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Methodenartikel

Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms

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DOI:

10.3791/58140

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3. Oktober 2018

 ,  ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2LGI Flow Cytometry Core Facility, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Verwendung von hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Das maligne Potential der gentechnisch veränderten blutbildenden Zellen zu beurteilen. HSCT ist nützlich für die Bewertung der verschiedenen malignen hämatopoetischen Zellen in Vivo sowie die Generierung einer großen Kohorte von Mäusen mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder Leukämie um neue Therapien zu bewerten.

Zusammenfassung

Myelodysplastischen Syndromen (MDS) sind eine heterogene Gruppe von Hämatopoetischen Stammzellen-Störungen, die durch ineffektive Hämatopoese, peripherem Blut Leukopenie, Dysplasie und eine Neigung für die Transformation zu akuter Leukämie definiert sind. NUP98-HOXD13 (NHD13) Transgene Mäuse rekapitulieren menschlichen MDS in Bezug auf die peripheren Blut Leukopenie, Dysplasie und Transformation zu akuter Leukämie. Wir zeigten bisher, dass MDS von gentechnisch hergestellten Maus mit MDS an Wildtyp Empfänger übertragen werden könnte, durch die Transplantation von MDS Knochenmark kernhaltigen Zellen (BMNC). Mehr die MDS-Zelle Herkunft klar zu verstehen, haben wir Konzepte für spezifische verpflanzen, immunophenotypisch definiert hämatopoetische Teilmengen. In diesem Artikel beschreiben wir den Prozess der Isolierung und Transplantation bestimmte Populationen von Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen. Nach Transplantation beschreiben wir Ansätze zur Beurteilung der Effizienz der Transplantation und Persistenz der MDS Spenderzellen.

Einleitung

Myelodysplastischen Syndromen (MDS) repräsentieren eine vielfältige Reihe von klonalen Blutkrankheiten, gekennzeichnet durch ineffektive Hämatopoese, morphologische Nachweis der Dysplasie und einer Neigung für die Transformation auf akute myeloische Leukämie (AML)1,2 ,3,4. Ineffektive Hämatopoese ist anerkannt als eine Verhaftung Reifung im Knochenmark und Ergebnisse im peripheren Blut zytopenien trotz hyperzelluläres Knochenmark1,3. Die Inzidenz von MDS wurde verschiedentlich als 2-12 Fälle pro 100.000 Personen pro Jahr in den Vereinigten Staaten geschätzt, und die Inzidenz von MDS steigt mit dem Alter, so dass dies eine wichtige Voraussetzung, angesichts der alternden Bevölkerung US3zu verstehen, 5. Obwohl die meisten Fälle von MDS keine klare Ursache haben, sind einige Fälle von MDS vermutlich aufgrund der Exposition gegenüber bekannten genotoxischen Agenzien, einschließlich Lösungsmittel wie Benzol und Krebs-Chemotherapie-6.

MDS-Patienten haben in der Regel Mutationen in der MDS Zellen7erworben. Obwohl relativ selten, haben eine Reihe von MDS-Patienten ausgewogenere chromosomale Translokationen Gene z. B. EVI1, NUP98, RUNX1 und MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) erworben. Unser Labor hat ein langjähriges Interesse an Chromosom Translokationen, die NUP98 gen8beinhalten. Transgene Mäuse, express, ein NUP98-HOXD13 (NHD13)-Transgen geregelt durch den Projektträger Vav1 und Enhancer-Elemente zeigt alle Schlüsselfunktionen der MDS, einschließlich der peripheren Blut Leukopenie, morphologische Nachweis der Dysplasie und Transformation zu AML9 .

Obwohl MDS für mehr als 60 Jahren10anerkannt wurden und gelten als eine klonale Stammzell-Störung, wurden Bemühungen zur menschlichen MDS-Zelle in immungeschwächte Mäuse weiterhin weitgehend erfolglos, weil die MDS-Zellen schlecht11weiterhin, 12,13,14 und die Mäuse entwickeln keine klinischen Erkrankung. In einer Bemühung zu identifizieren, welche hämatopoetischen Zellen MDS übertragen können, wir wandte sich an das NHD13-Modell, und zeigte, dass wir MDS als Krankheit Einheit, die alle Merkmale der Kardinal menschlichen MDS weiterhin könnte, einschließlich der peripheren Blut zytopenien zeigten Dysplasie, und Transformation, AML15. In diesem Bericht stellen wir die technischen Details dieser Experimente sowie Ansätze für weitere fraktionieren Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen (HSPC), in einer Bemühung, MDS-initiierenden Zellen zu identifizieren.

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Protokoll

Die Tieren in diesem Artikel beschriebenen Verfahren wurde vom National Cancer Institute in Bethesda Animal Care und Use Committee genehmigt, und entsprechen den Richtlinien enthaltenen The Public Health Service Policy auf Humane Pflege und Verwendung von Labortieren, die Tierschutzgesetz und die Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Zelle-Vorbereitung

  1. Ernte des Knochenmarks kernhaltigen Zelle (BMNC)
    1. Verwenden Sie nur sterile Materialien. Sterilisieren Sie wiederverwendbare Instrumente mit einem Dampf-Autoklaven. Nadeln, Spritzen und Kunststoff-Ware in Einzelnutzung sterile Behälter zu kaufen. Führen Sie alle Tier- und Zelle Manipulationen in einer Klasse II, Typ A2 biologischen Sicherheitsschrank.
    2. BMNCs in 14 mL Runde Unterrohr mit 3 mL HF2 vorbereiten (Hank es ausgeglichen Salzlösung mit 2 % fötalen Rinderserum ergänzt).
    3. Einschläfern Sie C57Bl6 Spender Mäuse (positiv für CD45 Allel CD45.2), Alter in der Regel 2-6 Monate, mit einer CO2 Kammer.
    4. Sterilisieren Sie die Maus-Karkasse durch Besprühen 70 % igem Ethanol über den gesamten Körper mit einer Sprühflasche. Schälen Sie die Haut von den Beinen, vom Becken bis zum Knöchel.
    5. Entfernen Sie die Oberschenkelknochen und Tibiae vom Schlachtkörper mit sterilen Schere (gerade, scharf/scharf, 11,5 cm) und Zange (Graefe, gezahnt, Tipp 0,8 mm Breite). Schneiden Sie angehängte Muskeln deutlich.
    6. Die proximalen und distalen Enden des Schienbeins mit der Schere ausschneiden. Sie Tibia mit Zange halten, legen Sie eine 27-Gauge 3 mL Spritze mit 2,5 mL HF2 in den Hohlraum der tibiale Knochenmark am distalen Ende des Schienbeins (Knöchel). Spülen Sie die Knochenmarkzellen aus der Tibia mit leichtem Druck in die 14 mL Runde Unterrohr.
      1. Wiederholen Sie für die anderen Tibia.
    7. Durchschneiden Sie die proximalen und distalen Enden des Oberschenkelknochens mit einer Schere. Spülung der Femur Knochenmark Hohlraum durch eine 20-Gauge Nadel befestigt eine 3 mL Spritze mit 2,5 mL HF2 in das distale Ende des Femur Knochenmark Hohlraum und sanften Druck auf die Spritze.
      1. Wiederholen Sie für die anderen Femur, sammeln alle Knochenmark aus beide Tibiae und Oberschenkelknochen in der gleichen 14 mL Runde Unterrohr.
    8. Zerstreuen Sie die Knochenmark-Masse von oben und unten mehrmals mit der gleichen 20-Gauge-Nadel befestigt, die 3 mL Spritze absaugen.
  2. Antikörper Färbung des BMNC
    1. Graf BMNC. 20 µL der BMNC Suspension in Schritt 1.1.8 generierten fügen Sie 20 µL einer 3 % igen Essigsäure Lösung hinzu. Dann zählen Sie mit einer Hemocytometer und einem inversen Mikroskop.
    2. Pellet-die BMNC durch sanfte Zentrifugation bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Pellet mit HF2 mit 90 µL pro 107 Zellen und die Zellsuspension 10 µL biotinylierte Anti-Linie Antikörper cocktail hinzufügen.
    3. Nach Inkubation für 20 min bei 4 ° C, Waschen der gefärbten Zellen mit 3 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    4. Die BMNC mit 100 µL HF2 pro 107 Zellen aufzuwirbeln. Fügen Sie 2 µL Allophycocyanin (APC) Anti-Biotin Antikörper gegen die Zellsuspension, gefolgt von Inkubation bei 4 ° C für 20 min konjugiert.
    5. Spülen Sie den gefärbten BMNC mit 3 mL PBS und Aufschwemmen Sie der BMNC mit HF2 mit 0,2 µg/mL Propidium Jodid (PI) für Flow Cytometry Zellsortierung ergänzt.
  3. Flow Cytometry Zelle Sortierung von BMNC
    1. Flow Cytometry Zelle Sorter zu kalibrieren. Optimieren Sie alle Photomultiplier Tubes (PMTs), Streuung und Fluoreszenz-Parameter mit ungefärbten Zellen und innerhalb des linearen Bereichs jedes Melders.
    2. Bereiten Sie ungefärbt, PI-gefärbten und APC Bezeichnung Linie cocktail Zellen parallel ab Schritt 1.2. Spektrale Schadensersatz zu analysieren.
    3. Diskriminieren Sie Wams Zellen durch sequentielle Anspritzung von FSC-H vs. SSC-H, 640-SSC-A vs. 640-SSC-H und 640-SSC-S vs. 640-SSC-W.
    4. Schließen Sie aus, lebensschwache Zellen mit PI aufgeregt auf 561 nm und Emission mit einem 614/20 Band-Pass-Filter gesammelt. Begeistern Sie Linie APC Zellen bei 640 nm und sammeln Emission mit einem 671/30 Bandfilter beschriftet.
    5. Nehmen Sie Fluoreszenz-Werte als Spannung Höhe auf und sammeln Sie mindestens 100.000 Veranstaltungen in Liste Modus Datendateien, die Bevölkerungen zu sortierende zu visualisieren.
    6. Spektrale Entschädigung nach der Übernahme von drei Proben von 10.000 Zellen für Folgendes zu berechnen: stumme Zellen, PI beschriftet Zellen und Antikörper Anti-Linie Cocktail konjugiert mit APC Zellen beschriftet.
    7. Legen Sie drei Regionen, Linie negativ (LN), Linie positiv (LP) mit dim Fluoreszenzintensität (LP1) und LP Bevölkerung mit hellen Fluoreszenz (LP2) in 5 mL Röhrchen mit 0,5 mL der 10 % FBS Medien zu sortieren.
    8. Art-Zellen mit einem Tropfen umhüllen und Abbruch-Modus zu reinigen.
    9. Führen Sie Post-Art-Analyse mit insgesamt 1.000 Zellen auf jede sortierte Probe, die Reinheit und die Lebensfähigkeit der sortierten Zellen zu bestätigen.
    10. Sammeln Sie sortierte Zellen durch Zentrifugation bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C und aufzuwirbeln Sie Zelle Pellet mit 0,5 mL HF2.
    11. Bestätigen Sie mit Hemocytometer und Trypan blau sortierten Zelle. Anzahl von Zellen mit HF2 für Transplantationen anpassen.
      Hinweis: Ein breites Spektrum an BMNC Populationen kann für die Transplantation mit zusätzlichen Kombinationen von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern in Schritt 1.2.2 oben isoliert werden.

2. Empfänger Mäuse Vorbereitung und hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT)

  1. Vorbereitung der Transplantation Empfänger
    1. Veterinär- und Haltung Pflege Congenic Empfänger Mäuse (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in einen spezifischen Erreger (SPF) Tierhaltung zu erhalten.
    2. Für prophylaktische Dekontamination des Magen-Darm-Tracks bieten steriles Wasser mit 100 mg/L von Ciprofloxacin an die Empfänger für 7 Tage vor tödliche Dosis (9 Gy) Bestrahlung und pflegen für 14 Tage nach der Bestrahlung.
    3. Bieten Sie eine tödliche Dosis (9 Gy) Bestrahlung aus einer Cs-Quelle wie folgt. Verwenden Sie einen ausgebildeten und zertifizierte Cs-Operator. Legen Sie Cs Source Instrument, 70 cGy/min Ganzkörper-Gamma-Bestrahlung zu liefern. 10 Mäuse in eine speziell angefertigte Halterung und schieben Sie den Halter in die Kammer Brutapparat. 9 Gy-Ganzkörper-Bestrahlung in 13 min. zu liefern und die Mäuse in ihren Käfigen zurück.
  2. Transplantation von Hämatopoetischen Stammzellen
    1. Mischen Sie Wildtyp (WT) BMNC von einer Congenic Empfänger Maus (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in einer Zelle-Dosis von 2 x 105 Zellen pro Maus mit 2 bis 5 x 104 Zellen des gereinigten Tests erstellten BMNC mit Flow Cytometry Sortierung wie oben beschrieben in 1.3. Mischen Sie Zellen in derselben Spritze.
      Hinweis: Der WT-BMNC bieten eine Strahlung verschont-Wirkung auf der Empfänger Maus und für das Überleben der Empfänger Maus zu ermöglichen, wenn die Testzellen Hämatopoese nicht unterstützen. Die WT-BMNC verwendet in dieser Art von Experiment ausdrücklich das CD45.1 Allel und somit aus den Testzellen mit Antikörpern, die Unterscheidung zwischen CD45.1 und CD45.2 unterschieden werden. Die WT-BM-Zellen werden als "Helferzellen", "Strahlung-schonende Zellen" oder "Mitbewerber-Zellen" bezeichnet.
    2. Passen Sie das Zellvolumen Mischung zu 200 µL pro Empfänger mit sterilen HF2 zur Erleichterung der Injektion.
    3. Die Zelle-Mischungen, die letal bestrahlten Empfänger Mäuse über intravenöse Schweif Vene Injektion mit Hilfe einer 1 mL Spritze und 28-Gauge-Nadel, innerhalb von 24 Stunden nach der Bestrahlung zu verpflanzen. Platzieren Sie die Maus Rute unter einer Wärmelampe, wie Hitze führt zu Vene Dilatation Endstück.
      Hinweis: Einschläfern Sie die Empfänger Mäuse am Ende der Studie und bewerten Sie das Fortschreiten der Erkrankung durch Autopsie, Histologie und Durchflusszytometrie zu.

(3) Engraftment Assay mit Flow Cytometry

  1. Um Spender Zelle Engraftment bewerten, sammeln Sie peripherem Blut (PB) von den Empfänger Mäusen am 6. Woche, 12. und 16. Woche nach der Transplantation.
  2. Wärmen Sie die Empfänger in den Käfig mit Wärmelampe für ca. 1 min und eine einschränkende setzen Sie Maus.
  3. Schneiden Sie die Rute Vene mit einem Skalpell (Klinge 10, #3 Skalpell Griff) und sammeln Sie PB 100 µL pro Empfänger mit einem Microcapillary Rohr mit EDTA als ein Antigerinnungsmittel zu.
  4. Teilen Sie die gesammelten PB in zwei gleiche Aliquote, indem man 50 µL in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch. Verwenden Sie einen aliquoten für eine automatisierte komplettes Blutbild (CBC) (durchgeführt im NCI Histopathologie Kern) und die zweite aliquoten für Antikörper Färbung und flow Cytometry.
  5. Um Spender Engraftment durch Durchflusszytometrie erkennen, lyse der Erythrozyten (RBC) durch Zugabe von 1 mL Hypotonische RBC Lyse Puffer (8,29 g/L NH4Cl, 1 g/L KHCO3, 0,037 g/L Na2EDTA, pH 7,2) zu 50 µL der gesammelten PB. Wirbel der Probe zu mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Zentrifugieren Sie den lysierten PB bei 4.600 x g für 1,5 min. vorsichtig Aspirieren überstand und entsorgen.
  7. Stören Sie teilweise die Zelle Pellet durch sanft tippen oder "flicking" der Boden des Röhrchens. Fügen Sie 1,3 mL PBS in das Pellet in Rohr und Zentrifuge bei 4.600 x g für 1,5 min. sorgfältig Absaugen und entsorgen der Überstand entfernt.
  8. Stören Sie die Zelle Pellet durch Tippen oder streichen, und fügen Sie 200 µL HF2 ergänzt mit 5 % Ratte Serum zum Zelle Pellet.
  9. Fügen Sie Anti-CD45.2 Antikörper (1 µL) konjugiert mit Allophycocyanin (APC), die Zellsuspension hinzu. Bei 4 ° C für mindestens 30 min, kurz und Wirbel die Mischung inkubieren.
  10. Nach der Färbung der Zellen zweimal, wie oben beschrieben waschen und Aufschwemmen mit 400 µL HF2 ergänzt mit 1 µg/mL von PI.
  11. Mit einem 4-Farb-Durchflusszytometer Engraftment zu erkennen. Erhalten Sie weitere Informationen zu Arten von Zellen im peripheren Blut durch das Hinzufügen von zusätzlichen Antikörper, die bestimmte Zelltypen, wie B oder T-Lymphozyten erkennen.
  12. Notieren Sie serielle Engraftment Daten mithilfe einer Tabellenkalkulation zur weiteren Analyse der Daten zu ermöglichen.

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Ergebnisse

Wir zeigen repräsentative Zahlen für Ergebnisse mehrerer Experimente. Abbildung 1 zeigt eine repräsentative Durchflusszytometrie Sortierung Experiment. Während normaler Hämatopoetischer Differenzierung wie Zellen mit einer bestimmten hämatopoetischen Linie engagieren sie erwerben Linie definieren Zelle oberflächenmarker und das Potenzial für Selbsterneuerung zu verlieren. Daher ist in Wildtyp Mäusen, Stammzell-Selbsterneuerung auf Linie-Negative BMNC beschrän...

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Diskussion

Zwar MDS eine klonale hämatopoetische Stammzell-Störung, mdb "Stamm", oder initiierende Zellen wurden noch nicht charakterisiert. Wir zuvor nachweislich MDS transplantierbaren WT-Mäusen mit dem Knochenmark aus NHD13 Mäusen durch HSZT, gekennzeichnet durch macrocytic Anämie, Leukopenie, Neutropenie und morphologische Nachweis der Dysplasie15sein können. Darüber hinaus identifiziert wettbewerbsfähige Wiederbesiedlung Assays einen Vorteil Wachstum von Zellen aus dem Knochenmark NHD13 MDS. Zusammengen...

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Offenlegungen

Wir haben nichts zu veröffentlichen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch intramurale Research Program des National Cancer Institute, National Institutes of Health (Zuschuss Zahlen ZIA SC 010378 und v. 010983).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
14 mL Röhrchen mit rundem BodenFalcon352057
Hank's ausgewogene SalzlösungLonza10-527F
Anti-CD45.2 AntikörperSouthern Biotech1800-15LOT# A077-T044O
3 mL SpritzeMonoject8881513934
27-G-NadelBD305109
20-G-NadelBD
Lineage CocktailMiltenyi130-090-858LOT# 5170418221
Anti-Biotin AntikörperMiltenyi130-113-288LOT# 5171109046
1 mL SpritzeExcelint26027Insulinspritze
HeizlampeThermo Fisher ScientificE70001901
FACS GerätCytecFACScan2 Laser, 5 Farbdetektoren
FACS-SortierinstrumentBeckman CoulterMOFLO ASTRIOS5 Laser, 23 Parameter, 6 Populationssortierung gleichzeitig
PropidiumiodidThermo Fisher ScientificP3566
Gamma-BestrahlungBeste TheratronicsGammacell 40
BlutentnahmeröhrchenRAM scientific76011
Empfänger MäuseCharles RiverB6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 Mäusen/aC57Bl/6, CD45.2Kolonie im NIH gehalten
5 mL RundbodenröhrchenFalcon352058
305176

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Kernhaltige KnochenmarkzellenDurchflusszytometrieGanzk rperbestrahlungZellsortierungadoptiver TransferCD45 2 MarkerLineage negative ZellenAnalyse des peripheren Blutes
Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms
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