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Methodenartikel

Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Primärzelle Kultur von Fisch Hypophysen

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DOI:

10.3791/58159

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28. August 2018

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1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Oral Biology, Faculty of Dentistry, University of Oslo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Hypophyse primären Zellkulturen von Medaka (Oryzias Latipes) zu erhalten. Die optimierte Bedingungen in diesem Protokoll nehmen wichtige Parameter wie Temperatur, Osmolalität und pH berücksichtigt durch die Nachahmung der physiologischen Bedingungen der Fische, wodurch es physiologisch mehr aussagekräftige Ergebnisse.

Zusammenfassung

Primärzelle Kultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig von Wissenschaftlern verwendet, um zellulare Eigenschaften und Mechanismen der isolierten Zellen in einer kontrollierten Umgebung zu studieren. Trotz der großen Unterschiede in der Physiologie zwischen Säugetieren und Fischen Primärzelle Kultur Protokolle von den Fischen oft Säugetier-Kulturbedingungen, oft mit nur geringfügigen Änderungen basieren. Die ökologischen Unterschiede beeinflussen nicht nur die Körpertemperatur, sondern auch Blutserum Parameter wie Osmolalität, pH-Wert und Pufferkapazität pH. Da Zellkulturmedien und ähnlich funktionierende Lösungen imitieren Merkmale der extrazellulären Flüssigkeit bzw. Blutserum sollen, bei denen eine Zelle angepasst ist, ist es wichtig, dass diese Parameter speziell auf das betreffende Tier angepasst werden.

Das aktuelle Protokoll beschreibt optimierte Primärkultur Bedingungen für Medaka (Oryzias Latipes). Das Protokoll bietet detaillierte Schritte auf, wie zu isolieren und halten gesund dissoziiert Hypophyse Zellen für mehr als eine Woche und umfasst folgende Schritte: 1. gefunden die Einstellung der Osmolalität auf die Werte im Blutplasma Medaka, 2. die Anpassung der Inkubationstemperatur auf normalen Medaka Temperatur (hier in der Aquarium-Anlage), und 3. die Einstellung des pH und Bicarbonat Puffer zu Werten vergleichbar mit anderen Fischarten Leben bei ähnlichen Temperaturen. Die Ergebnisse, die mit dem beschriebenen Protokoll physiologisch sinnvolle Ergebnisse für Medaka fördern und von Wissenschaftlern machen primären Zellkulturen von anderen nicht-Säugetier-Arten als Nachschlagewerk verwendet werden können.

Einleitung

Zellkultur ist eines der wichtigsten Instrumente für die molekularbiologische Forschung, bietet eine ausgezeichnete Modellsystem für verschiedene biologische Fragen von normalen zellulären Physiologie bis hin zu Drogen-Screening und in der Karzinogenese1. Primärzellen, direkt aus dem tierischen Gewebe mit enzymatischen und/oder mechanischen Methoden isoliert werden oft als mehr biologisch relevante als Zell-Linien wie die biologische Reaktion auf die in-Vivo -Situation näher sein kann. Protokolle für die Zubereitung von primären Zellkulturen sollten optimiert werden, für jede Spezies und Zelle Interesse um imitieren die Eigenschaften, die eine Zelle angepasst ist, und physiologisch sinnvolle Ergebnisse zu erzielen.

Zahlreiche Protokolle beschreiben Kulturbedingungen für Säugetier-Zelle Systeme, während ähnliche Protokolle beschreiben Primärkultur Bedingungen für Fisch-Zellen im Vergleich eher knapp sind. Zellen sind anfällig für schnelle Änderungen in Temperatur, pH-Wert und Osmolalität und sind besonders empfindlich bei der Dissoziation. Kommerzielle Salzlösungen und Kulturmedien verwendet für Säugetier-Zelle Kulturen sind nicht optimal für teleost Fische, vor allem in Bezug auf die pH-Puffer-Systeme und Osmolalität. Deshalb ist es wichtig, zu messen und passen die Lösungen an physiologisch relevanten Ebenen dieser Parameter in den Arten von Interesse.

Hypophyse Primärkulturen von mehreren teleost Fischarten, darunter Karpfen vorgenommen wurden (Cyprinus Carpio)2,3, Rasen Karpfen (Ctenopharyngodon Idella)4, Goldfisch (Carassius Auratus )5, Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss)6, Europäischer Aal (Anguilla Anguilla)7, Tilapia (Oreochromis Mossambicus)8, Zebrafisch (Danio Rerio)9, und Atlantischer Kabeljau (Gadus Morrhua)10. Neben der Anpassung der Inkubationstemperatur auf die Arten von Interesse, haben einige dieser Protokolle der Zellen bei Säugetier-ähnlichen Bedingungen inkubiert, die möglicherweise für die Arten von Interesse, mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,5 in eine feuchte Atmosphäre suboptimale mit 3-5 % CO2. Darüber hinaus ist es unklar, ob die Osmolalität von Lösungen für die Zubereitung verschiedener diese primären Zellkulturen angepasst wurden und zwischen verschiedenen Lösungen stabil.

Das aktuelle Protokoll basiert auf früheren Arbeiten mit Primärkulturen von Atlantischer Kabeljau10 und besteht aus Anpassungen der Inkubationstemperatur, Osmolalität, pH-Wert und pH-Puffer-Systeme, einschließlich der Partialdruck des Kohlendioxids (pCO2), um die Physiologie des Medaka (O. Latipes). Medaka ist ein klein (3 – 4 cm) Süßwasserfisch, ursprünglich aus Ostasien. Heutzutage dient es als ein Modell-Arten in vielen Forschungslabors auf der ganzen Welt, da es relativ einfach zu züchten und sehr widerstandsfähig gegen viele gemeinsame Fisch Krankheiten11ist. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von Medaka als Vorbild, darunter eine Temperatur-Toleranz von 4 – 40 ° C11, eine kurze Generationszeit, transparente Embryonen, ein Geschlecht-Bestimmung gen12, und eine sequenzierte Genom13, sowie viele andere verfügbaren genetischen Ressourcen.

Die primäre Kulturbedingungen in diesem Protokoll werden optimiert, entsprechend der Temperatur von 26 ° C, die Medakas in der Fisch-Anlage gehalten werden. Darüber hinaus die Osmolalität von 320 mOsm/kg aus Atlantischer Kabeljau in Salzwasser bis 290 mOsm/kg für Medaka Leben im Süßwasser lebenden reduziert und steht im Einklang mit der normalen Osmolalität von Medaka Plasma14. Im Vergleich dazu ist die typische Osmolalität von Säugetieren Plasma im Bereich von 275-295 mOsm15. Fische leben in einer Vielzahl von Temperaturen und haben Kiemen, die in direktem Kontakt mit Wasser, so dass der pH und Puffer Kapazität des Blutes und der extrazellulären Flüssigkeit in den Fischen unterscheiden sich von denen bei Säugetieren sind. Säugetier-Kultur Medien umfassen in der Regel Puffersysteme, die einen pH-Wert von etwa 7,4 führen, wenn die Medien sind zu einem standard-Atmosphäre von 5 % CO2 in befeuchtete Luft bei 37 ° c equilibriert Der pH-Wert ist temperaturabhängig und der Wert für pH-neutral (im Wasser) steigt mit abnehmender Temperatur16. Typische teleost Fische Plasma pH-Bereiche von 7,7 bis 7,917. Die Optimierung dieses Protokolls enthalten eine Reduzierung von pH 7,85 für Kabeljau auf pH 7,75 für Medaka auf 26 ° C gehalten, durch die Erhöhung der CO2 von 0,5 % bis 1 % bei 12 ° C gehalten.

Darüber hinaus unterscheidet sich die Bicarbonat-Pufferkapazität in Fischen und Säugetieren. CO2 ist leicht über die Kiemen bei Fischen ausgetauscht und die pCO2 im Wasser ist nur ein kleiner Bruchteil des pCO2 in der Lunge-18. Entweder die Temperatur oder die pCO2 ändert pH und Puffer des Mediums ändern. Weder den pH-Wert noch die pCO2 empfohlen für die Inkubation von Säugerzellen deshalb optimal für Fisch-Zellen, und daher sollte die Nährmedien mit Puffersysteme, die physiologisch relevanten Werte für Fische optimiert werden und die bestimmte Arten von Interesse. Dieses Protokoll beschreibt die primären Zellkulturen von Medaka Hypophysen vorzubereiten und umfassen Anpassungen der Inkubation Osmolalität, Temperatur, pH-Wert und pH Puffersystem, neben anderen wichtigen Parameter, die bei der Vorbereitung der Primärzelle Kulturen von nicht-Säugetier-Arten.

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Protokoll

Die Tierversuche durchgeführt in dieser Studie wurden von der norwegischen Universität für Biowissenschaften, folgende Richtlinien für die Pflege und das Wohlergehen der Versuchstiere genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösungen

  1. Kalibrieren Sie die XR und pH Meter-Instrumente nach den Anweisungen des Herstellers um korrekte Messungen zu gewährleisten.
  2. Bereiten Sie 500 mL Ca2 +- und Mg2 +-freie Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (dPBS), Einstellung des pH-Werts auf 7,75 (Schritt 1.2.1) und der Osmolalität auf 290 mOsm/kg (Schritt 1.2.2) vor einer Sterilfiltration (Schritt 1.2.3).
    1. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit einem kalibrierten pH-Meter indem Sie sorgfältig Tropfen einer 1 M NaOH-Lösung die Lösung sorgfältig rühren.
    2. Messen Sie die Osmolalität der Lösung mit einem kalibrierten XR zu und berechnen Sie die Höhe der Mannit musste die Osmolalität auf 290 mOsm/kg zu erhöhen. Fügen Sie die erforderliche Menge an Mannit und Messen Sie dann die Osmolalität der Lösung wieder auf die richtige Einstellung zu gewährleisten.
      Hinweis: Die Höhe der Mannit benötigt richtet sich nach der Osmolalität gemessen, die in der Regel zwischen verschiedenen Chargen variiert. Ein Molekül Mannit entspricht 1 osmotischen Teilchen.
    3. Steril-Filter die dPBS Lösung mit einem 0,2 µm-Filter.
      Hinweis: Die Lösung kann bei 4 ° C für mindestens 3 Monate aufbewahrt werden.
  3. Bereiten Sie 500 mL Kulturmedium Leibovitz (L-15) ohne L-Glutamin und Bikarbonat und ergänzen Sie es mit 10 mM Nahco33 (Schritt 1.3.1), 4,5 mM Glukose (Schritt 1.3.2) und 2 mM im Handel erhältlichen Glutamin (Schritt 1.3.3). Passen Sie die Lösung für 290 mOsm/kg (Schritt 1.3.4), Sterilfilter es (Schritt 1.3.5) und 2,5 mL einer Penicillin-Streptomycin-Lösung (Schritt 1.3.6).
    Hinweis: Die Lösung kann für mindestens 4 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.
    1. Fügen Sie 420 mg Nahco33 pro 500 mL Kulturmedium eine 10 mM-Lösung zu erreichen.
    2. Fügen Sie 405 mg Glukose pro 500 mL Kulturmedium Herbeiführung eine 4,5 mM-Lösung hinzu.
    3. Fügen Sie 100 X Lager einer Glutamin-Lösung 5 mL in 500 mL Kulturmedium eine 2 mM-Lösung zu erreichen. Rühren Sie, bis alle gelösten Stoffen gelöst werden.
    4. Passen Sie die Lösung auf 290 mOsm/kg mit Mannit mit einer XR (wie in Schritt 1.2.2 ausgeführt).
    5. Führen Sie eine sterile Filtration des L-15 Mediums mit einem 0,2 µm-Filter.
    6. Fügen Sie nach der Sterilfiltration 2,5 mL einer Penicillin-Streptomycin-Lösung, entsprechend 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin.
  4. Bereiten Sie 50 mL einer Trypsin-Lösung mit 1 mg/mL (0,1 %)-Trypsin-Typ II-S in der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) aufgelöst. Aliquote von 2 mL in sterilen Kunststoffrohre und speichern Sie diese bei-20 ° C bis zur Verwendung.
    Hinweis: Aliquote von 2 mL können bei-20 ° C für mindestens 3 Monate gespeichert werden.
  5. Bereiten Sie 50 mL einer Trypsin-Inhibitor-Lösung mit 1 mg/mL (0,1 %) Trypsin Inhibitor Typ I-S und ergänzen Sie es mit 2 µg/mL DNase, die ich in der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) aufgelöst. Aliquote von 2 mL in sterilen Kunststoffrohre und speichern Sie diese bei-20 ° C bis zur Verwendung.
    Hinweis: Aliquote von 2 mL können bei-20 ° C für mindestens 3 Monate gespeichert werden.

2. Vorbereitung der Ausrüstung

  1. Bereiten Sie glaspipetten durch Feuer Polieren der Tipp für die Zelle Dissoziation vor. Tipps mit 2 verschiedenen Größenklassen zu machen (eine mittlere Öffnung von 0,6-0,8 µm und eine kleine Öffnung von 0,4 – 0,6 µm) durch das Spiel mit der Zeit und den Abstand von der Flamme und drehen Sie gleichzeitig die Pipette. Ablegen der glaspipetten in einem sauberen Behälter und Autoklaven (mit der solid-Modus bei 105 ° C für 45 min.).
  2. Bereiten Sie eine Styroporbox mit Eis.
  3. Bereiten Sie ein Kunststoffrohr mit 1,5 mL veränderte dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) übertragen die Hypophysen, während der Präparation und halten sie auf dem Eis.
  4. Bereiten Sie eine 15 mL-Tube mit 10 mL der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) und lassen Sie ihn auf Eis, bis die Zelle Dissoziation.
  5. Frisch bereiten Sie zu oder tauen Sie Aliquote des Trypsin und Trypsin-Inhibitor-Lösungen (vorbereitet in Schritten 1.4 und 1.5 auf) und halten sie auf dem Eis bis zur Verwendung.
  6. 26 ° C im Wasserbad vor Beginn der Dissektion damit das Wasser die gewünschte Temperatur vor der chemischen Dissoziation der Hypophysen erreichen soll.
  7. Reinigen Sie alle Dissektion Werkzeuge mit 70 % Ethanol, vor, während und nach dem Gebrauch, einschließlich feine Pinzette für die Zerlegung und feinen Nadeln und eine Wachs-Platte verwenden, um die Fische zu fixieren. Verwenden Sie saubere Handschuhe (ändern und häufig reinigen) während des gesamten Verfahrens um eine mögliche Verschmutzung der Zellen zu vermeiden.

(3) die Hypophyse Dissektion und Zelle Dissoziation

  1. Einschläfern der Fisch durch Eintauchen in Slush Eis (0 ° C). Lassen Sie den Fisch in den Matsch Eis mindestens 1 min. um eine irreversible hypothermen Schock zu gewährleisten.
    Hinweis: Immobilisierung und Gleichgewicht Verlust wird nach wenigen Sekunden auftreten. Stellen Sie sicher, der Fisch ist komplett in das Eis Wasser getaucht und liegt nicht auf dem Eis, da Letzteres zum ersticken führt und potenzielle Haut, anstatt einen schnellen und humane hypothermen Schock brennt.
  2. Schnell übertragen Sie die Fische in einem Netz auf einer Wachs-Platte unter dem Mikroskop Dissektion und zerstören Sie die Wirbelsäule durch eine Nadel Punch durch den Hals.
  3. Heften Sie den Kopf des Fisches, die Wachs-Platte mit feinen Nadeln, durch eine Nadel in der Front (über den Mund) und eine auf jeder Seite des Kopfes (hinter dem Gehirn) um den Kopf vor der Präparation zu stabilisieren.
  4. Sehen Sie die Fische unter dem Mikroskop Dissektion und vorsichtig abkratzen der Schuppen auf der Oberseite des Kopfes mit feinen Pinzette mit abgewinkelter Spitze.
  5. Sorgfältig führen Sie die abgewinkelte Spitze der feinen Zange unter die Haut von der Seite des Kopfes und entfernen Sie der Schädel-Dach, indem Sie langsam die Zange in die Richtung des Mundes, halten Sie einen festen Griff um die Zange umschließen das Schädel-Dach.
  6. Abschneiden des Rückenmarks komplett mit Pinzette mit abgewinkelter Spitze.
    Hinweis: Es ist ein wichtiger Faktor, so arbeiten effizient und genau die Zeit begrenzen verbrachte aus der Dissektion der Hypophysen bis die Zellen in der Schale überzogen sind. Nach einiger Übung Hypophyse Dissektion dauert ca. 2 – 3 min. pro Fisch, von denen nur rund 10 s sind notwendig, um die Hypophyse zu holen, wenn das Gehirn bereits ausgesetzt ist.
  7. Drehen Sie sorgfältig das Gehirn in Richtung der Mündung zu entlarven die Hypophyse und mit sauberen Pinzette mit einer geraden Spitze zu sezieren. Die Hypophyse auf ein Kunststoffrohr mit 1,5 mL geändert dPBS übertragen (für Details, siehe Schritt 2.3) auf Eis gelegt. Überprüfen Sie die Spitze der Zange unter die Lupe genommen, um sicherzustellen, dass die Hypophyse erfolgreich, um das Rohr hinzugefügt wird und nichts auf der Zange bleibt.
    Hinweis: Sezieren Sie soviele Hypophysen Bedarf, abhängig von der Anzahl der Kultur Gerichte, die gleichzeitig zubereitet werden. Als Faustregel gilt berechnen Sie mindestens 10 Hypophysen von ausgewachsenen Fischen pro Schale, eine entsprechende Dichte der Zellen (die von der nachgeschalteten Anwendung abhängt).
  8. Spin-down der Hypophysen in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur. Sorgfältig die dPBS mit einer Glaspipette zu entfernen und um zu vermeiden, entfernen alle Hypophysen kümmern.
  9. Fügen Sie 1 mL Trypsin-Lösung (in Schritt 1.4 vorbereitet) zu waschen die Hypophysen, drehen sie sich in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s und der Großteil der Flüssigkeit mit einer Glaspipette vor dem Hinzufügen einer zusätzlichen 1 mL Trypsin-Lösung zu entfernen.
  10. Inkubieren Sie das Rohr in einem Wasserbad bei 26 ° C für 30 min, vorzugsweise mit sanft schütteln, oder alternativ, streichen Sie dem Rohr ein paar Mal während der Inkubationszeit.
  11. Spin-down der Hypophysen in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und sicherstellen, dass alle Hypophysen an der Unterseite des Rohres befinden. Entfernen Sie die meisten der Trypsin-Lösung mit einer Glaspipette und 1 mL der Trypsin-Inhibitor-Lösung (vorbereitet in Schritt 1.5) um die Trypsin zu inaktivieren und waschen die Hypophysen.
  12. Sammeln Sie die Hypophysen an der Unterseite des Rohres durch Drehen sie nach unten in eine Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit mit einer Glaspipette und 1 mL die Trypsin-Inhibitor-Lösung (in Schritt 1.5 vorbereitet). Legen Sie das Rohr auf einem Wasserbad bei 26 ° C für 20 min, vorzugsweise mit sanft schütteln, oder alternativ, streichen Sie dem Rohr ein paar Mal während der Inkubationszeit, die Trypsin zu inaktivieren.
  13. Bereiten Sie eine 35 mm-Poly-d-Lysin-beschichtete Zelle Kulturschale mit einem zentralen Glasboden durch Hinzufügen von 2 mL des L-15 Mediums und lassen, dass für mindestens 10 min bei 26 ° C und mit 1 % CO2 zu Bebrüten, so dass es die richtige Temperatur und pH-Wert erreichen kann, vor der galvanischen Zellen.
    Hinweis: Die Kulturschale Kunststoff Zelle kann auch verwendet werden. Der wesentliche Vorteil der Verwendung einer Gerichts mit einem zentralisierten Glasboden ist, dass der Bereich, wo die Zellen überzogen sind, kleiner, und daher weniger Hypophyse Zellen pro Gericht erforderlich sind. Einige downstream-Anwendungen erfordern möglicherweise auch ein Glasboden (d.h., einige bildgebenden Verfahren).
  14. Die kühle Zentrifuge für die 15 mL-Tuben bis 4 ° C erlauben es, die gewünschte Temperatur zu erreichen, bevor Sie beginnen die mechanische Dissoziation festgelegt.
  15. Sammeln die Hypophysen am unteren Ende der Röhre durch Drehen hinunter den Schlauch mit Trypsin Inhibitor Lösung (aus Schritt 3.11) in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und sicherstellen, dass alle Hypophysen befinden sich am Boden des Röhrchens vor sorgfältig entfernen die meisten der Trypsin-Inhibitor-Lösung mit einer Glaspipette.
    Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte des Protokolls in einer Laminar-Flow Bank (LAF) zertifiziert für Zelle Arbeit um eine Kontamination der Zellen zu vermeiden.
  16. Die Hypophyse Gewebe Stücke 1 mL eiskaltes modifizierte dPBS (vorbereitet in Schritt 2.4) hinzu und saugen Sie sanft die Gewebe Stücke nach oben und unten (6 – 7 X) in eine feuerpolierte Glaspipette (in Schritt 2.1 vorbereitet).
    Hinweis: Die Temperatur ist ein wichtiger Aspekt, also halten Sie alle Lösungen bei 4 ° C. Ab diesem Zeitpunkt alle Schritte auf dem Eis wenn möglich.
  17. Spin-down der Gewebe-Stücke in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und übertragen Sie sorgfältig am oberen Ende des dPBS der dissoziierten Zellen (fast 1 mL), eine neue 15 mL Tube auf Eis gelegt. Vermeiden Sie die Pipette in Richtung zur Unterseite des Rohrs bewegen, wo sind die Gewebe Stücke übrig.
  18. Wiederholen Sie Schritt 3.16 – 3.17, wehre die Zellen in 1 mL eiskaltes dPBS hintereinander, bis alle 10 mL des dPBS verwendet wird. Starten Sie mit einer Glaspipette mit einem mittleren Öffnung und Umstellung auf eine Glaspipette mit einer kleineren Öffnung gegen Ende (für die letzten 3 – 4 mL des dPBS hinzugefügt) die Dissoziation. Wenn es noch sichtbare Gewebe Stücke am Ende des Verfahrens Dissoziation, pipettieren, ca. 10 X auf die 2 letzten Schritte des dPBS zur Dissoziation zu erhöhen, und schließlich die verbleibende Gewebe Stücke hinterlassen. Aufschwemmen der Zellen vorsichtig und vermeiden Sie Luftblasen zu schaffen, als es Zellschäden verursachen, wenn die Zellen an der Oberfläche der Blasen befestigen.
    Hinweis: Dies ist ein kritischer Schritt dieses Protokolls und erfordert einige Übung, ein gutes Ergebnis zu erreichen.
  19. Balancieren Sie das Rohr in die Zentrifuge (vorgekühlt auf 4 ° C) und Spin-down der Zellen bei 200 X g für 10 min bei 4 ° C. Achten Sie auf die Seite des Rohres zu markieren, wo die Zelle Pellet werden.
  20. Entfernen Sie vorsichtig den Schlauch aus der Zentrifuge und übertragen Sie den Überstand mit einer Glaspipette sanft auf eine leere 15 mL-Kunststoff-Rohr direkt nach der Zentrifugation. Achten Sie darauf, entfernen die meisten des Überstands aber achten Sie darauf, nicht zu verlieren die kleinen Pellets (oft unsichtbar) Zelle.
  21. Sorgfältig Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50-100 µL L-15 Kulturmedium.
    Hinweis: Bei diesem Schritt ist es möglich, zählen die Zellen und/oder führen Sie einen Test der Lebensfähigkeit (z. B. eine Zelle zählen im Beisein von Trypan blau mit einem Hemocytometer), aber hüten Sie sich vor, dass mit einem Teil der Zellsuspension zu diesem Zweck die Ausbeute senken. Vermeiden Sie die Verwendung einer großen Aussetzung Volumen da es das Risiko einer Verbreitung außerhalb der Mitte der Schale Zellen erhöht wird.
  22. Sorgfältig abtropfen der dissoziierten Zellen in der Mitte der Zelle Kulturschale mit 2 mL des L-15 Mediums (vorbereitet in Schritt 3.13). Lassen Sie die Zellen an der Unterseite der Schale für ca. 5 min zu versenken, bevor Sie verschieben sie in den Inkubator zu vermeiden, dass die Zellen außerhalb der versunkenen Teil der Glasboden zu verbreiten.
  23. Inkubieren Sie die Schüssel bei 26 ° C und 1 % CO2 erlauben die Zellen gründlich zu versenken und legen auf den Boden der Schale.
  24. Schauen Sie nach 30 min sich die Zellen im Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie an der Kulturschale angeschlossen haben.
  25. Weiterhin die Zellen bei 26 ° C und 1 % CO2inkubieren.
  26. Sorgfältig zu ändern die meisten (aber nicht alle) das Medium alle 3 – 4 Tage.
    Hinweis: Vermeiden Sie Ändern des Mediums immer häufiger, wie es möglicherweise die Zellen stören und machen sie von der Glasboden zu lösen. Verwenden Sie die Zellen innerhalb einer Woche nach der Aussaat sie für Experimente.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung einer Primärzelle Kultur von Medaka Hypophysen und bietet gesunde Zellen, die in einer Kultur für mindestens eine Woche gewartet werden können. Das Protokoll basiert auf physiologisch relevanten Werte für Medaka14 und ist zusätzlich mit der Hypophyse Gewebe im ausgewachsenen Fischen, mit einem pH-Wert von 7,75 und eine Osmolalität von 290 mOsm/kg während des gesamten Verfahrens von der Gewebe-Ernte, die vergoldeten optim...

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Diskussion

In-vitro- Zellkultursysteme bieten leistungsstarke Tools für Forscher, eine Fülle von verschiedenen biologischen Fragen zu beantworten, wenn im richtigen Weg1verwendet. Es ist wichtig zu bedenken, dass dissoziierte Zellen, die ihre Verbindungen zu den benachbarten Zellen verloren haben unterschiedliche funktionale Eigenschaften erhalten haben können, als sie in Vivo ursprünglich. Um zu vermeiden, wird auf die Gefahr hin falsch interpretiert, die Ergebnisse von in-vitro- ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verzollen.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde von der norwegischen Universität für Biowissenschaften und der Forschung Rat von Norwegen, Grant-Nummer 243811 und 244461 (Aquakultur Programm) finanziert. Wir sind dankbar, Lourdes Carreon Tan an der norwegischen Universität für Biowissenschaften für die Aufrechterhaltung der Fisch-Anlage.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (dPBS), ohne Calciumchlorid und MagnesiumchloridSigma (Merck, Damstadt, Deutschland)D8537Lösung auf pH 7,75 mit 1M NaOH und 290 mOsm mit Mannitol einstellen.
L-15 Medium (Leibovitz), ohne L-GlutaminSigma (Merck, Damstadt, Deutschland)L5520Ergänzung 500 ml Kulturmedium mit 10 mM NaHCO3, 4,5 mM Glukose, 2 mM Glutamax. Passen Sie die Lösung mit Mannitol auf 290 mOsm an und filtern Sie die Lösung durch eine 0,2 & Mikro; m PES-Sterilfilter, vor Zugabe von 2,5 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (Details siehe unten).
NaOHSigma (Merck, Damstadt, Deutschland)S5881Tropfen 1 M Lösung geben, um den pH-Wert von dPBS und Kulturmedium auf 7,75 zu erhöhen.
NaHCO3Sigma (Merck, Damstadt, Deutschland)S576110 mM NaHCO3 entspricht 420 mg pro 500 mL Kulturmedium.
D-MannitolSigma (Merck, Damstadt, Deutschland)63565Zur Erhöhung der Osmolalität von dPBS und Kulturmedium. Berechnen Sie die korrekte Menge, die benötigt wird, um eine Osmolalität von 290 mOsm zu erreichen.
D-GlukoseSigma (Merck, Damstadt, Deutschland)G54004,5 mM  D-Glucose entspricht 405 mg pro 500 ml Kulturmedium.
GlutaMAX SupplementGibco (Life Technologies, Paisley, UK)35050-061Alternative zu L-Glutamin, mit erhöhter Stabilität. 2 mM Glutamax entspricht 5 ml 100x Stamm in 500 mL Kulturmedium.
Penicillin-StreptomycinSigma (Merck, Damstadt, Deutschland)P0781Stammlösung 10.000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin pro ml. Verwenden Sie 2,5 mL Stammlösung in 500 mL L-15 Medium (entspricht 50 U/mL Penicillin und 50 &; Mikro; g/ml Streptomycin).
Trypsin Typ II-SSigma (Merck, Damstadt, Deutschland)T74091 mg/ml in dPBS-Lösung herstellen.
Trypsin-Inhibitor Typ I-SSigma (Merck, Damstadt, Deutschland)T6522Bereiten Sie 1 mg/ml in dPBS-Lösung her, ergänzen Sie mit 2 & Mikro; g/ml Dnase I (siehe Details unten).
Dnase ISigma (Merck, Damstadt, Deutschland)D5025Anwendung in Trypsin-Inhibitor-Lösung (siehe oben).
0,2 &Mikro; m Sterilfiltersystem aus Polyethersulfon (PES)Corning Inc. (Corning, NY)431097Zur Sterilfiltration von dPBS und L-15 Medium nach Justierungen.
35 mm Zellkulturschale mit Glasboden, Poly-D-Lysin-beschichtetMatTek Corporation (Ashland, MA)P35GC-1.5-10-CKann je nach nachgeschalteter Anwendung auch durch eine Kunststoffschale ersetzt werden.
Dumont #5 feine PinzetteFine Science Tools (CA)11254-20Gerade Spitze
Dumont #5/45 feine PinzetteFine Science Tools (CA)11253-25Abgewinkelte 45°
Spitze Stereomikroskop SZ61Olympus Corp. (Tokio, Japan)Zum Sezieren von Hypophysen.
Alegra X-22R CentrufugeBeckman Coulter Inc. (Brea, CA)Mit Kühloption (ähnlich dem aktuellen Modell XR-30).
WasserbadTechne (Staffordshire, UK)Jedes Wasserbad mit der Möglichkeit, die Temperatur einzustellen, ist geeignet.
Pasteur-GlaspipettenVWR (NY)612-1701Außendurchmesser 1,6 mm, vor Gebrauch feuerpoliert und autoklaviert.
Galaxy MiniStar TischzentrifugeVWR (NY)521-2844Jede kleine Tischzentrifuge ist geeignet.
Feine Nadeln/InsektennadelnFine Science Tools (CA)26001-40Durchmesser 0,03 mm. Es können auch andere feine Nadeln verwendet werden.
Wachsplattenach Maß durch Zugabe von geschmolzenem Paraffinwachs in eine große Petrischale.

Referenzen

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