Parakrine und Juxtacrine zelluläre Interaktionen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Tumorprogression, Immunreaktionen, Angiogenese und Entwicklung. Hier ist eine proximale Kultur-Methode zur Untersuchung Parakrine Signalisierung wo sind die lokalisierten Konzentrationen der sezernierten Faktoren beibehalten und zelluläre Direktkontakt zu verhindern.
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Methodenartikel
Eine proximale Kultur-Methode zu studieren, Parakrine Signale zwischen Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Interzelluläre Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Tumorprogression, Immunreaktionen, Angiogenese und Entwicklung. Parakrine oder Juxtacrine signalisieren vermittelt diese Wechselwirkungen. Die Verwendung eines konditionierten Mediums und Coculture Studien sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Unterscheidung zwischen diesen beiden Arten von Interaktionen. Jedoch die Wirkung der lokalisierten hohe Konzentrationen von sezernierten Faktoren in der Mikroumgebung während die Parakrine Interaktionen ist nicht exakt von konditionierten Medium zusammengefaßt und so zu ungenauen Ergebnissen führen kann. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine proximale Kultur-Methode, um Parakrine Signalisierung studieren entwickelt. Die zwei Zelltypen werden entweder oberflächlich eine 10 µm dicken Polycarbonat-Membran mit 0,4 µm-Poren angebaut. Die Poren ermöglichen den Austausch von sezernierten Faktoren und zur gleichen Zeit hemmen Juxtacrine signalisieren. Die Zellen können gesammelt und am Endpunkt zu bestimmen, welche Auswirkungen die Parakrine Signalisierung lysiert. Darüber hinaus ermöglicht es für lokalisierte Konzentration Steigung von sezernierten Faktoren, ist diese Methode offen für Experimente mit längere Kultur sowie der Einsatz von Inhibitoren. Während wir diese Methode anwenden, um die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs Zellen und die Mesothelzellen stoßen sie auf der Website von Metastasen zu studieren, kann es zwei adhärente Zelltypen für Forscher, Parakrine Signalisierung in verschiedenen Bereichen zu studieren angepasst, einschließlich Tumor Mikroumgebung, Immunologie und Entwicklung.
Einleitung
Die Rolle der produktive gegenseitige Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Tumor Mikroumgebung in Tumorprogression gut etabliert und ist ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung auf Krebs Biologie1geworden. Ähnliche Fälle der bidirektionalen Signalisierung sind von entscheidender Bedeutung bei der Wundheilung, Immunreaktionen, Angiogenese, Stammzell-Nischen, und während der Entwicklung2,3,4,5,6 , 7 , 8. ein....
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Protokoll
Das Protokoll folgt den Richtlinien des institutionellen Regulatory Board der Indiana Universität.
1. Zelle-Vorbereitung
-
Isolation und Kultur der menschlichen primäre Mesothelzellen
- Isolieren menschliche primäre Mesothelzellen (HPMCs) von menschlichen Omentum beschriebenen17,18 und wachsen sie in komplette Wachstumsmedium [Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % Vitamine] bei 37 ° C und 5 % CO2.
Hinweis: Die HPMCs werden in der Rege....
- Isolieren menschliche primäre Mesothelzellen (HPMCs) von menschlichen Omentum beschriebenen17,18 und wachsen sie in komplette Wachstumsmedium [Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % Vitamine] bei 37 ° C und 5 % CO2.
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Ergebnisse
Metastasierenden Eierstockkrebs Zellen stoßen Mesothelzellen am Ort der Metastasen in die Bauchhöhle19. Produktive Parakrine und Juxtacrine Interaktionen mit Mesothelzellen Hilfe bei der Induktion von adaptive Reaktionen in den Eierstock-Krebs-Zellen, die ermöglichen erfolgreiche Metastasierung17,18,20,21 . Um die Wirksamkeit der proximal.......
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Diskussion
Den Mechanismus der Parakrine und Juxtacrine Signale zwischen Zellen zu verstehen ist wichtig für die Entwicklung einer besseren Kenntnis des normalen Gewebes Homöostase und Krankheit Bedingungen7,8. Die meisten Parakrine signalisieren, dass durch das Sammeln von Studien sind konditioniert Medium aus einer Zelle Art und benutzen, um die anderen Zelltyp zu behandeln. Diese Methode hat einen Vorteil in seiner Einfachheit. Jedoch ist es nicht genau lokalisierten Kon.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir sind verpflichtet, den Patienten für ihre Teilnahme an der Gewebe-Sammlung für diese Experimente. Ein DoD OCRP Ovarian Krebs Oscar (W81XWH-15-0253) und ein pilot Award von Colleens Dream Foundation, Anirban K. Mitra unterstützt diese Forschung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 24 mm Transwell-durchlässige Stütze mit 0,4 & Mikro; m Pore Polycarbonat Membran | Einsatz Corning (Costar) | 3412 | • 10 µ M dicke transluzente Polycarbonat-Membran & Bull; Behandelt für eine optimale Zelladhäsion • Verpackt 6 Einsätze in einer 6-Well-Platte, 4 Platten pro Karton • Die Membran muss für die Sichtbarkeit der Zellen gefärbt werden & bull; Sterilisiert durch Gammastrahlung |
| 6-Well-Platte | Corning (Falcon) | 353046 | Flachboden, TC-behandelt, steril, mit Deckel |
| 15 cm Kulturschale | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-behandelte Zellkulturschale |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nichtessentielle Aminosäure | Säuren Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM | Vitamine Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0,25% Trypsin, 2,21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fötales Rinderserum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Jede Marke ist in Ordnung | ||
| CO2 Inkubator | Jede Marke ist in Ordnung | ||
| der Biosicherheitsstufe II | Jede Fabrikat ist in Ordnung | ||
| FN1 TaqMan Genexpressionsassay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Genexpressionsassay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Genexpressionsassay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Genexpression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy Mini-RNA-Isolierungskit | Qiagen | 217004 | |
| cDNA-Reverse-Transkriptionskit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 Eierstockkrebszellen | Gewonnen vom Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralisierende Antikörper | R& D Systems | MAB1835-100 |
Referenzen
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology.
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Nachdrucke und Genehmigungen
