Methodenartikel

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

DOI:

10.3791/58139

⸱

28. Juli 2018

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir bieten ein Protokoll für in-vitro- Assays der Selbstorganisation von Verstand und mir auf einem unterstützten Lipid Bilayer in eine offene Kammer. Darüber hinaus beschreiben wir, wie der Assay in Lipid-plattiert PDMS Microcompartments in Vivo -Bedingungen durch Reaktion Entbindung imitieren einzuschließen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viele Aspekte der grundlegenden räumlich-zeitliche Organisation der Zellen werden durch Reaktion-Diffusion Schriftsysteme geregelt. In-vitro- Wiederherstellung solcher Systeme ermöglicht die detaillierte Studien der ihr zugrunde liegenden Mechanismen, die nicht machbar wäre in-vivo. Hier bieten wir ein Protokoll für die in-vitro- Wiederherstellung des MinCDE Systems von Escherichia coli, die die Zellteilung Septum in der Mitte der Zelle positioniert. Der Test soll nur die notwendigen Komponenten zur Selbstorganisation, nämlich eine Membran, die beiden Proteine Verstand und mir und Energie in Form von ATP liefern. Wir fertigen daher eine offene Reaktionskammer auf einem deckgläschen, auf dem eine unterstützte Lipid Bilayer gebildet wird. Die offene Bauweise der Kammer ermöglicht eine optimale Vorbereitung von Lipid Bilayer und kontrollierte Manipulation der Massen Inhalte. Die beiden Proteine, Verstand und mir, sowie ATP, werden dann in der Bulk-Volumen oberhalb der Membran hinzugefügt. Bildgebung ist durch viele optische Microscopies, als die Gestaltung unterstützt Konfokale, Weitfeld- und TIRF-Mikroskopie gleichermaßen möglich. In einer Abwandlung des Protokolls wird die Lipid-Bilayer auf einem gemusterten Träger auf Zelle-förmigen PDMS Mikrostrukturen, anstelle von Glas gebildet. Senkung der Bulk-Lösung bis zum Rand dieser Abteilungen umschließt die Reaktion in einem kleineren Fach und Grenzen, die es ermöglichen, Nachahmung von in Vivo oszillierende Verhalten bietet. Zusammengenommen, beschreiben wir Protokolle, um das MinCDE-System, sowohl mit als auch ohne räumliche Beengtheit rekonstruieren erlauben Forschern genau steuern alle Aspekte Musterbildung, wie Konzentrationsbereiche und Zugabe von anderen Faktoren beeinflusst oder Proteine und Komplexität der Systeme in einer relativ einfachen Versuchsaufbau systematisch zu erhöhen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Räumlich-zeitliche Muster sind unerlässlich in der Natur, Regulierung von komplexen Aufgaben auf der vielzelligen und zellulären Ebene von Morphogenese geregelte Zellteilung1,2. Reaktion-Diffusions-Systeme spielen eine wichtige Rolle bei der Etablierung dieser Muster, aber noch nicht gut verstanden. Ein Paradebeispiel für eine Reaktion-Diffusion-System und dadurch biologische System ist bisher die Escherichia coli MinCDE System3,4,5,6,7. Das MinCDE System schwankt von Zelle Pol Pol der Zelle in E. Coli in der Mitte der Zelle als künftige Gliederung Standort zu bestimmen. Dieses System basiert auf der ATPase Verstand, die ATPase Protein MinE und die Membran als eine räumliche Reaktion Matrix8aktivieren. MinC ist nicht Bestandteil der bildungsmechanismus Muster, aber ist die eigentliche funktionelle Agent: ein Inhibitor der wichtigsten Divisome Protein FtsZ5,6. MinC bindet an Geist und deshalb folgt die Schwingungen führt ein Konzentrationsgradient Zeit gemittelt Protein, das an den Polen der Zelle maximale und minimale in der Mitte der Zelle, ist nur erlaubt FtsZ polymerisieren bei midcell9,10 . Das MinCDE-System ist Teil der größeren Familie von Walker A ATPases, die Schlüssel für die räumlich-zeitliche Organisation in Bakterien2, zum Positionieren und den Transport von Protein-komplexe11 und Plasmide12 und für die Regulierung der Zelle Abteilung13 und Chromosom Abtrennung14. Daher die MinCDE-Reaktion-Diffusion-System nicht nur eine archetypische Reaktion-Diffusion-System darstellt, sondern hat auch Aufmerksamkeit wegen ihrer Relevanz für die räumlich-zeitliche Organisation in Bakterien.

Funktionellen Detailstudien des MinCDE Systems in Vivo sind kompliziert, da Manipulation der Proteine und gen Löschung führen in der Regel in Zellteilung Mängel. Darüber hinaus ändern die Zusammensetzung der Membran oder die Eigenschaften der Zellflüssigkeit in Vivo ist sehr anspruchsvoll15,16. Änderungen am System und beeinflussende Faktoren sind schwer, umso mehr im komplexen Umfeld der Zelle, zu interpretieren, wenn es in eine wichtige Funktion als Zellteilung gestört ist. Wir und andere haben daher wandte sich an eine in-vitro- Rekonstitution Ansatz, reduziert das System auf seine Kernkomponenten: Geist, MinE, ATP als Energiequelle und die unterstützten Lipid Bilayer als eine Reaktion Matrix6,17, 18. dieser Bottom-Up-Ansatz ermöglicht es, um den Mechanismus der Selbstorganisation in Detail, ohne die Komplexität einer lebenden Zelle zu erforschen. Reisen Oberfläche Proteine Form Wellen6 und andere Arten von Mustern17,19 unter diesen Bedingungen, wenn auch mit einer Wellenlänge, die in der Regel etwa eine Größenordnung größer als in Vivoist. Die Verwendung von eine offene Kammer ermöglicht präzise Kontrolle über alle Aspekte, die Einfluss auf Musterbildung: Protein Konzentrationen6, Protein Eigenschaften20Membran Zusammensetzung10, Puffer Zusammensetzung und ATP-Konzentration 6, sowie die Zugabe von anderen Faktoren wie engstand Agenten21 und anderen Divisome Proteinen22. Im Vergleich dazu die in-vitro- Rekonstitution des MinCDE Systems in eine-Durchflusszelle18,19,23 lässt sich den Einfluss der Strömung17,23, Protein Sonde Begrenzung der Bedingungen19, Membran Zusammensetzung19 und 3D Entbindung18 auf Proteinmuster, aber macht eine genaue Kontrolle der Protein/Komponente Konzentration und sequentielle Komponente zusätzlich viel mehr kompliziert.

Mit diesem offenen Saal, wir auch die Unterstützung der planaren Lipid Bilayer mit denen kann man wie geometrische Grenzen Einfluss Muster Bildung21, ein Phänomen, das vor kurzem Sonde gemustert auch untersucht worden in Vivo mit Hilfe von Bakterien in Mikrostrukturen7geformt. Wir beschäftigten auch dieser Assay zu untersuchen, wie definierte Mutationen in meinem Affekt Musterbildung der System-20. Darüber hinaus wurde das gleiche grundlegende Assay-Format eingesetzt, um zu untersuchen, wie Musterbildung durch Licht, Einführung einer Azobenzol-vernetzt-MinE-Peptid in der Assay und imaging mit TIRF-Mikroskopie24gesteuert werden kann.

Wir fanden, dass um das MinDE-Muster zu replizieren Bildung beobachtet, in Vivo in einer in-vitro- System, Haft Schlüssel war. Mit stabförmigen Microcompartments mit Dimensionen angepasst, um die größere Wellenlänge der MinDE in Vitro (10 x 30 µm), bekleidet mit einem unterstützten Lipid Bilayer erlaubt die Rekonstitution der MinDE Pol zu Pol Schwingungen und Proteinbildung gradient 10,25. In diesem Test sind unterstützten Lipid Bilayer auf einem gemusterten PDMS Substrat hinterlegt, die mehrere hundert Repliken von stabförmigen Microcompartments enthält, die oben offen bleiben. Dadurch kann die Reaktion in eine offene Kammer eingerichtet werden, und anschließend der Puffer wird abgesenkt, um den Rand des Microcompartments, damit die Reaktion auf ein kleines Volumen zu beschränken. Obwohl diese Fächer ein Luftpuffer Interface auf der einen Seite haben und damit keine volle 3D Entbindung durch Membran repräsentieren, ahmte die Proteindynamik in Vivo Schwingungen10,25. Im Vergleich zu 3D Beengtheit, zeigt die sehr ähnliche Ergebnisse18, die offene Mikrostrukturen-Assay ist relativ einfach und leicht zu handhaben und kann auch durchgeführt werden, von Laboratorien, die nicht mit speziellen Mikrofluidik Equipment ausgestattet sind und Reinraum-Einrichtungen.

Hier präsentieren wir Ihnen ein experimentelles Protokoll für Neuaufbau MinCDE Musterbildung auf Lipid Bilayer in-vitro unterstützt- über eine offene Kammer, die für die Steuerung aller Komponenten und einfachen Zugang durch optische Mikroskopie und mit Minderjährigen erlaubt Modifikationen, ist auch für die Oberfläche-Sonde Techniken26anpassungsfähig. Neben planaren unterstützten Lipid Bilayer, wir auch zeigen, wie Protein Entbindung mit einfachen gemusterten unterstützten Lipid Bilayer auf stabförmige PDMS Mikrostrukturen erzielt. Diese Tests können zwar für das MinCDE-System optimiert auch zu anderen Protein-Systemen übertragen werden, die in ähnlicher Weise mit der Membran, wie FtsZ27 oder eine minimale Aktin Kortex28interagieren.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(1) Protein-Produktion

  1. Protein-expression
    1. Transformieren von E. Coli BL21 (DE3) pLysS mit dem jeweiligen Plasmid für Ausdruck von MinD6, EGFP-Geist29, mRuby3-MinD24, MinE6 oder MinC30. Plasmid-Karten finden Sie ergänzende Informationen.
    2. Eine Übernachtung Kultur in LB-Medium mit einer einzigen Kolonie mit den entsprechenden Antibiotika (z. B.100 µg/mL Ampicillin oder 50 µg/mL Kanamycin) zu impfen und Inkubation bei 37 ° C für 14-16 Uhr beim Schütteln.
    3. 500 mL TB-Medium mit dem jeweiligen Antibiotikum mit der Übernacht-Kultur (Verdünnung 1: 200) zu impfen und Kultur bei 37 ° C unter Schütteln bei 180 u/min inkubieren.
    4. Induzieren Proteinexpression durch Zugabe von 0,5 mM IPTG erreicht die Kultur einer Extinktion bei 600 nm 0,5 bis 0,7. Im Falle EGFP-Geist oder mRuby3-Geist Verschieben von Zellen in einem Inkubator mit 16 ° C und Zellen für 14-16 Uhr, und im Falle von MinC, Geist oder mir wachsen, wachsen Zellen für ca. 3-4 h bei 37 ° C nach Induktion.
      Hinweis: Induktion von MinC, Geist oder MinE Ausdruck ist giftig für die Zellen als Überexpression Ergebnisse in Zellteilung Mängel; Daher ist es wichtig, dass unter 4 h Inkubationszeit bei 37 ° C gehalten wird. Wenn mehr Eiweiß benötigt wird, erhöhen Sie die Kultur aber nicht Inkubationszeit.
    5. Nach dem jeweiligen Inkubationszeit Zellen durch Zentrifugation bei 4000 X g für 10 min. ernten und Lagern der Zelle Pellet bei-80 ° C bis weiter verwenden.
  2. Proteinreinigung
    Hinweis: Proteine können entweder fertig verpacktes Ni-NTA-Spalten auf einem automatisierten Protein-Reinigung-System oder Ni-NTA-Perlen für Schwerkraft-Flow Bench Reinigung gereinigt werden.
    1. Zur Reinigung mit abgepackte Ni-NTA Spalten auf automatisierte Protein Reinigung Systeme Verwendung Puffer A1 (50 mM Natriumphosphat pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol), Puffer B1 (50 mM Natriumphosphat pH 8,0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol) und Puffer C1 (50 mM Natrium Phosphat pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol). Für Schwerkraft-Flow Bench Reinigung mit Ni-NTA Perlen verwenden Puffer A2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol), Puffer B2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol) und C2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol) zu puffern. Ergänzen Sie alle Puffer mit ß-Mercaptoethanol 10 mM oder 0,4 mM DÄMMUND (tris(2-carboxyethyl)phosphine) als Reduktionsmittel direkt vor dem Gebrauch.
    2. Aufschwemmen Zellen in 20-30 mL des Puffers A1 oder A2 ergänzt mit EDTA-freie Protease-Inhibitor, 100 µg/mL Lysozym, ~ 250 U/mL DNase und 0,2 mM Mg2 +- ADP (Mg2 +- ADP bei Verstand oder EGFP-Geist Reinigung nur, aus einem 100 mM ADP Lager in 100 mM MgCl 2 mit pH-Wert eingestellt auf 7,5).
    3. Lösen Sie Zellen mit einem Tipp sonikator (30 % Amplitude, 2,5 min 30 s-Pulse, 30 s aus) und dabei die Fläschchen mit den Zellen im Eisbad.
    4. Entfernen Sie die Zelle Ablagerungen durch Zentrifugieren der Zelle lysate für 45 min bei 25.000 x g und 4 ° C.
    5. Inkubieren Sie den überstand an Ni-NTA-Spalte oder Ni-NTA Perlen.
      1. Laden Sie für abgepackte Ni-NTA-Spalten die Probe auf die Säule mit der Probe-Pumpe eines automatisierten Protein-Reinigung-Systems.
      2. Inkubieren Sie für Benchtop-Reinigung die Probe mit Ni-NTA-Perlen in ein 50 mL Reaktionsgefäß auf einen rotierenden Shaker bei 4 ° C für 1 h. Übertragen Sie für die folgenden Schritte die Ni-NTA-Perlen in eine leere Spalte mit einen 25-mL-Pipette.
    6. Waschen Sie mit mindestens 5 Spalte Volumen des Puffers A1 oder A2.
    7. Waschen Sie mit mindestens 5 Spalte Volumen des Puffers B1 oder B2.
    8. Eluieren Sie Protein mit Puffer C1 oder C2.
    9. Bewerten Sie Protein Reinheit über SDS-PAGE.
    10. Optional: Weitere reinigen Sie Protein durch Anwendung auf ein Gel Filtration Säule equilibriert im Puffer speichern (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10 % Glycerin, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM DÄMMUND, (0,2 mM Mg2 +- ADP bei Geist)).
      Hinweis: Gel Filtration empfiehlt sich für Geist, aggregierte Proteinfraktion zu entfernen.
    11. Wenn keine Gel-Filtration eingesetzt wird, tauschen Sie Ni-NTA Elution Puffer an Puffer speichern (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10 % Glycerin, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM DÄMMUND, (0,2 mM Mg-ADP bei Geist)) mit einem Gewicht Entsalzung Spalte fließen (siehe Tabelle der Materialien).
    12. Schock-Freeze Proteine in Aliquots in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
    13. Messen Sie Lager Proteinkonzentration mit Bradford-Test zu und bestimmen Sie proteinaktivität mit eine ATPase-Assay-20.
      Hinweis: Bewerten nicht Proteinkonzentration mit Absorption bei 280 nm. Das Vorhandensein von Nukleotid während Geist Reinigung und das Fehlen des Tryptophans in meinem verzerren ein280 Konzentrationsmessungen. Verwendung Bradford oder BCA Tests zur Messung der proteinkonzentrationen statt.
  3. Protein Kennzeichnung
    Hinweis: Die Verschmelzung eines fluoreszierenden Proteins an das kleine Protein MinE induziert wesentliche Änderungen auf seine diffusiven Eigenschaften und Funktion; chemische Bezeichnung des Proteins (Cystein an Position 51) wird daher über Fusion, fluoreszierende Proteine bevorzugt.
    1. Auflösen von 0,125 mg Maleimide-Farbstoff-Konjugat in 5 bis 10 µL DMSO (Dimethyl Sulfoxid) und fügen Sie unter schütteln bis 0,5 mL MinE aliquoten in Speicher-Puffer bei pH 7,2, wie oben beschrieben vorbereitet.
    2. 2 h bei 4 ° C über Nacht oder 2 h bei RT unter sanft schütteln oder rühren inkubieren.
    3. Separate Farbstoff und Protein mit einer Schwerkraft fließen Entsalzung Säule equilibriert mit Puffer speichern (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10 % Glycerin, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM DÄMMUND).
    4. Um eine ungebundene Farbstoff weiter zu entfernen, Dialyse das Protein gegen ein Übermaß an Puffer speichern.
    5. Überprüfen Sie erfolgreiche Kennzeichnung durch das Aussterben auf das Maximum für den jeweiligen Farbstoff Messung und Berechnung der geschätzten Kennzeichnung Effizienz. Entnehmen Sie bitte den Farbstoff des Herstellers für ein detailliertes Protokoll zur Schätzung des Grades der Kennzeichnung. Mit SDS-PAGE analysiert und total Masse durch Massenspektrometrie für weitere nützliche Informationen über die Probe Homogenität und Kennzeichnung Erfolg bestimmen.

2. kleine Unilamellar Vesicle (SUV) Vorbereitung

  1. Generation von multilamellar Vesikel
    1. Berechnen Sie die Höhe der Lipid(s) in Chloroform für Ihre gewünschte Mischung und Endvolumen SUV. Die Konzentration sollte 4 mg/mL von Lipiden in Min Puffer (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl, MgCl25 mM). Für einen standard Min-Assay ist eine Mischung aus 7:3 DOPC:DOPG (Molprozent) empfohlen. Bei der Verwendung von E. Coli polare Lipid-Extrakt, verwenden Sie SLB Puffer (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl) für alle Vorbereitungsschritte.
      Hinweis: Es wird nicht empfohlen für Erstbenutzer, E. Coli -polare Lipid-Extrakt verwenden, da die Generation der homogenen SLBs mit dieser Mischung viel schwieriger ist.
    2. Mit einer Pipette positive Verschiebung mit Glas Tipps, mischen Sie die Lipide in Chloroform in einem 1,5 mL Glasflasche.
      1. Trocknen Sie die Lipide unter einem leichten Stickstoff-Stream und drehen Sie langsam das Fläschchen. Legen Sie die Lipide unter eine stärkere Stickstoff-Stream für 10 bis 20 Minuten. Legen Sie das Fläschchen mit den getrockneten Lipid-Film in einem Vakuum Exsikkator und gelten Sie Vakuum für mindestens 1 h.
    3. Rehydrieren Sie die Lipide in Min Puffer durch Vortexen bei Raumtemperatur, bis die Mischung homogen undurchsichtig ist.
      Hinweis: Für die Erzeugung von kleinen Unilamellar Vesikel aus multilamellar Vesikel, können Lipide entweder extrudiert werden wie unter 2.2 beschrieben. oder beschallten wie unter 2.3 beschrieben. Im allgemeinen ergibt Extrusion eine engere Größenverteilung, die Bildung von unterstützten Lipid Bilayer helfen können.
  2. SUV-Vorbereitung durch extrusion
    1. Brechen Sie Lipid-Aggregate und multilamellar Strukturen zu und weitere solubilisieren Sie Lipide durch Einfrieren Auftauen für 7 bis 10 Zyklen.
      1. Bereiten Sie einen Becher mit Wasser bei 70° C bis 99° C auf einer heißen Platte und einen Behälter mit flüssigem Stickstoff.
      2. Halten Sie das Fläschchen in flüssigem Stickstoff mit großen Pinzette, bis der Stickstoff nicht kochen mehr. Dann übertragen Sie das Fläschchen zu heißem Wasser, bis die Lösung vollständig aufgetaut ist. Wiederholen Sie diese Schritte, bis die Lipid-Mischung für das Auge, je nach Mischung klar erscheint.
    2. Montieren Sie einen Lipid-Extruder und Pre-spülen Sie das System mit Min Puffer. Extrudieren Sie die Lipid-Mischung zwischen 35 und 41-mal durch eine Membran von 50 nm Porengröße. Achten Sie darauf, am Ende auf eine ungerade Anzahl von Pässen Aggregate zu vermeiden, die nie die Membran durchquert.
  3. SUV-Vorbereitung durch Ultraschallbehandlung
    1. Lipide im Puffer besser zu lösen, setzen Sie die glasphiole enthält die Lösung in einem Hitze-Block auf 37 ° C und Wirbel alle 20 Minuten für 1 Minute eingestellt. Inkubieren Sie insgesamt für ca. 1 h.
    2. Tauchen Sie die Unterseite des Fläschchens in einem sonikator Bad (in diesem Werk 1,91 L, 80 W) durch das Fläschchen auf eine Klammer Stand auf der gewünschten Höhe anbringen.
    3. Die Wasserhöhe im sonikator Bad gesetzt, so dass die Lösung rund um das Fläschchen gründlich durch die Impulse aufgeregt ist und beschallen die Lipid-Mischung für ca. 20 Minuten. Suchen Sie nach erfolgreichen Beschallung durch die Beurteilung der Klarheit von Lipiden.
  4. SUVs können bei 4 ° C für bis zu einer Woche gelagert oder eingefroren bei-20 ° C in kleinen Aliquote (~ 20 µL) und mehrere Wochen lang gespeichert. Fläschchen oder Tuben bei Raumtemperatur Auftauen und beschallen wieder wie unter 2.2.3 oder 5.3 beschrieben, bis die Lösung klar ist, bevor die Verwendung von SUVs für Zubereitung von Lipid Bilayer (SLBs) unterstützt. Bitte beachten Sie, die engen Größenverteilung der SUVs durch Extrusion erhalten, die nach dem Einfrieren und das spätere Auftauen und Beschallung verloren ist.

3. Reinigung Glasdeckgläser

Hinweis: Reinigung und Hydrophilie der Glasdeckgläser ist ein wichtiger Faktor für die homogene und flüssig unterstützten Lipid Bilayer. Glasdeckgläser kann mit einer Piranha-Lösung, hergestellt aus einem Verhältnis von 7:2 Schwefelsäure zu 50 % Wasserstoffperoxid (3.1) oder mit einem Sauerstoffplasma in einem Plasma Reiniger (3.2) gereinigt werden. Beide Methoden liefern ähnliche Ergebnisse.

  1. Piranha Reinigung von Deckgläsern
    1. Piranha-Lösung auftragen
      1. Verteilen Sie Glasdeckgläser auf einem umgekehrten Glas Petrischale oder andere inerte Oberfläche. Tropfen Sie mit einer Glaspipette 7 konzentrierte Schwefelsäure (98 %) in die Mitte jedes Deckglas.
        Achtung: Schwefelsäure ist stark sauer und ätzend. Arbeiten Sie in einem Laborabzug und nur richtige Schutzausrüstung.
      2. Geben Sie zwei Tropfen 50 % Wasserstoffperoxid bis zur Mitte der sauren Tropfen.
        Achtung: Wasserstoffperoxid ist ätzend auf Haut und Augen.
      3. Decken Sie die Reaktion und mindestens 45 Minuten inkubieren.
        Hinweis: Die maximale Wartezeit hier ist nicht entscheidend für den Ausgang des Experiments und kann bis zu mehreren Tagen verlängert werden.
    2. Wash-Piranha gereinigt Deckgläsern.
      1. Abholung der Deckgläsern einzeln mit einer Pinzette und Säure mit ultrareinem Wasser abspülen. Legen Sie die gewaschenen Deckgläsern in Antihaft-Inhaber oder ähnliche Transportvorrichtung.
      2. Spülen Sie jede Deckglas ausgiebig mit Reinstwasser und trocknen Sie die Oberfläche mit Druckgas (Stickstoff, Luft nur dann, wenn Öl-frei). Markieren Sie den gereinigten Teil das Deckglas mit permanent-Marker.
  2. Plasmareinigung von Deckgläsern
    1. Spülen Sie Deckgläsern mit überschüssige Ethanol und danach mit überschüssigen Reinstwasser. Trockenen Deckgläsern mit unter Druck stehendem Gas. Montieren Sie die Kammer, wie in 4 beschrieben.
    2. Nach der kammerversammlung in 4 beschriebenen Deckgläsern mit angeschlossenen Kammer und im Plasma Reiniger mit Sauerstoff als Prozessgas. Deckgläsern mit Plasma zu reinigen (in dieser Arbeit 30 % macht 0,3 Mbar Sauerstoffdruck für 1 min verwendet wurde). Die Reinigung zu tun bevor SLB Bildung wie unter 5, als die Hydrophilierungsmittel Wirkung der Plasmareinigung im Laufe der Zeit nachlässt.
      Hinweis: Timing und die Macht der Plasma Reinigung sollte optimiert werden mit Gewebekulturen beschrifteten Membranen, als zu wenig oder übermäßige Plasmareinigung kann sowohl zu unbeweglich Membranen oder Membranen mit Löchern führen.

(4) die Kammerversammlung

  1. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere ab und entsorgen Sie den Deckel und den konischen Teil des eine 0,5 mL Reaktionsgefäß. Tragen Sie UV-Kleber bis zum oberen Rand des Rohres auf und verteilen Sie gleichmäßig, mithilfe einer PIPETTENSPITZE.
  2. Kleben Sie das Rohr auf den Kopf gestellt, die zuvor gereinigten deckgläschen. Achten Sie bei Piranha Reinigung, kleben sie auf die gereinigte Seite des Glases. UV-Klebstoff zu heilen, indem man mehrere Kammern unter einem 360 nm Lampe oder LED für 5 bis 15 Minuten.

5. unterstützt Lipid Bilayer (SLB) Bildung

  1. Heizblock auf 37 ° C vorheizen und 2 mL Reaktionsgefäße mit Min oder SLB Puffer, 1 Tube pro Kammer inkubieren.
  2. Schlag-Stickstoff in die montierten und ausgehärteten Kammern zu entfernen, Staub oder andere Partikel, die während der UV-Härtung und Montage niedergelassen haben können. Plasma Reinigen, wie in 3.2 beschrieben, wenn Sie nicht Ihre Deckgläsern mit Piranha-Lösung (3.1) gereinigt haben. Heizblock Kammern aufsetzen.
  3. Verdünnen Sie ein 20 µL aliquoten klar Lipide (bei 4 mg/mL) mit 130 µL Min Puffer oder SLB Puffer bei E. Coli polare Lipid-Extrakt, wodurch eine arbeiten-Konzentration von 0,53 mg/mL. Für den Fall, dass Lipide eingefroren wurden, Beschallen Sie zuerst durch das Rohr in ein Bad sonikator vor dem Hinzufügen von Puffer halten, dann wieder mit Puffer beschallen.
  4. Jede Kammer 75 µL Lipid-Mischung hinzu und legen Sie einen Timer auf 3 Minuten (DOPC/DOPG Mischungen; längere Inkubationszeit müssen möglicherweise für andere Lipid-Gemische). Bei E. Coli polare Lipid-Extrakt pipette CaCl2 aus einem Bestand von 100 mM in die Kammer, eine Endkonzentration von 3 mM. Während der Inkubationszeit die Bläschen platzen auf der hydrophilen Glasoberfläche und verschmelzen zu einem kohärenten SLB bilden.
  5. Fügen Sie nach 60 Sekunden 150 µL Min Puffer für jede Kammer hinzu.
  6. Waschen Sie die Kammern: Nachdem weitere 120 Sekunden (3 Minuten insgesamt) jede Kammer durch Hinzufügen von 200 µL Min oder SLB Puffer, waschen, sorgfältig pipettieren oben und unten ein paar Mal, entfernen und Hinzufügen von einem anderen 200 µL.
    1. Nachdem jede Kammer einmal gewaschen worden ist, fahren Sie mit die erste Kammer gründlich waschen, bis die 2 mL Puffer aufgebraucht sind. Waschen von SLBs braucht einige Erfahrung, um das Ausmaß der Bewegungen in der Kammer zu perfektionieren und die richtige waschen Intensität zu finden.
      Hinweis: Entfernen Sie niemals alle Flüssigkeit aus der Kammer zu vermeiden, Trocknen von der SLB.
      Hinweis: Zusätzlich zu waschen, Membran Eigenschaften variieren abhängig von vielen zusätzlichen Faktoren: Art der Lipide und ihrer relativen Konzentrationen in Lipid-Mischungen, Zubereitungsart für SUVs, Oberflächenbehandlung und vorherige Reinigung der Unterstützung.

(6) Selbstorganisation Assay

  1. Lautstärke der Puffer in der Kammer in 200 µL Min Puffer abzüglich des Betrags der Proteine und ATP-Lösung, dann von mir hinzufügen, Geist, Verstand, beschriftet, und auf Wunsch MinC. Mischen Sie vorsichtig Komponenten durch pipettieren. Beispiel-Konzentrationen sind 1 µM Geist (dotiert mit 30 % EGFP-Geist), 1 µM MinE (dotiert mit 10 % chemisch mit der Bezeichnung MinE) und 0,05 µM MinC, sondern Muster bilden über einen Bereich von Konzentrationen6,10,20,30 .
  2. Fügen Sie 2,5 mM ATP (ab 100 mM ATP Lager in 100 mM MgCl2, pH 7,5) um die Selbstorganisation der MinDE zu starten.
    Hinweis: Die Reihenfolge der Komponenten-Zugabe (Geist, MinE und ATP) variiert werden kann und wird keinen Einfluss auf die endgültige Muster Ergebnis4.
  3. MinDE Selbstorganisation auf dem Fluoreszenzmikroskop zu beobachten (siehe Tabelle der Materialien). MinDE Selbstorganisation kann auch beobachtet werden, mit TIRF-Mikroskopie. Verwenden Sie für imaging-eGFP-Geist, 488 nm Argonlaser oder vergleichbaren Dioden-Laser (z. B. 490 nm). Für bildgebende mRuby3-Geist empfiehlt es sich, ein 561 nm Diodenlaser beschäftigen.
    Hinweis: Vermeiden Sie hohe Stufen der Erregung für längere Zeit als wir und andere haben17 Phototoxizität im MinDE-System führt zu irreversiblen Protein Polymerisation auf die Membran beobachtet.

(7) PDMS Mikrostrukturen

Hinweis: PDMS (Polydimethylsiloxan) ist ein Polymer, das zur Herstellung von Mikrostrukturen und mikrofluidischen Geräten verwendet werden kann. Ein gemusterte Siliziumwafer dient als Form für das Gießen der PDMS-Strukturen. Die PDMS Strukturen dann dienen als Unterstützung für SLB Bildung und assay Setup.

  1. Entweder selbst mit Photolithographie Silizium-Wafer mit Microcompartments produzieren (siehe Zieske und Schwille für ein detailliertes Protokoll31 oder Gruenberger Et Al. für einen video-Protokoll32) oder bestellen Sie Ihre gewünschten Silizium-Wafer aus einer Gießerei . Das Muster des Wafers hierin verwendeten finden Sie ergänzende Informationen.
  2. Herstellung von PDMS Mikrostrukturen aus gemusterten Silizium-Wafer.
    1. Verwenden Sie einen Plastikbecher, um 10 g der PDMS-Basis und 1 g PDMS Vernetzer zu wiegen. Entweder verwenden Sie eine Mischvorrichtung zu mischen und Entgasen die PDMS-Mischung oder manuell die PDMS mischen und dann unter Vakuum entgast.
    2. Verwenden Sie eine PIPETTENSPITZE um eine kleine Menge von PDMS direkt auf die Struktur auf dem Siliziumwafer zu fallen.
      Hinweis: Achten Sie darauf, die Silizium-Wafer zu kratzen.
    3. Sofort platzieren Sie ein #1-Deckglas auf der PDMS-Drop und nehmen Sie das obere Ende eine saubere PIPETTENSPITZE sanft drücken, das Deckglas auf der Silizium-Wafer. Die PDMS sollte dünn zwischen dem Deckglas und der Silizium-Wafer zu verbreiten.
    4. Legen Sie den Wafer mit den Deckgläsern in einen Ofen und heilen die PDMS für 3-4 Stunden oder über Nacht bei 75 ° C. Die Wafer aus dem Ofen nehmen und auf Zimmertemperatur abkühlen lassen. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig das Deckglas mit angehängten PDMS aus SI-Wafer.
      Hinweis: Um die Silizium-Wafer verhindern, verschmutzt oder beschädigt, immer decken Sie die Mikrostrukturen mit PDMS und einem deckgläschen. Jedoch verwenden PDMS Alter, was zu Rissen in den Mikrostrukturen, daher nicht PDMS Strukturen, die älter als zwei bis drei Wochen.

8. die Selbstorganisation in PDMS Mikrostrukturen

  1. Verwendung Deckgläsern mit PDMS Mikrostrukturen anfügen eine Kammer wie beschrieben unter 4.
  2. Reinigen und hydrophilize Oberfläche in einem Sauerstoffplasma Reiniger wie unter 3.2.2 beschrieben. Tun Sie nicht Piranha sauber PDMS-Substrate.
  3. Richten Sie einen MinDE-Selbstorganisation-Assay, wie unter 6 beschrieben.
  4. Überprüfen Sie nach dem Einrichten der Assay, regelmäßige MinDE Musterbildung und richtig geformte Mikrostrukturen auf dem Fluoreszenzmikroskop.
  5. Wenn regelmäßige MinDE-Muster (10-30 min) gebildet, pipette vorsichtig oben und unten zweimal, um Komponenten zu mischen und entfernen dann den Puffer Schritt für Schritt durch pipettieren. Entfernen Sie die große Masse der Puffer mit einer 100 µL Pipette zu und dann entfernen Sie vorsichtig den Rest mit einer 10 µL Pipette.
    Hinweis: Dieser Schritt eventuell etwas Übung. Wenn zu viel Puffer herausgenommen oder der Vorgang zu lange dauert, werden die Mikrostrukturen getrocknet werden; Wenn zu wenig genommen wird, die Proteine werden nicht in die Mikrostrukturen beschränkt sein, sondern weiterhin bilden Reisen Oberflächenwellen.
  6. Schließen Sie sofort die Kammer mit einem Deckel zu vermeiden, Trocknen von den verbleibenden Puffer in die Mikrostrukturen.
  7. Um längere bildgebenden Zeiten ermöglichen, schließen Sie ein feuchtes Stück Schwamm im Inneren der Kammer und schließen Sie dann mit Deckel. Sicherstellen Sie, dass der Schwamm die Oberfläche das Deckglas nicht berührt.
  8. Vor Bildgebung der Mikrostrukturen Prüfung auf der Oberfläche, dass der Puffer genug, gesenkt wurde, so dass die Oberfläche über die Mikrostrukturen MinDE Musterbildung gestoppt hat. Bild MinDE Schwingungen in Mikrostrukturen. Kontrollieren Sie die Mikrostrukturen sind nicht ausgetrocknet oder sind während der Bildgebung austrocknen.
    Hinweis: Verwerfen Sie Deckgläsern mit Microcompartments nach jedem Gebrauch, als Risse in der PDMS-Form.

9. Analyse der Musterbildung MinDE

  1. Wellenlänge, Wellengeschwindigkeit und Welle Profile der MinDE Selbstorganisation auf planaren unterstützten Lipid Bilayer zu quantifizieren. Fidschi mit dem Standardsatz von verpackten Plugins ist ausreichend für einfache Analyse33.
  2. Pol zu Pol Schwingungen im Microcompartments durch den Erwerb von Kymographs und Zeit gemittelt Protein Konzentration Profile zu analysieren. Grundlegende Kymographs erhalten Sie wieder Schneiden einer Zeitreihe entlang einer linienauswahl in Fidschi.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinreinigung nach unserem Protokoll sollte min. Proteine ausreichende Reinheit Ausbeute. Als Referenz bietet Abbildung 1 ein SDS-PAGE-Bild des Geistes, eindringmittel Geist, MinE und MinC gekennzeichnet. Die einzelnen Schritte des Verfahrens durchführen einen MinDE-Selbstorganisation-Assay auf nicht gemustert unterstützten Lipid Bilayer sind in Abbildung 2beschrieben. Unter Verwendung dieses Protokolls, kann regelmäßige MinDE Reisen Oberflächenwellen in der Kammer (Abbildung 3) beobachtet werden. Die Wellenlänge kann innerhalb der Kammer leicht variieren, aber im allgemeinen Muster ähnlich aussehen. Die Kanten der Kammer sollte nicht für quantitative Vergleiche verwendet werden, wie Membranen, dass Formular auf den UV-Kleber scheinen andere Eigenschaften als auf dem Glas haben Oberfläche (siehe Abbildung 3). Reisen Oberflächenwellen können analysiert werden, durch die Intensität entlang der Ausbreitungsrichtung (Bild 3 b) auftragen. Während Geist Fluoreszenz Hochebenen ziemlich schnell von der Vorderkante der Welle und sinkt dann scharf an der Hinterkante, MinE Fluoreszenz steigt nahezu linear von der Beginn der MinD-Welle und erreicht sein Maximum nach Geist an der Hinterkante, wo es fällt deutlich6.

Neben Protein-Qualität ist die Qualität der unterstützten Lipid Bilayer kritischsten für eine regelmäßige Selbstorganisation von MinCDE. Einerseits wenn die Membran auch übermäßig gewaschen ist oder die darunter liegende Fläche gereinigt und somit zu stark aufgeladen wurde, können Löcher in der Membran bilden (Abb. 6A, oben). Auf der anderen Seite die Membran wird nicht richtig gewaschen oder die darunter liegende Fläche nicht gereinigt/hydrophilierten, Vesikel werden halten Sie sich an die Membran oder die membranfluidität beeinträchtigt wird (Abbildung 6A, unten). Obwohl nicht so offensichtlich wie bei der Beobachtung der Membran direkt über beschriftete Lipide, diese Probleme auch aus dem Geist-Fluoreszenz-Signal erkannt werden können als Muster nicht regelmäßig sind und die Fluoreszenz in der Maxima ist nicht homogen, sondern enthält "Löcher" oder helle Flecken wie in der mittleren Spalte der Abbildung 6Adargestellt.

Das Verfahren ist für die Selbstorganisation von MinDE in stabförmigen PDMS Mikrostrukturen in Abbildung 4zusammengefasst. Mehreren Protokoll Schritte müssen nicht wiederholt werden, da Proteine und Lipide wiederverwendet werden können. Wie auf Substraten nicht gemustert, das Substrat wird gereinigt und hydrophilierten (durch Plasmareinigung), eine unterstützte Lipid Bilayer sich auf dem PDMS bildet und Selbstorganisation Assay in einem Volumen von 200 µL eingerichtet ist. Um zu überprüfen, dass eine ordnungsgemäße Membran gebildet hat und MinDE selbst, auf der Membran organisiert, sind die Kammern abgebildet. Wenn eine geeignete Membran gebildet worden, MinDE Formen regelmäßig Reisen Oberflächenwellen auf der Oberfläche der PDMS zwischen den einzelnen Mikrostrukturen und auch am unteren Rand der Mikrostrukturen selbst organisiert, wie die Wellen frei können zu bewegen, über die gesamte Membran-bedeckten Oberfläche (Abb. 5A). Nach dem Puffer entfernen sollte die Fläche zwischen den Abteilen keine verbreitende MinDE-Muster (Abbildung 5 b), zeigen, wie es ganz trocken sein sollte. Wenn MinDE Muster noch in Bewegung sind, muss mehr Puffer entfernt werden. Die Proteine sind jetzt in den stabförmigen Microcompartments beschränkt, durch die Membran gekleidete PDMS und auf dem Luftweg auf die obere Schnittstelle (Abbildung 5), in der sie selbst organisieren. Unter diesen Bedingungen können die beiden Proteine Pol zu Pol Schwingungen ausführen, wie in Abbildung 5dargestellt. Wie ein Bruchteil des Geistes und mir immer Membrane-springen, sind auch beim Puffer entfernen, die Konzentrationen nach der Entfernung der Puffer nicht vergleichbare Konzentrationen eingeben. Wegen dieses Effekts variieren die Konzentrationen auch zwischen einzelnen Mikrostrukturen auf der gleichen Deckglas, da sie abhängig von der Position der Muster vor dem Puffer entfernen. Silizium-Wafer-Produktion oder PDMS Formgebung aus der Silizium-Wafer kann unvollständig Mikrostrukturen führen, die für die Analyse (Abb. 6 b) verwendet werden kann. Darüber hinaus aufgrund der Puffer Entfernung Mikrostrukturen könnte während des Prozesses austrocknen und sollte daher von der weiteren Analyse (Abb. 6 b) ausgeschlossen werden. Als Ergebnis zeigt nur einen Bruchteil von Mikrostrukturen in einer Kammer die gewünschten Schwingungen von Pol zu Pol. Um Proteindynamik in die Mikrostrukturen zu analysieren, erhalten Sie eine Glomeruli durch Zeichnen eine Auswahl über die gesamte Struktur (Abb. 5E). Beim MinCDE oszillieren von Pol zu Pol, erscheinen MinC und Geist ein Konzentrationsgradient Zeit gemittelt mit maximaler Konzentration an den Fach-Polen und minimale Konzentration in der Mitte des Fachs (Abbildung 5F).

figure-results-1
Abbildung 1: SDS-PAGE zeigt die finalen Produkte von Protein Reinigungen. Seinen Verstand (33,3 kDa), His-eGFP-MinD (60,1 kDa), seine-mRuby3-Geist (59,9 kDa), His-MinE (13,9 kDa) und seine MinC (28,3 kDa) werden in der Reihenfolge angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-2
Abbildung 2: Prozess-Flow-Diagramm zeigt die einzelnen Schritte und das Timing des Protokolls für eine Selbstorganisation auf nicht-gemusterten unterstützten Lipid Bilayer (Schritte 1 bis 6). Gestrichelte Kästchen zeigen an, dass eine der folgenden zwei Optionen zur Reinigung verwendet werden kann. Mit Kreisen markierten Pfeile zeigen wo das Protokoll angehalten und später fortgesetzt werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-3
Abbildung 3: Imaging von MinDE-Assay konfokalen Mikroskopie. A) regelmäßige Min Spirale, von Geschwindigkeit, die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Welle und Intensität Grundstück Messungen erhalten werden können. Konzentrationen verwendet: 0,6 µM MinD (30 % eGFP-Geist), 1,8 µM sein-MinE (30 % seiner-MinE-Alexa647) B) Beispiel normalisierte Intensität Plot für die Region gekennzeichnet in A. C) Überblick über die gesamte Assay Kammer (Maßstabsleiste: 1 mm, gleiche proteinkonzentrationen als siehe oben). Spiralen drehen beide Richtungen sowie Ziel Muster beobachtet werden können. Die vergrößerte Region zeigt Unterschiede zwischen Wellenmuster auf der UV-Kleber. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-4
Abbildung 4: Prozessfluss-Diagramm zeigt die einzelnen Schritte und das Timing des Protokolls zur Selbstorganisation in stabförmigen Mikrostrukturen (Schritte 1 bis 5, 7, 8). Graue Kästchen zeigen Schritte aus dem Protokoll auf nicht-gemusterten unterstützten Lipid Bilayer wo Produkte wiederverwendet werden können. Mit Kreisen markierten Pfeile zeigen wo das Protokoll angehalten und später fortgesetzt werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-5
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse für MinDE Muster Bildung in stabförmigen PDMS Microcompartments. (A) MinDE selbst zu organisieren, auf der Oberfläche der PDMS bilden Reisen Oberflächenwellen (MinD 1 µM (30 % EGFP-Geist), 2 µM MinE und 2,5 mM ATP). B) nach der Puffer auf die Höhe der Mikrostrukturen gesenkt wird, stoppt die Selbstorganisation von Protein auf der Ebenen Oberfläche zwischen den Microcompartments. C) Stromlaufplan von einem stabförmigen Microcompartment. D) repräsentative Bilder von MinDE Pol zu Pol Schwingungen nach dem Puffer entfernen. E) Glomeruli der Schwingungen entlang der markierten Linie gezeigt in D). F) Image und Profil der durchschnittliche Fluoreszenzintensität der Zeitreihen dargestellt in D) klar hervorgeht, das Protein Gefälle, das maximale an Microcompartment Polen und Fach Mitte minimal ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-6
Abbildung 6: Beispiele für negative experimentelle Ergebnisse. A) übermäßig gewaschene Membranen akkumulieren Löcher, während suboptimale Vesikel Vorbereitungen und Lipid-Kompositionen zu kleben Bläschen führen. Die beiden mittleren Platten zeigen eine Kombination von Problemen und wie werden sie sichtbar, wenn Min Schwingungen zu beobachten. Membranen wurden beschriftet mit 0,05 % Atto655-SCHMIERE. (Skalieren Bars: 50 µm) B) Oberseite: ausgetrocknet Microcompartments kann verursacht werden durch zu viel Puffer entfernen, oder wenn der Puffer im Laufe der Zeit verdunstet. Bodenplatte: unvollständige Fächer während der Produktion von Wafern oder PDMS Formteil gebildet werden können. (Skalieren Bars: 30 µm) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Datei 1: Plasmid-Karte für seinen Verstand. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 2: Plasmid-Karte für seinen EGFP Verstand. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 3: Plasmid-Karte für sein mRuby3 Geist. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 4: Plasmid-Karte für seine MinE. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 5: Plasmid-Karte für seine MinC. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 6: CAD-Datei für Silizium-Wafer von stabförmigen Microcompartments. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben ein Protokoll beschrieben für die in-vitro- Rekonstruktion des MinCDE Selbstorganisation auf planaren Lipid Bilayer unterstützt und im Lipid Bilayer bedeckt 3D-Strukturen, am Beispiel von stabförmigen PDMS Mikrostrukturen. Um wertvolle Daten aus diesen Proben zu erhalten, sind die wichtigsten Faktoren zur Steuerung Protein und Membran Qualität.

Eiweiß Protein Qualität Masse sollte mittels SDS-PAGE und Massenspektrometrie bestätigt werden. Darüber hinaus sollte überprüft werden, dass Proteine löslich und nicht aggregierten mithilfe von analytischen Gel Filtration oder dynamische Lichtstreuung. Gel-Filtration kann verwendet werden, um aggregierten Bruchteil der Proteine zu entfernen. Sorgfältige pH-Einstellung und die Qualität der zusätzlichen Nukleotiden ist wichtig, wie der Zusatz nicht angepasste oder teilweise abgebauten Nukleotids an Protein Aktien oder selbstorganisierenden Assays ausreichend proteinaktivität, also die Abschaffung zu beseitigen Selbstorganisati on.

Neben Proteinqualität Membran-Qualität ist sehr kritisch und unsachgemäße Membran Formation ist in den meisten Fällen die Ursache für mangelhafte Selbstorganisation und die Herkunft der artifizielle Oberflächenstrukturen.

Wenn Sie das Protokoll zum ersten Mal durchführen, ist es hilfreich, die unterstützten Lipid Bilayer Etikett nach einschließlich beschrifteten Lipide wie Atto-655-SCHMIERE oder DiI an niedrigen molaren Prozentsätze (0,05 %). Dadurch können die Eigenschaften und die Qualität der Membran direkt beurteilt werden. Verwendung von FRAP, kann die Fluidität der Membran beurteilt werden. Darüber hinaus kann man direkt die Qualität des Waschens der SLB, beurteilen, wie entweder es zu viele Bläschen, keine flüssige Membran oder keine Membran sein, wird wenn sie abgewaschen. Die offene Kammer-Ansatz ermöglicht die Membran, gründlich waschen und damit auch zu Bläschen zu entfernen, die auf der Oberfläche der SLB kleben. Wichtigsten Faktoren für den Erhalt der Flüssigkeit und homogene unterstützten Lipid Bilayer sind die Reinigung und Hydrophilie der Auflagefläche und die richtige Größe und Homogenität der SUVs. kann es helfen SUV Größe und Größe Distribution verwenden überprüfen dynamische Lichtstreuung. Engen Größenverteilung empfehlen wir Extrudieren die Vesikel, anstatt ihnen beschallen. Andere Methoden der Reinigung Deckgläsern, z. B. Behandlungen mit starken Basen, grundlegenden Reinigungsmittel oder mit Deckgläsern direkt nach dem Abspülen mit Wasser, können gute Ergebnisse, je nach Anwendung und Lipid Mischung erzielt werden.

Im erste Halbjahr das Protokoll hier vorgestellten, in-vitro- Wiederherstellung auf planaren unterstützten Lipid Bilayer in offenen Kammern hat den Vorteil der Erbringung der Oberfläche zugänglich für optische Microscopies, z. B. TIRF-Mikroskopie30, FRAP Analyse6,34, sowie Oberflächen-Temperaturfühler Techniken wie atomic Force Microscopy26Single-Teilchen. Die große homogene Fläche ermöglicht bessere Statistiken bei definierten Konzentrationen. Außerdem ermöglicht die offene Kammer Ansatz, um Proteinkonzentration und eine schnelle und einfache Zugabe von weiteren Komponenten, daher erlauben um zu titrieren Proteinkonzentration in einem Einkammer-20genau zu kontrollieren. Der Test kann auch durch Zugabe von anderen bakteriellen Divisome Komponenten wie FtsZ22,35, ZipA22 oder chimäres Protein FtsZ-YFP-MTS10,35erweitert werden.

Andere Gruppen haben einen ähnlichen Ansatz Neuaufbau der Min-System in Vitro, aber Verwendung einer Durchflusszelle statt eine offene Kammer17,18,19. Durchflusszellen haben gewisse Vorteile, insbesondere, wenn eine komplett geschlossene 3D-Umgebung benötigten18, den Einfluss der Strömung17,19,23 oder Membran Zusammensetzung23 auf MinCDE Muster ist untersucht, ob Proteinmuster sollen unter Bedingungen19Begrenzung Protein beobachtet werden. Lokale Steuerung der molekularen Konzentration ist jedoch schwieriger. Eiweißbausteinen, besonders Geist, stark an die Membran binden sie erste Begegnung18,19. Nach unserer Erfahrung zeigen die Proteine häufig unspezifische Bindung an Schläuche, Buchten, Spritzen und anderen mikrofluidischen teilen. Daher lokale proteinkonzentrationen von Eingabe Konzentrationen18 unterscheiden und auch über die Länge der Messzelle, was zu einer Vielzahl von verschiedenen Proteinmuster auf der Membran zwischen Einlass und Auslass, wie von anderen19beobachtet variieren.

Die zweite Hälfte des Protokolls hier präsentiert, die in-vitro- Rekonstitution in stabförmigen Mikrostrukturen erneut mit dem offenen Kammer Ansatz auf einem gemusterten Träger fallenden Lipid Bilayer ermöglicht eine einfache Imitation von in Vivo Protein Verhalten Obwohl ist präzise Steuerung über proteinkonzentrationen durch Puffer Entfernung verloren. Beachten Sie, dass weil die Wellenlänge der MinDE ist etwa eine Größenordnung größer in Vitro als in Vivo die stabförmigen Microcompartments sind auch über eine Größenordnung größer (10 x 30 µm) als eine stabförmige E. Coli Zelle.

Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll für die präzise Steuerung aller Bedingungen einschließlich der Proteinkonzentration, Puffer Zusammensetzung und Eigenschaften der Membran. Der Einsatz von 3D strukturierte unterstützt ermöglicht die Reaktion unter räumliche Beengtheit, imitiert in Vivo Verhalten ohne die Notwendigkeit für komplexe Mikrofluidik Geräte untersucht werden.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir bedanken uns bei Michael Heymann und Frank Siedler für die Herstellung von Silizium-Wafer, Core Facility MPI-B um Hilfe bei der Proteinreinigung und Simon Kretschmer und Leon Harrington für Kommentare auf das Manuskript.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
DOPCAvanti Polar Lipids850375
DOPGAvanti Polar Lipids840475
E.coli Polar Lipid ExtraktAvanti Polar Lipids100600
Adenosin 5′-triphosphat DinatriumsalztrihydratRoche
Adenosin 5′-diphosphat monokaliumsalzdihydratSigmaA5285-1G
NatriumchloridVWR27810.295
KaliumchloridRoth6781.1
Tris-baseSigma AldrichT1503-1kg
SalzsäureRoth9277.1
TCEP-HClTermo Fisher Scientific20491
EthylendiamintetraacetatMerck Millipore1.08418.1000
Schwefelsäure 98%Applichem173163.1611
Wasserstoffperoxid 50%Applichem147064.1211
HEPESBiomol05288.1
Dimethylsulfoxid (DMSO)Merck102950Uvasol
Glycerin 86%Roth4043.1
TB Medium
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)Roth2316.x
Atto-655-DOPEAtto TecAD 655-161
Ni-NTA AgaroseQiagen30210
PDMS BaseDow Corning CorporationSYLGARD 184
PDMS-VernetzerDow Corning Corporation
Materials
UV GlueNorland Products6801#68 und #63 funktionieren beide gut
Deckgläser #1,5 24x24 mmMenzel Glä ser
Deckgläser #1 24x24 mmMenzel Glä serwird nur für PDMS-Mikrostrukturen
verwendet 0,5 ml ReaktionsgefäßEppendorf 
Kulturkolben 2LCorningz.B. 734-1905
His-Trap HPGE Healthcare Life Sciences
Gelfiltrationssäule: HiLoad Superdex 75 PG oder 200 PGGE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG Entsalzungssäule vorgepackte SäuleBiorad7322010
Dialysegerät: Slide-A-Lyzer Dialysekassetten, 3,5 K MWCO, 0,1 - 0,5 mL oder 0,5-3 mLTermo Fisher Scientific66333 oder 66330
Rasierklinge
Instruments
Reinstwasser: Milli-Q Typ 1 ReinstwassersystemeMerck
automatisiertes Proteinreinigungssystem: Ä kta PureGE Healthcare Life Sciences
BadsonicatorBransonz.B. Modell 1510
ARE-250 MischerThinky Corporation
Plasmareiniger ZeptoDiener electronicverwenden Sauerstoff als Prozessgas
VerdrängerpipettenMarkeTransferpettor Modelle mit Glasspitzen
LSM780 konfokales Laser-Scanning-MikroskopZeissAusgestattet mit Zeiss C-Apochromat 40X/1,20 Wasser-Immersionsobjektiv
Plasmiden
pET28a-His-MinD_MinEDepartment für Zelluläre und Molekulare Biophysik, MPI für Biochemie, Prof. SchwillePlasmid-kodierendes His-MinD und nicht markiertes MinE zur Verbesserung der Ausbeute
pET28a-His-MinEAbteilung für Zelluläre und Molekulare Biophysik, MPI für Biochemie, Prof. SchwillePlasmid kodiert für His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinDAbteilung für Zelluläre und Molekulare Biophysik, MPI für Biochemie, Prof. SchwillePlasmid kodiert für His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinDAbteilung für Zelluläre und molekulare Biophysik, MPI für Biochemie, Prof. SchwillePlasmidkodierung His-mRuby3-MinD
pET28a-His-MinCAbteilung für Zelluläre und Molekulare Biophysik, MPI für Biochemie, Prof. SchwillePlasmid-kodierung His-MinC
0030123301

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control. Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).
  2. Lutkenhaus, J. The ParA/MinD family puts things in their place. Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).
  3. Shih, Y. -L., Zheng, M. Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli. Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).
  4. Halatek, J., Frey, E. Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics. Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).
  5. Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli. J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320 (5877), 789-792 (2008).
  7. Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures. Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).
  8. Hu, Z., Lutkenhaus, J. Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid. Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).
  9. Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).
  10. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems. Elife. 3, e03949(2014).
  11. Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).
  12. Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria. Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).
  13. Thanbichler, M., Shapiro, L. MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  14. Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation. Elife. 3, e02758(2014).
  15. Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo. J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).
  16. Renner, L. D., Weibel, D. B. Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).
  17. Ivanov, V., Mizuuchi, K. Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).
  18. Caspi, Y., Dekker, C. Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers. Elife. 5, e19271(2016).
  19. Vecchiarelli, A. G., et al. Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).
  20. Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence. PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).
  21. Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. Geometry sensing by self-organized protein patterns. Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).
  22. Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves. Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).
  23. Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro. Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).
  24. Glock, P., et al. Optical control of a biological reaction-diffusion system. Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).
  25. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments. Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).
  26. Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator. Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).
  27. Ramirez, D., et al. Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture. PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).
  28. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. Elife. 2, e00116(2013).
  29. Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. Surface topology assisted alignment of Min protein waves. FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).
  30. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).
  31. Zieske, K., Schwille, P. Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments. Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).
  32. Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560(2013).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. Protein self-organization: Lessons from the min system. Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).
  35. Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Unterst tzte LipiddoppelschichtProtein MusterbildungMinCDE SystemKonfokalmikroskopieTIRF MikroskopiePDMS MikrostrukturenLipidextrusionReinigung mit Piranha L sungFluoreszenzmikroskopie

Verwandte Artikel