gewünschte Konzentration zu erreichen und stellen den pH-Wert auf 7,6 1 N Natriumhydroxid (NaOH) mit Kochsalzlösung. Wirbel und beschallen die Lösung, bis die Kynurenin vollständig aufgelöst hat.
    Achtung: Befolgen Sie alle Empfehlung Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit NaOH.
    1. Zum Beispiel um eine 10 mg/mL Lösung zu erreichen, 200 mg Kynurenin wiegen Sie ab und legen Sie sie in eine Glasflasche. 15 mL Kochsalzlösung und Vortex hinzugeben und beschallen (20 kHz für 5 – 10 s, 1/8 Zoll Durchmesser Microtip) darin auflösen. Mit NaOH, Einstellen der pH-Wert der Lösung. Schließlich verwenden Sie Kochsalzlösung zur Einstellung der Lautstärke bis 20 mL.
  3. Wiegen Sie jede experimentelle Ratte und berechnen Sie das Volumen jeder Injektion anhand des Tieres Körpergewicht und gewünschte Behandlungsdosis. Sorgfältig entfernen Sie das Tier aus seinem Hause Käfig, intraperitoneal, die Lösung zu injizieren, und das Tier in seinen Käfig zurück.

(2) Kynurenin Messungen mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie

  1. Gewebe-Sammlung
    Hinweis: In diesem Protokoll wurde Kynurenin an ZT 0 (Beginn der leichten Phase) verwaltet und Gewebe war gesammelt um ZT 2 und ZT 4 einen zeitlichen Verlauf für den Stoffwechsel von Kynurenin zu bestimmen. Kochsalzlösung injiziert Tiere dienten als Kontrolle.
    1. Verwenden Sie Kohlendioxid, das Tier einzuschläfern. Nachdem die Zeichen der Atmung für 1 min aufgehört haben, führen Sie eine sekundäre Euthanasie-Methode durch Enthauptung.
    2. Um ganze Stamm Blut zu sammeln, setzen Sie einen Einweg-Trichter in einem 15 mL Röhrchen mit 20 μl der K3-EDTA (0,5 M). Lassen Sie das Blut aus dem Körper in die Röhre fließen. Invertieren Sie das Rohr immer wieder, um sicherzustellen, dass die EDTA in der gesamten gemischt wird.
    3. Mit Schere, schneiden Sie die Haut oben auf dem Kopf nach unten von der Mittellinie des Schädels aussetzen. Entfernen Sie alle überschüssigen Hals Muskel auf der Rückseite des Schädels und bei der Eröffnung für das Rückenmark durch den Schädel von hinten nach vorne geschnitten.
      1. Ziehen Sie die beiden Seiten des Schädels offen für das Gehirn aussetzen, und entfernen Sie dann vorsichtig das Gehirn mit der Pinzette nicht zu beschädigen. Die olfaktorischen Birnen mit einer Rasierklinge zu entfernen und das Gehirn in der Mitte hinunter die Mittellinie schneiden. Mit Pinzette, sezieren Sie die Hemibrain in Regionen von Interesse (d. h., dem Hippocampus und der Kortex).
    4. Legen Sie alle sezierten Gehirns Stücke auf Alufolie auf Trockeneis. Nachdem das Gewebe komplett gesperrt, es zu einem Kunststoff 20 mL-Fläschchen zu übertragen und bei-80 ° c Lagern
    5. Zentrifugieren der ganze Stamm Blut bei 300 X g für 10 min. entfernen den überstand (Plasma) und überträgt es in neue Zentrifuge Röhrchen vor der Aufbewahrung bei-80 ° C.
  2. Vorbereitung der Probe
    1. Plasma: gesammelt von behandelten Tieren
      1. Tauen die gefrorenen Tube mit Plasma (siehe Schritt 2.1 für die Gewebe-Sammlung) auf nassem Eis.
      2. Verdünnen Sie in einem neuen Zentrifugenröhrchen die Probe mit Reinstwasser (1:2 für Kynurenin, 01:10 für KYNA). 100 μl der verdünnten Probe fügen Sie 25 μL der Perchlorsäure 6 hinzu %.
        Achtung: Befolgen Sie alle Empfehlung Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Perchlorsäure.
      3. Vortex alle Proben, dann Zentrifugieren sie 12.000 x g für 10 Minuten. Sobald beendet, entfernen Sie 100 μl des Überstands (aus jedem Röhrchen) und legen Sie sie zu einem kleinen 0,25 mL Microcentrifuge Schlauch für den Kynurenin oder KYNA Entschlossenheit.
    2. Gehirn: gesammelt von behandelten Tieren
      1. Legen Sie Rohre mit gefrorenen Gehirn Proben (siehe Schritt 2.1 für die Gewebe-Sammlung), auf Trockeneis. Wiegen Sie einzeln jedes Gehirn-Muster auf eine präzise Analysenwaage. Schicken Sie es an das Rohr und setzen Sie es wieder auf Trockeneis.
      2. Nachdem alle Proben gewogen haben, bewegen Sie die Rohre auf nassem Eis. Verdünnen Sie jede Probe 01:10 w/V mit Reinstwasser und homogenisieren sie mit einem sonikator (20 kHz für 5 – 10 s, 1/8 Zoll Durchmesser Microtip). Zum Beispiel für 100 mg des Gehirngewebes fügen Sie 900 μl von Reinstwasser hinzu.
      3. Aliquoten 100 μL jeder verdünnt zu einem neuen Schlauch probieren und mit 25 μL der 25 % Perchlorsäure Ansäuern. Wirbel, es dann bei 12.000 X g für 10 min zentrifugieren.
      4. Entfernen Sie nach der Zentrifugation 100 μl des Überstandes zu und legen Sie es in kleinen 0,25 mL Mikrozentrifugenröhrchen für die Bestimmung von KYNA.
  3. HPLC-Einrichtung und Ausführung
    1. 50 mM Natrium Acetat mobilen Phase vorzubereiten. 6,81 g Natrium Acetat Trihydrate in 1 L von ultrareinem Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6.2 mit Eisessig und Vakuum Filtern sie dann in saubere Gläser. Übertragen Sie die Natrium-Acetat mobile Phase auf eine saubere 1 L-Glas-Flasche.
    2. 500 mM Zinkacetat vorzubereiten. Lösen Sie 54,88 g Zinkacetat in 500 mL Reinstwasser, auf, dann Vakuum filtern. Übertragen sie eine saubere 500 mL-Glasflasche. Füllen Sie eine 1 L Flasche mit Reinstwasser und eine 500 mL-Flasche mit HPLC Grade Acetonitril.
    3. Legen Sie die Aufnahme Schläuche von der HPLC-Maschine separat in der mobilen Phase, die Reinstwasser und 100 % Acetonitril. Pumpen Sie die Zink-Acetat-Lösung separat durch eine Peristaltische Pumpe, die mit der mobilen Phase Post-Spalte und vor der Derivatisierung verbindet.
    4. Programmieren Sie mit Hilfe der Systemsteuerung auf dem Computer, 5 % Acetonitril und 95 % Reinstwasser 0,5 mL/min. für 20-30 min einen stabilen Druck und Grundlinie zu laufen lassen laufen zu lassen.
    5. Beim Einrichten einer stabilen Basislinie, ändern Sie die Zusammensetzung der Lösung in 5 % Acetonitril und 95 % Natrium Acetat mobilen Phase. Equilibrate für 30 min.
    6. Schalten Sie die Lampe in der Fluoreszenz-Detektor und lassen Sie es zum Aufwärmen.
    7. In der Zwischenzeit erlauben Sie auch Schalten Sie die Pumpe nach Spalte einen Durchfluss von 0,1 mL/min es, einen stabilen Druck von etwa 500 Psi nach circa 20 min zu erreichen.
    8. Bereiten Sie die Standards.
      1. Für KYNA, beginnen mit einer 1 mM Stammlösung und verdünnen Sie es um 5 standard Konzentrationen vorzubereiten (d.h.10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1 nM und 500 pM).
        Hinweis: Dies wird eine Standardkurve von 200 Fmoles bis 10 Fmoles pro 20 μL Injektion produzieren.
      2. Für Kynurenin, beginnen mit einer 1 mM Stammlösung und verdünnen Sie es um 5 standard Konzentrationen vorzubereiten (d.h., 10 μm, 5 μm, 2,5 μM, 1 μM und 500 nM).
        Hinweis: Dies wird eine Standardkurve von 200 Pmoles bis 10 Pmoles pro 20 μL Injektion produzieren.
    9. Richten Sie die HPLC-System-Software auf die Probe-Sequenz-Parameter steuern und ermöglichen die Autoinjections mehrerer Proben.
      1. Wenn im Fenster "Ausführen Sample" klicken Sie auf "Datei" und ziehen Sie nach unten auf "Create New Probe Set". Wenn das neue Fenster geöffnet wird, wählen Sie "Leer". Listen Sie einzeln aller Standards (siehe Schritt 2.3.8) oder Proben in der Reihenfolge, wie, die Sie ausgeführt werden soll auf.
      2. Bezeichnen Sie in der Spalte "Funktion" die Standards und Proben. Die Standards sollten am Anfang und Ende der Sequenz untersucht. Wasser zwischen jedem 5 Proben zu injizieren.
      3. Die Bearbeitungszeit für jede Probe auf 15 min. Spritzen 20 μl der Probe aus der Standards und der Plasma-Vorbereitung oder injizieren Sie 30 μl der Probe aus dem Gehirn Homogenat Vorbereitung zu.
      4. Legen Sie die Anregung und Emission Wellenlängen (abhängig von der Verbindung geprüft) für Kynurenin zur Anregung: 365 nm, Emission: 480 nm und Verweilzeit: ~ 6 min, und für KYNA Anregung: 344 nm, Emission: 398 nm und Verweilzeit: ~ 11 min.
      5. Nachdem alle Parameter festgelegt wurden und die Maschine hat equilibriert, Ausführen der Sequenzablaufs.
      6. Um die Daten zu quantifizieren, navigieren Sie zum Fenster "Projekt durchsuchen". Auf der Registerkarte "Sample-Sets" doppelklicken Sie auf das Sample-set quantifiziert werden. Markieren Sie aus der Liste der alle Injektionen alle Standards und mit der rechten Maustaste. In dem neuen Fenster wählen Sie "Prozess", dann mit der Drop-Down-Menü "Kalibrieren und Quantitate" wählen neben "Wie":.
      7. Markieren Sie alle Standards wieder, mit der rechten Maustaste und wählen Sie "Bearbeiten". Wenn Chromatogramme öffnen, verwenden Sie die Schaltflächen am oberen Rand zu "Integrieren" und dann "Kalibrieren" jeder Standard; Dadurch wird automatisch die Standardkurve erstellt.
      8. Zurück zur Registerkarte "Sample-Sets" und doppelklicken Sie auf das SampleSet. Markieren Sie als nächstes alle Standards. Wiederholen Sie der Prozess, sondern vielmehr gesagt "Quantitate" aus der Drop-Down-Menü auswählen. Markieren Sie alle Proben wieder, dann mit der rechten Maustaste und wählen Sie "Bearbeiten". Wenn Chromatogramme öffnen, verwenden Sie die Schaltflächen am oberen Rand "Integrieren" und dann "Quantitate" jeder probieren.
        Hinweis: Dies wird die Konzentration von jeder Probe basierend auf der zuvor erstellten Standardkurve ausgeben.

3. passive Vermeidung Paradigma

Hinweis: Diese Verhaltensexperimente wurden basierend auf unsere biochemischen Ergebnisse mit akuten Kynurenin Herausforderung entwickelt. Zur Maximierung der Zunahme Gehirn KYNA wurde Kynurenin (100 mg/kg) verabreicht am ZT 0, 2 h vor dem Training in die passive Vermeidung Paradigma hippokampale vermittelte lernen, testen, die an ZT 2 aufgetreten ist. Die Apparatur besteht aus 2 gleich großen Fächern (21,3 cm hoch, 20,3 cm breit und 15,9 cm tief) durch eine Guillotine Tür getrennt und in einer schalldichten Box enthalten. Die beiden Fächer des Tests Apparates sind "dunkle Seite" und "dark Side" bezeichnet. Die Wände von der hellen Seite liegen auf der Hand, und während der Versuche ein Licht leuchtet auf um weitere beleuchten dieses Fach. Die Wände von den dunklen Raum sind vollständig abgedeckt, um einen Black-out-Zustand zu erhalten.

  1. Tag 1: Training trial
    1. Reinigen Sie vor der Prüfung das Gerät mit 70 % Ethanol.
    2. Bringen Sie die Tiere in den Prüfraum.
    3. Sanft legen Sie das Versuchstier in der hellen Seite der Apparate und schließen und verriegeln Sie der Apparat Tür und die schalldichten Box.
    4. Mit der zugehörigen Software, beginnen Sie den Test. Wählen Sie aus dem home-Bildschirm "Datei" und dann "Open Session" aus der Drop-Down-Menü. Stellen Sie in dem neuen Fenster sicher, dass das richtige Verfahren und die Vorrichtung ausgewählt sind und klicken Sie auf "Schließen". Als nächstes wählen Sie "Konfigurieren" und dann "Signale". Wählen Sie in dem neuen Fenster das richtige Gerät und klicken Sie auf "Problem".
      Hinweis: Die Software wird ein Licht einschalten in die helle Seite des Apparates und die Guillotine Tür zwischen die beiden Fächer beginnen. Ein Timer wird initiiert.
    5. Wenn das Tier vollständig betritt die dunkle Seite der Vorrichtung, die Guillotine Tür wird geschlossen und eine unausweichliche Fuß Schock (0,56 mA für 1 s) geliefert werden.
    6. Aufzeichnung der Zeit, die vergangen ist, bevor das Tier den dunklen Raum eingetragen.
    7. Nachdem das Tier den Schock erhalten hat, können 30 s der Recovery-Zeit bevor Sie das Tier aus dem Gerät entfernen.
    8. Legen Sie das Tier zurück in seine Heimat Käfig.
    9. Vor Beginn die Studie mit dem nächsten Tier, wischen Sie das Gerät sauber mit einem nassen Handtuch und entsorgen Sie fäkalen Pellets.
    10. Nachdem die Tiere trainiert haben, kehren sie an die Tierstation.
  2. Tag 2: Test Test
    1. Bringen Sie Tiere zurück in den Prüfraum 24 h nach dem Training-Prozess. Beginnen Sie die Tests Test für das erste Tier indem es in die helle Seite des Apparates, schließen und Verriegelung der Tür und die schalldichten Box.
    2. Die Test Studie mit den gleichen Software-Befehlen wie am Vortag zu initiieren; das Licht schaltet sich in die helle Seite des Apparates und die Guillotine Tür zwischen die beiden Fächer öffnet. Ein Timer wird initiiert.
    3. Wenn das Tier den dunklen Raum betritt, wird die Guillotine Tür schließen. Rekord verstrichene Zeit.
      Hinweis: Die Testversion beendet werden über die Software nach maximal 300 s bleibt das Tier auf die helle Seite des Tests Apparates.
    4. Legen Sie das Tier zurück in ihre Heimat Käfig und reinigen Sie das Gerät (wie in Schritt 3.1.9 beschrieben) vor Beginn der Studie mit dem nächsten Tier.

4. Schlafanalyse

  1. Chirurgische Implantation ein EEG/EMG-Funksender
    Hinweis: Die Telemetrie Sender sollten sterilisiert und vor der Operation vorbereitet.
    1. Mit einer Rasierklinge, entfernen Sie vorsichtig eine kleine Länge der Kunststoffbeschichtung zu offenbaren, dass der Draht führt. Legen Sie den Sender in einem 50 mL konische Röhrchen gefüllt mit Sterilisation Lösung [z.B.Wavecide (2,65 % Glutaraldehyd)].
      1. Lassen Sie den Sender in die Desinfektionslösung für mindestens 12 h. Übertragen Sie anschließend vor der Operation die Lösung auf einem Abfallbehälter. Spülen Sie den Sender mit steriler Kochsalzlösung.
    2. Am Tag der Operation belasten Sie das Tier vor dem einsetzen es in einer Narkose-Kammer. 3 – 5 % Isofluran mit 100 % O2zu induzieren.
    3. Entfernen Sie auf eine erfolgreiche Narkose das Tier zu und rasieren Sie sorgfältig, mit einen elektrischen Rasierapparat, oben auf den Kopf und Hals, sowie einen kleinen Patch der Haare auf der Rückseite des Körpers, nur leicht nach links und unterhalb des Brustkorbs.
    4. Carprofen (5 mg/kg) subkutan für postoperative Analgesie zu verwalten.
    5. Legen Sie eine thermostatisch gesteuerte Warmwasser-Heizkissen gesetzt bei 37 ° C unter das Tier, das Tier Körper Temperatur während der Operation.
    6. Legen Sie in einem stereotaktischen Rahmen das Tier auf einem Prüfkopf, Aufrechterhaltung den Narkose Zustand und Ohr Bars um den Kopf zu stabilisieren. Sterilisieren Sie die rasierte Haut durch abwechselnde Tupfer Betadine Scrub mit 70 % Ethanol. Wenden Sie Opthalamic Salbe auf die Augen, sie schmieren an.
    7. Um ausreichende Anästhesie vor dem ersten Schnitt zu gewährleisten, verwenden Sie die Zehe kneiftest.
    8. Mit einem sterilen Skalpell, machen Sie einen Schnitt von knapp hinter den Augen auf der Rückseite des Halses. Der Schädel und die dorsale zervikale Hals Muskel sollte ausgesetzt werden.
    9. Verwenden Sie ggf. den Schädel aussetzen Baumwolle Spitze Applikatoren, um Membranen zu entfernen. Mikro-Bulldog Klemmen können verwendet werden, um die Haut von den Schädel zu halten. Suchen Sie und markieren Sie die Position der Bregma. 2 Burr-Löcher bohren und einsetzen Metallschrauben anterior 2,0 mm / + 1,5 mm Lateral und 7,0 mm posterior /-1,5 mm seitliche im Verhältnis zu den Bregma. Vollständige 2 Umdrehungen festziehen die Schrauben. Die freigelegten Schädel mit einem Stück Gaze abdecken.
    10. Mit sterilen chirurgischen Schere, einen Einschnitt in die Körperhöhle, gerade unterhalb der Rippen machen.
    11. Achten Sie auf dem OP Plan darauf, die Seriennummer des Senders implantiert werden aufzeichnen.
    12. Legen Sie die sterile Senderinnen die Körperhöhle. Die Draht-Leitungen sollte außerhalb des Körpers.
    13. Verwenden Sie resorbierbare Nähte Nähen die muskelwand, um sicherzustellen, dass alle die Leads an einem Ende des Schnittes versammelt sind.
    14. Entfernen Sie die Gaze aus dem Kopf und heben Sie die Haut knapp unter dem Schnitt. Laufen Sie ein paar lange sterile futterzange unter der Haut vom Kopf Schnitt, der Schnitt in der Seite. Halten Sie Druck auf die Haut um Verletzungen zu minimieren.
      1. Sobald die arterienklemmen sichtbar in der Nähe von der Körper-Schnitt sind, clip Membran, die möglicherweise mit bedecken chirurgische Scheren und greifen die vier Sender mit der futterzange führt. Herauszuziehen Sie langsam die arterienklemmen, so dass die Drähte unter der Haut liegen und bis an den Schädel laufen.
    15. Benennen Sie, 2 führt mit dem Schädel verbunden werden. Mit Pinzette, fassen Sie das Ende eines Drahtes mit einer Hand und direkt unterhalb der Kunststoffmantel mit dem anderen Ende. Ziehen Sie den Draht bis einzelne Schleifen nur erfolgen können.
    16. Wickeln Sie fest dem freiliegenden Draht um eines der Metallschrauben 3 – 4 X. Sobald sicher ist, ziehen Sie die Schraube zu verhindern, dass das Kabel entwirren und zusätzlichen Kabel clip. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der zweiten Blei und Schraube.
    17. Ziehen Sie beide EEG führt aus der Körperhöhle, so dass sie gemütlich, gegen den Schädel sitzen.
    18. Dental Zement zu verwenden, um die Schrauben zu decken und kortikalen führt, eine Kappe über den exponierten Schädel zu schaffen. Stellen Sie sicher, dass kein dental Zement auf Haut oder Muskel-sticks und keine scharfen Kanten entstehen. Lassen Sie dental Zement trocknen.
      Hinweis: Die Kappe sollte klein genug sein, dass die Haut über Spitze vernäht werden kann.
    19. Fassen Sie für die EMG führt das Ende des Drahtes und Kunststoffmantel wie in Schritt 4.1.15 beschrieben. Strecken Sie den Draht, bis die einzelnen Schleifen klar erkennbar sind.
    20. 22 G Nadel unter dem Hals Muskel vor so dass sie sich auf der rechten Seite für 2 – 3 mm ausgeführt. Mit nonabsorbable Naht, legen Sie eine einzelne, lose Naht um die eingebetteten Nadel.
    21. Führen Sie das EMG-Seil in die Nadel und ziehen Sie die Nadel heraus, so dass des EMG Drahtes, Faden unter dem Muskel. Ziehen Sie den Faden um sicherzustellen, dass der Draht bleibt bestehen und Clip Extra Draht, die entstehen aus dem Muskel.
    22. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.20 und 4.1.21 für die zweite EMG-Führung, ca. 1 mm nach unten aus dem ersten ausspiel.
    23. Ziehen Sie beide EMG führt aus der Körperhöhle, so dass sie gemütlich, gegen den Muskel sitzen.
    24. Verwenden Sie nonabsorbable Stiche, um den Kopf und Hals Schnitt zu schließen. Verstauen Sie alle extra Draht unter der Haut des Körpers und verwenden Sie Wunde Clips, um den Körper Schnitt zu schließen.
    25. Lidocain-Salbe auf beide Schnitt Websites gerne das Tier mit postoperativen Schmerzen angewendet.
    26. Zurück das Tier seine Heimat Käfig, so dass des Käfigs auf das Heizkissen zu sitzen, bis das Tier von der Narkose erholt hat.
      Hinweis: Das Tier sollte für 7 – 10 Tage vor Beginn der Aufnahmen zu erholen.
  2. EEG/EMG-Aufzeichnung
    Hinweis: In diesem Protokoll wir Kochsalzlösung oder Kynurenin an ZT 0 verabreicht und dann nahm das Tier Schlaf-Wach-Muster für 24 h.
    1. Füllen Sie alle Schlaf-Aufnahmen in einem dafür vorgesehenen Raum, wo die Tiere nicht für die Dauer der Aufzeichnung unterbrochen wird.
    2. Legen Sie die Heimat Käfig des Tieres (angesichts des implantierten EEG/EMG-Senders) auf einer Empfangseinheit. Schalten Sie den chirurgisch implantierten Sender mit Hilfe eines Magneten.
      Hinweis: Ein Licht sollte auf die Empfangseinheit erscheinen, wenn der Sender aktiviert ist.
    3. Richten Sie die Aufzeichnung der EEG/EMG-Daten mit der zugehörigen Software.
      1. Wählen Sie "Experiment" und dann auf "Erstellen" aus dem Dropdown Menü. Benennen Sie das Experiment, und speichern Sie es. Als nächstes wählen Sie "Hardware" und dann "MX2-Konfiguration bearbeiten".
      2. Wählen Sie in dem neuen Fenster alle Sender in das Experiment verwendet und anzugeben Sie, welche empfangenden Pad zugeordnet ist. Wenn Sie bereit sind, initiieren Sie die Aufzeichnung durch Drücken der Taste "Start alle fortlaufend".
    4. Wählen Sie bei Beendigung der Experimente "Beenden alle kontinuierlichen" in der zugehörigen Software und schalten Sie den Sender mit den Magneten.
    5. Einschläfern Sie die Tiere durch CO2 ersticken, gefolgt von einem Herzpunktion. Entfernen Sie den Sender durch Wiedereröffnung des Schnittes entlang der Oberseite des Kopfes mit einer chirurgischen Schere und schneiden die Leitungen frei von der dental Zement und Hals Muskel vorsichtig.
    6. Als nächstes öffnen Sie die Körperhöhle, suchen Sie den Sender und entfernen Sie langsam aus dem Körper zu.
  3. EEG/EMG-Analyse
    1. Verwenden Sie die dazugehörige Software zum Analysieren der Schlaf-Wach-Daten. Öffnen Sie das Programm und wählen Sie "Neuen Speicherort hinzufügen". Wählen Sie in dem neuen Fenster die Daten in das scoring Software importieren.
      Hinweis: Dies erstellt eine neue Datei innerhalb der Software enthält alle rohen Signalverläufe, gesammelt während des Experiments.
    2. Manuell Punkten Sie die Wachsamkeit Staaten für die gewünschte Experimente. Analysieren Sie nach seinem Tor die Parameter wie die Gesamtdauer, die Anzahl der Anfälle und die durchschnittliche Kampf Dauer der verschiedenen Wachsamkeit Staaten [REM (REM), non - REM NREM und Gefolge].
      Hinweis: Die Analyse durchgeführt, über die gesamte Aufnahme oder verkürzt werden kann zu bestimmten Zeitpunkten von Interesse. Hier wurde die Analyse für den Zeitraum der Aufnahme zwischen 0 ZT ZT 2 durchgeführt.

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Ergebnisse

Um die Verwendung einer intraperitonealen Kynurenin-Injektion als eine Methode, um das Gehirn KYNA erheben zu überprüfen, wurde eine HPLC-Analyse des Gewebes durchgeführt. Standardkurven (Abbildung 1) wurden gebaut, mit der zugehörigen Software und erlaubt für die Quantifizierung von Gewebeproben. Repräsentative Chromatogramme Kynurenin und KYNA sind in Abbildung 2dargestellt. Kynurenin wurde bei einer Verweilzeit von 6 min beoba...

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Diskussion

Für eine zuverlässige Bewertung von KYNA im Gehirn nach einer peripheren Kynurenin-Verwaltung ist es wichtig, zu kombinieren und biochemische und funktionelle Experimente zu interpretieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll, das neue Benutzer wirksame Methoden zur Messung der Plasma-Kynurenin und Gehirn von Ratten KYNA herstellen lässt. Die Messung von Kynurenin im Plasma bestätigt die korrekte Injektion und die Messung des Metaboliten KYNA bestätigt die de-Novo -Synthese im Gehirn. Es gibt...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die vorliegende Studie wurde teilweise durch die National Institutes of Health (R01 NS102209) und eine Spende von Clare E. Forbes Trust finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Wistar RattenCharles River Laboratoriesadultes Männchen, 250-350 g
L-KynureninsulfatSai Advantium
ReproSil-Pur C18 Säule (4 mm x 150 mm)Dr. Maisch GmbH
EZ ClipsStoelting Co.59022
Befestigungsmaterial SchraubenPlasticsOne00-96 X 1/16
Nicht resorbierbares NahtmaterialMedRep Express699BCP Medical Monomid Schwarz Nylon Nahtmaterial, 4-0, P-3, 18", BOX mit 12
resorbierbaren NähtenEthiconJ310H4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental CementStoelting Co.51458
BohrerStoelting Co.5145510,45 mm
NameCompany<strong>Katalognummer<strong>Comments
Alliance HPLC System
E2695 TrennmodulWaters176269503
2475 FluoreszenzdetektorWaters
Post-Column-Reagenzien-ManagerWaters725000556
Lenovo-ComputerWaters668000249
Empower-SoftwareWaters176706100
NameCompany<strong>Katalognummerstrong>
Passive Vermeidungsbox für Ratten
MedAssociatesENV-018MDInnenraum: 22" (B) x 22" (H) x 16" (T)
Mittelkanal-Modulator-Shuttle-Box-KammerMedAssociatesENV-010MC
Edelstahl-Gitterboden für RatteMedAssociatesENV-010MB-GF
Automatische Guillotine-TürMedAssociatesENV-010B-S
Schnellverschluss-Shuttle-Gitter-Bodengurt für RattenMedAssociatesENV-010MB-QD
Stimulus-Licht, 1" weiße Linse, montiert auf modularemPanel MedAssociatesENV-221M
mit Lautstärkeregler für RattenkammerMedAssociatesENV-223AM
SmartCtrl 8 Eingänge/16 AusgängeMedAssociatesDIG-716P2
8-Kanal-IR-Steuerung für Shuttle-BoxenMedAssociatesENV-253C
Infrarot-Quellen- und Detektor-Array-StreifenMedAssociatesENV-256
Tisch-Interface-Schrank, 120 V 60 HzMedAssociatesSG-6080C
Aversives Zweibereichs-Konstantstrom-StimulationsmodulMedAssociatesENV-410B
Solid-State-Grid-Boden-Scrambler-ModulMedAssociatesENV-412
Duales A/B-SchockkontrollmodulMedAssociatesENV-415
2' 3-polige Mini-Molex-ErweiterungMedAssociatesSG-216A-2
10' Schock-Ausgangskabel, DB-9 M/FMedAssociatesSG-219G-10
Shuttle-Schockschutzkabel 15', 6MedAssociatesSG-219SA
Kleiner Tischschrank und Netzteil, 120 V 60 HzMedAssociatesSG-6080D
PCI-SchnittstellenpaketMedAssociatesDIG-700P2-R2
Shuttle-Box-Vermeidungs-Utility-PaketMedAssociatesSOF-700RA-7
Name< strong>CompanyKatalognummerComments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah softwareData Sciences International (DSI)PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition InterfaceData Sciences International (DSI)PNM-P3P-MX204
Dell Computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 BitData Sciences International (DSI)271-0112-013
Dell 19" ComputermonitorData Sciences International (DSI)271-0113-001
Empfänger für Kunststoffkäfige, 8xData Sciences International (DSI)272-6001-001
Cisco RV130 VPN-RouterData Sciences International (DSI)RV130
Matrix 2.0Data Sciences International (DSI)271-0119-001
Netzwerk-SwitchData Sciences International (DSI)SG200-08P
Neuroscore SoftwareData Sciences International (DSI)271-0171-CFG
Transmitter mit zwei Biopotentialkanälen, Modell TL11M2-F40-EETData Sciences International (DSI)270-0134-001
186247500Extra hohe MDF-Schalldämpfungskabine Sonalert-Modul

Referenzen

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Kynurenin StoffwechselwegPassives Vermeidungsverhalten ParadigmaSchlaf Wach ArchitekturKontextuelles Ged chtnistestsMessung von Plasma Kynureninzerebrale KYNA BildungHPLC AnalyseFluoreszenzdetektion

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