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Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

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DOI:

10.3791/58169

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16. August 2018

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1John Innes Centre

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Transiente heterologen Expression von biosynthetischen Enzymen in Nicotiana Benthamiana Blätter kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken. Hierin ist ein detailliertes Protokoll für Rapid (5 Tage) präparative angelegte Produktion von TRITERPENE und Analoga, die unter Verwendung dieser leistungsstarken pflanzlichen Plattform beschrieben.

Zusammenfassung

Die TRITERPENE sind eines der größten und die meisten strukturell unterschiedlichen Familien von pflanzlichen Naturprodukten. Viele Triterpene Derivate haben gezeigt, dass medizinisch relevanten biologischen Aktivität besitzen. Allerdings hat dieses Potenzial bisher nicht in eine Fülle von Triterpene stammenden Drogen in der Klinik umgesetzt. Dies ist wohl (zumindest teilweise) führen eine Folge der begrenzten praktischen synthetischen Zugang zu dieser Klasse Verbindung, ein Problem, das die Erforschung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und Entwicklung von ersticken kann Kandidaten durch traditionelle Arzneimittel Chemie-Workflows. Trotz ihrer immensen Vielfalt TRITERPENE alle stammen aus einer einzigen linearen Vorläufer 2,3-Oxidosqualene. Transiente heterologen Expression von biosynthetischen Enzymen in N. Benthamiana kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken, die natürlich nicht von diesem Host hergestellt werden. Agro-Infiltration ist eine effiziente und einfache Mittel zur Erreichung transiente Expression in N. Benthamiana. Der Prozess umfasst Infiltration der Blätter der Pflanze mit einer Suspension von Agrobacterium Tumefaciens tragen den Ausdruck Construct(s) von Interesse. Co Infiltration von einer zusätzlichen A. Tumefaciens Belastung tragen, ergibt sich ein Ausdruck Konstrukt Codierung, die ein Enzym, das Vorläufer Versorgung deutlich steigert erhöht. Nach einer Frist von fünf Tagen kann zu extrahieren und zu isolieren, die sich daraus ergebenden Triterpene Produkte die eingedrungene Blattmaterial geerntet und verarbeitet werden. Dies ist ein Prozess, der zuverlässig und Linear skalierbar ist einfach durch Erhöhung der Anzahl der Pflanzen in das Experiment. Hierin ist ein Protokoll für schnelle präparative-Produktion der TRITERPENE, die Verwendung dieser pflanzlichen Plattform beschrieben. Das Protokoll nutzt eine Vorrichtung leicht replizierbar Vakuum Infiltration, ermöglicht das gleichzeitige Eindringen von bis zu vier Anlagen, diskontinuierlichen Infiltration von Hunderten von Pflanzen in kurzer Zeit ermöglicht.

Einleitung

Die TRITERPENE sind eines der größten und die meisten strukturell unterschiedlichen Familien von pflanzlichen Naturprodukten. Trotz ihrer immensen Vielfalt sind alle Triterpene Naturprodukte vermutlich die gleichen linearen Vorläufer 2,3-Oxidosqualene, ein Produkt des Mevalonat-Signalwegs in Anlagen abgeleitet werden. Biosyntheseschritt von 2,3-Oxidosqualene initiiert und gesteuert durch eine Familie von Enzymen Oxidosqualene Cyclases (OSCs) bezeichnet. Dieser biosyntheseschritt Schritt der ersten Ebene der Diversifizierung, mit Hunderten von verschiedenen Triterpene Gerüste von Natur1berichtet worden. Diese Gerüste sind weiter diversifiziert und durch maßgeschneiderte Enzyme, einschließlich aber nicht beschränkt auf, Cytochrom p450s (CYP450s)1,2. Solchen biosynthetischen Bahnen führen zu immensen Komplexität, was manchmal zu Endprodukten, die aus der übergeordneten Triterpene kaum erkennbar sind. Zum Beispiel ist die komplexe Struktur der potenten Insektizide und Antifeedant Limonoid Azadirachtin glaubte, ein Tetracyclic Triterpene Tirucallane Typ3abgeleitet.

Viele Triterpene abgeleitet Naturprodukte, auch solche mit relativ unveränderten Elternteil Gerüste, nachweislich medizinisch relevanten biologischen Aktivität4,5,6,7besitzen. Allerdings hat dieses Potenzial bisher nicht in eine Fülle von Triterpene stammenden Drogen in der Klinik umgesetzt. Dies ist wohl (zumindest teilweise) führen eine Folge der begrenzten praktischen synthetischen Zugang zu dieser Klasse Verbindung, ein Problem, das die Erforschung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und Entwicklung von ersticken kann Kandidaten durch traditionelle Arzneimittel Chemie-Workflows.

Transiente Expression von Triterpene biosynthetischen Enzymen aus anderen Pflanzenarten in N. Benthamiana Blätter kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten (Abbildung 1) umleiten. Dieser Prozess lässt sich funktionell charakterisieren Kandidat Enzyme und die biosynthetischen Bahnen wichtig natürlich vorkommende Stoffwechselprodukte zu rekonstruieren. Ebenso kann es auch ausgenutzt werden kombinatorische biosynthetischen Ansätze, neuartige Triterpene Produkte, eine Strategie zu produzieren, die in den Bibliotheken von strukturell verwandten Analoga, so dass systematische Erforschung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen führen kann biologisch aktive Blei-Verbindungen8,9.

Agroinfiltration ist eine effiziente und einfache Mittel zur Erreichung transiente Expression in N. Benthamiana Blättern. Der Prozess umfasst die Infiltration der Blätter mit einer Suspension von A. Tumefaciens tragen die binären Ausdruck Construct(s) von Interesse. Dies geschieht über die Anwendung von Druck, die Flüssigkeit durch die Stomata, Luft in den interzellularraum verdrängt und ersetzt sie durch A. Tumefaciens Federung zwingt. Die Bakterien übertragen die jeweiligen T-DNA in das Innere der Pflanzenzellen, wodurch lokalisierte und transiente Protein-Expression in den infiltrierten Blattgewebe.

Während alle binären Vektor geeignet für Erzeugung transgene Pflanzen für transiente Expression eingesetzt werden kann, wir nutzen das Cowpea Mosaik Virus CPMV abgeleitet Hypertranslational (HT) Protein Ausdruck System10, 11. in diesem System wird das Gen des Interesses von unübersetzte Regionen (UTR) aus CPMV RNA-2 flankiert. Die 5' UTR enthält Änderungen, was zu sehr hohen Protein-Übersetzung mit keine Abhängigkeit von Virusreplikation12. Diese Technik wurde in der Easy-Quick (pEAQ) binäre Vector Serie entwickelt die ortsspezifische Rekombination Klonen Protokoll-kompatiblen Konstrukte (pEAQ -HT- DEST)10,11umfasst. Die meisten pEAQ Vektoren enthalten auch eine Tomate buschigen Stunt Virus abgeleitet P19 stummschaltungs-Suppressor gen13 innerhalb der T-DNA als Bestandteil der Expressionskassette, umgeht die Notwendigkeit, eine separate P19-tragenden Sorte coinfiltrate und bietet sehr High-Level Protein-Expression in den Host Pflanze Zelle10,11.

Verwendung von N. Benthamiana als ein Ausdruck Host besondere Vorteile hat bei der Arbeit mit Pflanzen biosynthetischen Bahnen. Die Zellarchitektur unterstützt intrinsisch entsprechenden mRNA und Protein-Verarbeitung und ordnungsgemäße Abschottung, neben der notwendigen Coenzyme, Reduktasen (für CYP450s) und metabolischen Grundstoffe. Die Kohlenstoffquelle ist Photosynthese; So können Pflanzen einfach in qualitativ hochwertigem Kompost, erfordern nur Wasser, CO2 (aus der Luft) und Sonnenlicht als Eingänge angebaut werden. Die Plattform ist auch sehr praktisch für Co Ausdruck von verschiedenen Kombinationen von Proteinen, wie dies durch das Co Eindringen verschiedener Stämme von A. Tumefaciens, negiert die Notwendigkeit, große multigene Ausdruck erstellen facilely erreicht werden kann Kassetten. Darüber hinaus kann der Prozess zuverlässig und linear skaliert werden einfach durch Erhöhung der Anzahl der Pflanzen in das Experiment.

Bisherige Arbeit in unserem Labor hat die Nützlichkeit dieser Plattform für präparative Skala Experimente gezeigt. Dazu gehörten die Vorbereitung der neuartigen TRITERPENE für Bioaktivität Assays und Skala bis Gramm-Mengen isoliertes Produkt zu erreichen. Des weiteren Ansammlung von heterogenen Triterpene Produkte gesteigert werden kann mehrere Falten durch Co Ausdruck einer N-Terminal-abgeschnitten, Feedback-unempfindliche Form des 3-hydroxy-, 3-Methyglutary-Coenzym eine Reduktase (tHMGR), eine Bandbreitenbegrenzung vor- Enzym in der Mevalonate Bahn8.

Schlüssel für solche Experimente präparative-Skala ist die Möglichkeit, bequem bis-der Infiltrationsvorgang Skala. In einem typischen Experiment möglicherweise Dutzende bis Hunderte von Pflanzen müssen die Zielmenge isoliertes Produkt zu erreichen. Infiltrieren einzelne Blätter von hand ist (mit einer unnötigen Spritze), operativ anspruchsvoll und oft sehr zeitaufwendig, Rendern diese Methode nicht praktikabel für routinemäßige Scale-Up. Vakuum Infiltration bietet Vorteile gegenüber Hand Infiltration, wie es nicht abhängig von der Spielstärke des Betreibers ist und das Eindringen von einen größeren Bereich der Blattoberfläche ermöglicht. Dieses Verfahren ist für die großtechnische Produktion von Pharmaproteinen14kommerziell genutzt. Dieses Protokoll verwendet eine leicht replizierbar Vakuum Infiltration Vorrichtung, die aus handelsüblichen Teilen konstruiert werden kann. Dies ermöglicht das gleichzeitige Eindringen von bis zu 4 Pflanzen, bieten schnelle und praktische diskontinuierlichen Infiltration von Hunderten von Pflanzen in kurzer Zeit (Abbildung 2a -2 b). Das Vakuum Infiltration Apparatur besteht aus einem Vakuumofen bildet die Infiltration Kammer (Abb. 2f). Der Ofen ist mit einer Pumpe über ein Vakuum-Speicher verbunden. Dies reduziert den Zeitaufwand für das gewünschte Vakuum in der Infiltration Kammer zu erreichen. Pflanzen sind gesichert in einem maßgeschneiderten Halter und in einem 10 L Edelstahl Wasserbad gefüllt mit A. Tumefaciens Federung invertiert (Abbildung 2a -2 c). Vollständiges Eintauchen die oberirdischen Teile der Pflanzen ist wichtig für effiziente Infiltration. Das Wasserbad wird dann innerhalb der Infiltration Kammer platziert (Abb. 2d -2e), und das Vakuum angewendet, um die Luft aus den Zwischenräumen Blatt zu ziehen. Sobald der Druck wurde um 880 Mbar (ein Prozess, der dauert ca. 1 min) reduziert die Infiltration Kammer wird zurückgebracht schnell auf den atmosphärischen Druck über 20-30 s durch Öffnen des Einlassventils Ofen, worauf Infiltration abgeschlossen ist.

Fünf Tage nach Eindringen ist das Pflanzenmaterial bereit für die Ernte und die anschließende Extraktion und Isolierung der gewünschten Produkte. Ab diesem Zeitpunkt ist der Prozess einfach eines Naturprodukt Extraktion und Reinigung von Blattmaterial, einen Workflow, der jeder Naturprodukt Apotheke vertraut ist. Es gibt viele verschiedene Methoden für die erste Extraktion und anschliessende Reinigung15. Die am besten geeignete Wahl der Methoden und die genauen Bedingungen verwendet ist stark abhängig von der besonderen chemischen Eigenschaften der Verbindung von Interesse, neben der Verfügbarkeit von Fähigkeiten und/oder Ausrüstung. Es ist nicht möglich, in diesem Protokoll eine voll verallgemeinerbare, Schritt für Schritt Methode für die Weiterverarbeitung von geernteten Blatt Pflanzenmaterial, isoliertes Produkt enthalten, die für jedes Triterpene Produkt von Interesse Blind gefolgt werden könnte, noch wäre es sollten Sie versuchen, dies zu tun. Jedoch wird dieses Protokoll geben einen Überblick über die grundlegenden Workflow verwendet in unserem Labor und einige Methoden für die frühen Phasen des Prozesses, die nach unserer Erfahrung für die meisten sauerstoffreiches aglykon Triterpene Produkte verallgemeinerbare bewiesen haben. Dazu gehören zwei relativ seltene Techniken, nämlich unter Druck gesetzt Lösungsmittel Extraktion (SPE) und eine bequeme heterogenen Phase Methode für Chlorophyll Entfernung mit einem stark basischen Ionenaustausch-Harz.

PSE ist eine hocheffiziente Technik für die Gewinnung von kleine organische Moleküle aus festen Matrizen. Der Hauptvorteil ist die Fähigkeit, gemilderten Temperaturen zu verwenden, die das Kochen mehr als Punkt des Lösungsmittels Extraktion, Extraktionen sind unter Druck (ca. 100-200 Bar) durchgeführt. Dies reduziert erheblich die Zeit und die Menge des Lösungsmittels erforderlich, um eine vollständige Extraktion zu erreichen, im Vergleich zu anderen heiße Lösungsmittel Techniken wie einfache zurückfließt oder Soxhlet-Extraktion-16. Kommerzielle Benchtop-PSE Instrumente zur Verfügung, die austauschbar Extraktion Zellen und automatisierte Lösungsmittel Umgang mit Heizung und Überwachung nutzen. Dies macht diese Technik sehr bequem. Es ist auch wohl weniger gefährlich, besonders für Betreiber mit begrenzten praktischen Chemie Erfahrung.

Verseifung von groben Blatt-Extrakten unter Rückfluss gefolgt von flüssig/flüssig Partitionierung ist ein verbreitetes Verfahren für die Bulk-Entfernung von Chlorophylle vor nachfolgende Reinigung oder Analyse. Jedoch kann dies oft operativ in größeren Maßstäben anspruchsvoll sein. Darüber hinaus kann die Erkennung der Schnittstelle oder Produktverlust durch die Bildung von Emulsionen problematisch sein. Die Verwendung von stark basischen Ionenaustauscher heterogenen Phase Hydrolyse durchführen kann als eine bequeme Alternative dienen. Die pigmentierte Portion hydrolysiertes Chlorophyll bleibt das Harz eingehalten und kann einfach durch Filtration entfernt werden. Dieses Protokoll nutzt eine präparative Skala Anpassung einer bereits gemeldeten analytische Verfahren17 , die einem im Handel erhältlichen grundlegende Ionenaustauschharz beschäftigt.

Nachfolgend beschreiben wir eine detaillierte und schnelle Protokoll für die präparative Produktion der TRITERPENE, die Verwendung dieser pflanzlichen Plattform. Dieses Protokoll wird in unserem Labor routinemäßig verwendet, um vorzubereiten Dutzende bis Hunderte von Milligramm isolierten Triterpene Produkt für Anwendungen eine strukturelle Charakterisierung von Kernresonanzspektroskopie (NMR) und/oder weiter zu studieren in funktionalen Assays.

Protokoll

Hinweis: Machen Sie vor Anschluss an dieses Protokoll sich vertraut mit den materiellen Sicherheitsdaten für alle Stoffe verwendet, und ergreifen Sie entsprechende Sicherheitsmaßnahmen. Dazu gehören aber sind nicht beschränkt auf: Schutzbrille tragen, bei der Arbeit mit Glas unter Vakuum und Umgang mit trockenen Silica-Gel in einem Laborabzug. Es ist auch wichtig, dass lokaler Gesetzgebung bezüglich Arbeit mit transgenen Material ist geprüft und beobachtet, darunter folgende geeignete Containment-Verfahren.

1. erzeugen Sie A. Tumefaciens Stämme für Infiltration

Hinweis: Wir bieten hier eine vereinfachte Beschreibung der Schritte erforderlich, um geeignete A. Tumefaciens generieren Stämme für transiente Expression. Weitere Details dieser Schritte werden durch Sainsbury Et Al. beschrieben. 8.

  1. Verstärken durch PCR oder das Protein kodieren Region des Gens von Interesse, flankiert von 5' und 3' AttB Sequenzen geeignet für Generation ein Eintrag-Klon für den Einsatz mit einer ortsspezifische Rekombination Klonen Protokoll18,19zu synthetisieren.
    1. Forward Primer verwenden: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, rückwärts-Primer: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = Sequenz bestimmten Reihenfolge).
    2. (Vertreter) PCR-Bedingungen: Reaktion Mischung (25 µL, total), Puffer (5 X 5 µL, siehe Tabelle der Materialien), dNTPs (10 mM, 0,5 µL), Forward Primer (10 µM, 1,25 µL), rückwärts-Primer (10 µM, 1,25 µL), Template-DNA (Variable Konzentration, 50-250 ng, 0,5 µL ), DNA-Polymerase (2000 U/mL, 0,25 µL, siehe Tabelle der Materialien), Nuklease-freies Wasser (auf 25 µL). Führen Sie den Thermocycler wie folgt: erste Denaturierung (98 ° C, 30 s); Start Zyklus (98 ° C, 30 s; 45 – 72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30 s/kb) Ende Zyklus; 35 Zyklen; letzte Erweiterung (72 ° C, 10 min).
    3. Folgen einer standard ortsspezifischen Rekombination Klonen Protokoll18,19 , einen Eintrag-Klon mit jedem nicht-Kanamycin-basierten Eintrag Vektor (wir verwenden pDONR207 die im Handel erhältlich ist) zu generieren.
      Hinweis: Die Integrität des Klons Eintrag sollte bestätigt werden, durch Sequenzierung, vor der Verwendung zu generieren die pEAQ -HT-DEST1 Ausdruck Konstrukt. Die pEAQ -HT-DEST1 steht auf Anfrage aus dem Lomonossoff-Labor an der John Innes Centre in Norwich, Großbritannien.
    4. Isolieren der pEAQ -HT-DEST1 Vektor vom Ausdruck Klon erstellt Schritt 1.1.3 und bei-20 ° C vor dem in Schritt 1.3 Gebrauch aufbewahren.
      Hinweis: Jedes handelsübliche bequem Spin spaltenbasierten Plasmid Reinigung Kit zur Gewinnung von Plasmiden aus Klonen Stämme von E. Coli ist geeignet. Folgen Sie die entsprechenden Anweisungen der gewählten Plasmid Reinigung kit (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Transformation chemisch kompetente A. Tumefaciens vorbereiten.
    1. Eine selektive LB zu impfen (Luria-Bertani Medium: 10 g/L Bacto-Tryptone, 10 g/L NaCl und Hefeextrakt 5 g/L, Agar 10 g/L pH 7,0) nährbodenplatte (50 μg/mL Rifampicin, 100 μg/mL Streptomycin), von A. Tumefaciens LBA4404 aus einer Glycerin Lager Kultur Streifen. Über Nacht bei 28 ° C in einem ständigen Inkubator inkubieren.
    2. 50 mL der selektiven Flüssigmedien LB (50 μg/mL Rifampicin, 100 μg/mL Streptomycin) mit einer Stichprobe von A. Tumefaciens LBA4404 Zellen aus Schritt 1.2.1 zu impfen. Über Nacht bei 28 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min inkubieren.
    3. Die Kultur von Schritt 1.2.2 für 10 min auf Eis abgekühlt und dann pellet A. Tumefaciens Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C und 4500 X g für 5 min (verwerfen der Überstand).
    4. Aufschwemmen der Pellets aus Schritt 1.2.3 in 1 mL eiskaltes 20 mM CaCl2 Wasserlösung und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt von Schritt 1.2.3 (verwerfen der Überstand).
    5. Das Pellet aus Schritt 1.2.4 in 1 mL eiskaltes 20 mM CaCl2 Wasserlösung und aliquoten die entstandene Suspension in 50 µL Chargen aufzuwirbeln. Flash Einfrieren der Aliquote in Flüssigkeit N2 und speichern bei-80 ° C vor dem Gebrauch.
  3. Verwandeln die vorbereiteten A. Tumefaciens LBA4404 mit isolierten pEAQ -HT-DEST1 Vektor in Schritt 1.2 erzeugt.
    1. 50 µL A. Tumefaciens Aufhängung generiert in Schritt 1.2 auf Eis Auftauen und inkubieren Sie mit 100 \u2012 200 ng von isolierten pEAQ -HT-DEST1 Vektor, im Schritt 1.1, bei 0 ° C für 5 min generiert.
    2. Kälte Schock der inkubierten Suspension aus Schritt 1.3.1 in Flüssigkeit N2 für 30 s, dann auf Zimmertemperatur erwärmen lassen.
    3. Fügen Sie 200 μl SOC-Medium (SOC: 20 g/L Bacto-Tryptone, 5 g/L Hefeextrakt, 0,58 g/L NaCl, 0,19 g/L KCl, MgCl22,03 g/L, 2,46 g/L Magnesiumsulfat 7-Hydrat, 3,6 g/L Glukose) zu kalt schockiert Suspension aus Schritt 1.3.2 und 4 h bei 28 ° c inkubieren C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min.
    4. Eine selektive LB nährbodenplatte (50 μg/mL Rifampicin, 50 μg/mL Kanamycin, 100 μg/mL Streptomycin) mit der SOC-Kultur aus Schritt 1.3.3 zu impfen. Gründlich zu verbreiten, und 3 Tage bei 28 ° C in einem ständigen Inkubator inkubieren.
    5. 5 mL LB selektivmedien (50 μg/mL Rifampicin, 50 μg/mL Kanamycin, 100 μg/mL Streptomycin) mit einer einzigen Kolonie aus Schritt 1.3.4 zu impfen. Über Nacht bei 28 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min inkubieren.
    6. Fügen Sie 200 μL des Glycerins zu 1 mL der flüssigen Kultur aus Schritt 1.3.5, gut durchmischen und bei-80 ° c Lagern
      Hinweis: Diese Kultur kann für zukünftige Experimente wiederbelebt werden, durch Schlieren auf LB-Agar-Platten mit geeigneten Antibiotika (siehe unten).

2. bereiten Sie Infiltration Suspension

  1. Eine selektive LB Agarplatte mit Streifen von der gewünschten impfen A. Tumefaciens Stämme aus dem Glycerin Lager Kulturen, die in Schritt 1 generiert. Über Nacht bei 28 ° C in einem ständigen Inkubator inkubieren.
    Hinweis: Eine Sorte mit tHMGR innerhalb einer pEAQ -HT-DEST1 Vektor kann auch aufgenommen werden.
    1. Einzeln impfen Sie 50 mL LB selektivmedien mit einer Probe von jedem A. Tumefaciens Stamm in Schritt 2.1 angebaut und über Nacht bei 28 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min inkubieren.
    2. Individuell die 50 mL-Kulturen von Schritt 2.1.1 bis 1000 mL LB selektivmedien (Rifampicin 50 μg/mL, Kanamycin, 50 μg/mL Streptomycin 100 μg/mL) übertragen und über Nacht bei 28 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min inkubieren.
    3. Individuell pellet A. Tumefaciens durch Zentrifugieren (4000 X g), der flüssige Kulturen im Schritt 2.1.2 (verwerfen der Überstand) erzeugt.
    4. Individuell Aufschwemmen der Pellets aus Schritt 2.1.3 in 50 mL frisch zubereitete MMA-Puffer (MMA Puffer: 10 mM 2-(N-morpholino)-Ethanesulphonic Säure, pH-Wert 5.6 (KOH), 10 mM MgCl2, 150 μM 3' 5-Dimethoxy-4'-Acetophenon) und bei Raumtemperatur inkubieren im Dunkeln für 1 h.
    5. Kombinieren Sie das entsprechende Volumen jedes A. Tumefaciens MMA-Suspension (generierten im Schritt 2.1.4), eine endgültige OD600 von mindestens 0,2 für jede Belastung in 10 L endgültige Volumen zu produzieren.
    6. Die kombinierte Suspensionen in Schritt 2.1.5 zu einem Endvolumen von 1 L (Verwendung sofort in Schritt 3) erzeugt fügen Sie zusätzliche MMA Puffer hinzu.
      Hinweis: Es ist ratsam, eine zusätzliche 2 L Infiltration Suspension für die Aufrechterhaltung des Flüssigkeitsstand während der infiltrationsprozess vorzubereiten.
    7. Bereiten Sie 1 L 10 X Stärke MMA Puffer.

3. führen Sie Vakuum Infiltration

Hinweis: Siehe Abbildung 2 eine Beschreibung der Vakuum Infiltration Apparatebau. Verwenden Sie 5 Wochen alten N. Benthamiana Pflanzen im 9 x 9 cm Töpfe für die Schritte des Verfahrens. Sämlinge sollten im F1 Kompost (z.B. aus Levington) gesät und für 2 Wochen vor der Übermittlung an einzelnen Töpfen mit F2 Kompost gewachsen. Pflanzen sollten in einem Gewächshaus bei 25 ° C, mit 16 h pro Tag von Licht (Verwendung von ergänzenden Beleuchtung bei Bedarf), Wasser täglich, Maximaldichte von 100 Pflanzen/m2angebaut werden.

  1. Übertragen Sie die 1 L Infiltration Suspension in Schritt 2 und 1 L 10 x Stärke MMA Puffer zum Infiltration Bad, gefolgt von einer zusätzlichen 8 L Wasser erzeugt.
    1. Entfernen Sie die abnehmbaren Flügeln des maßgeschneiderten pflanzenhalter, fügen Sie 4 Pflanzen (5 Wochen alten Pflanzen siehe vorhergehenden Anmerkung) und befestigen Sie wieder die Flügel. Invertieren des Inhabers und legen auf die Infiltration Bad um die Blätter in der Infiltration Suspension zu tauchen.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Aussetzung die obere Fläche des die pflanzenhalter erreicht. Das Niveau mit dem Zusatz von zusätzlichen Infiltration Federung, bei Bedarf.
    2. Transfer der Infiltration Bad mit untergetauchten Pflanzen zur Infiltration Kammer und schließen Sie die Tür. Stellen Sie sicher, dass der Eindringling das Luft-Einlassventil geschlossen ist. Schalten Sie die Vakuumpumpe und öffnen Sie die Inline-Ventil, gefolgt von Vakuum Einlassventil auf die Infiltration Kammer Vakuum-Speicher.
    3. Sobald der Druck in der Kammer der Infiltration von 880 Mbar reduziert hat, schließen Sie das Vakuum Einlassventil und öffnen Sie das Luft-Einlassventil zu. Sobald die Infiltration Kammer auf den atmosphärischen Druck zurückgegeben hat, öffnen Sie die Tür, und entfernen Sie die Infiltration Bad.
    4. Die pflanzenhalter zu erhöhen, bis die Pflanzen nicht mehr in der Infiltration Suspension eingetaucht sind, dann schütteln die Halterung um überschüssige Aussetzung von den Blättern zurück in die Infiltration Wanne laufen lassen.
    5. Den Halter in die aufrechte Position zurück, entfernen Sie die abnehmbaren Flügeln und die Pflanzen sollten entfernt werden.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1, 3.1.5, bis die gewünschte Anzahl von Pflanzen wurden infiltriert.
    7. Autoklaven der verwendeten Infiltration Suspension vor der Entsorgung.
    8. Autoklaven die Infiltration Bad vor der Wiederverwendung in späteren Experimenten.
    9. Das Innere der Kammer Infiltration durch Reinigung mit 70 % Ethanol zu sterilisieren und an der Luft trocknen vor der Wiederverwendung in späteren Experimenten lassen.

4. die infiltrierten Pflanzen wachsen

  1. Ordnen Sie die infiltrierten Pflanzen aus Schritt 3 bei einer maximalen Dichte von 100 Pflanzen/m2 in einem Gewächshaus.
  2. Für 5 Tage bei 25 ° C und 16 h pro Tag des Lichtes (verwenden Sie zusätzliche Beleuchtung bei Bedarf) und Wasser täglich wachsen.

5. die infiltrierten Blätter ernten

  1. Nach 5 Tagen Wachstum Ernte der Blätter.
  2. Autoklaven verschwenden Pflanzenmaterial, Töpfe und des Bodens vor der Entsorgung.

6. die geernteten Blätter trocknen

Hinweis: Das unten beschriebene Verfahren genaue Lyophilisierung hängt von der Art der verfügbaren Gefriertrocknung Vorrichtung zur Verfügung.

  1. Die geernteten Blätter trocken lyophilize.
    1. Legen Sie die geernteten Blätter in einer 2 mm dicken Polypropylen-Tasche. Frieren Sie die geernteten Blätter durch die Speicherung in einer Gefriertruhe-80 ° C für 30 Minuten ein.
    2. Perforieren Sie die Tasche mit vielen kleinen Löchern, die mit einer Nadel. Ort der erlegten eingefroren verlässt in der zentralen Kammer die Gefriertrockner. Stellen Sie sicher, alle Kolben Anlage Wasserhähne geschlossen sind und schalten Sie dann den Gefriertrockner. Gewährleisten Sie der Kondensator erreicht mindestens-50 ° C und der Druck reduziert sich auf mindestens 0,15 Mbar zu, und lassen Sie über Nacht.
    3. Schalten Sie den Gefriertrockner und Entlüften Sie das Vakuum durch Öffnen einer Zapfstelle Kolben Anlage zu. Entfernen Sie die getrockneten Blätter aus der zentralen Kammer, und fahren Sie mit Schritt 7 fort.

7. unter Druck Solvent-Extraktion

Hinweis: Die Verfahren Schritte beziehen sich um eine handelsübliche PSE-Instrument zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien). Entnehmen Sie bitte den Hersteller Literatur ausführlichere Informationen zum Betrieb. Das Gerät führt 4 Extraktionen parallel.

  1. Schleifen Sie die getrockneten Blätter zu einem Kurs Pulver über eine bequeme Methode (z. B. für die meisten Triterpene Verbindungen des Interesses inländischen im blitzhacker oder manuell Zerkleinern der Blätter, während in einem Beutel enthalten).
    Hinweis: Schleifen mit einem Stößel und Mörser unter flüssigem Stickstoff ist normalerweise nicht erforderlich.
    1. Das Blatt-Pulver mit Quarzsand (0,3 \u2012 0,9 mm, 20 % vol) in einem geeigneten Behälter; Dies fungiert als Dispergiermittel und verbessert die Effizienz der Extraktion.
  2. 4 Extraktion Zellen (120 mL) für die Füllung vorbereiten. Hierzu invertieren Sie die Extraktion Zellen und einsetzen Sie Glasfaser Filter, gefolgt von der Metall Fritten und halten Stecker. Zurück die Extraktion-Zellen, die die aufrechte position und fügen Sie eine 1 cm Tiefe Schicht Quarzsand (0,3 \u2012 0,9 mm).
  3. Füllen Sie die Extraktion Zellen.
    1. Füllen Sie die Extraktion Zellen mit den vorbereiteten Blattpulver im Schritt 7.1 bis zur Füllung Linie erzeugt. Bei Bedarf komprimieren Sie sanft das Pulver während dieses Prozesses, Aufnahme einen höheren Betrag in jeder Zelle der Extraktion zu erleichtern.
    2. Fügen Sie eine kleine Schicht Quarzsand (0,3 \u2012 0,9 mm) an die Spitze der verpackte Pulver und legen Sie den oberen Zellulose-Filter.
    3. Legen Sie die gepackte Extraktion Zellen in das PSE-Gerät und führen Sie die gewünschte Methode. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen und Material; Lösungsmittel: 100 % Ethylacetat; Temperatur: 100 ° C, Druck: 130 Bar. 3 Zyklen wie folgt ausgeführt: Zyklus 1: 0 min Haltezeit, Zyklus 2 und 3: 5 min Haltezeit, enden mit einem Lösungsmittel Flush 2 min und 12 min Stickstoff gas bündig.
      Hinweis: Es ist ratsam, zuerst die Extraktionsmethode in kleinem Maßstab zu optimieren. Die folgende Methode ist jedoch oft ausreichend für die meisten oxidierte Triterpene Aglycones. Der Schnaps aus jeder Extraktion-Zelle kann in der gleichen externen Auffanggefäß durch Angabe der abwasserlinie als Extraktion Ziel, anstatt die einzelnen Standardkollektion Linien kombiniert werden. Beachten Sie, dass die Menge des verwendeten Lösungsmittels die Verpackung der Extraktion Zellen und die eingestellte Temperatur und Druck abhängig ist. Die oben beschriebene Methode erzeugt in der Regel ca. 800 mL Extraktion Schnaps für 4 parallele Extraktionen.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 7.2, 7.3.3, bis alle das Blattpulver abgearbeitet wurde.
    5. Die kombinierten Gewinnung Alkohol zu Trockenheit, über rotary Verdampfung unter Vakuum zu konzentrieren. Überprüfen Sie die erwartete Ausgabe (d.h. dunkel grün Gülle).
      Hinweis: Das genaue Verfahren variieren je nach eingestellter oben von den verfügbar drehverdampfer. Immer Schutzbrille beim Dreh Verdunstung durchführen, und überprüfen Sie Glaswaren für Schäden vor Vakuum-Bedingungen zu unterwerfen.
      1. Schalten Sie den Kühler-Recycler, und die Hitze Transfer Flüssigkeit auf mindestens 5 ° c abkühlen Schalten Sie das Wasserbad, und stellen Sie die Temperatur auf 35 ° C.
      2. Die Extraktion Schnaps auf ein verdampfungskolben übertragen (füllen Sie nicht mehr als die Hälfte des Volumens des Kolbens). Der Schnaps chargenweise zu konzentrieren (in in den gleichen Kolben) Wenn die dies übersteigt. Das Dampf-Rohr von der drehverdampfer (sicher mit einem gemeinsamen Clip) gefüllten verdampfungskolben beimessen.
      3. Passen Sie die Küvette Liftposition und Winkel, um den Boden tauchen der Verdunstung Flasche im Wasserbad bei Dritten eine ca. 45° Winkel. Starten Sie den Kolben dreht mit einer Geschwindigkeit, die beginnt, die Extraktion Schnaps an den Wänden des Kolbens zu verbreiten.
      4. Gewährleisten die Vent-Hahn geschlossen und fangen an, reduzieren Sie den Druck (mit dem Controller der Vakuumpumpe) bis moderate Tropf zwischen Kondensator und Empfänger Kolben beobachtet wird.
        Hinweis: Lassen Sie sich nicht die Extraktion Schnaps zu kochen beginnen. In diesem Fall verringern Sie die Stärke des Vakuums, die Destillation unter Kontrolle zu bringen.
      5. Überwachen Sie und passen Sie die Vakuum Stärke und Spin-Geschwindigkeit je nach Bedarf an, bis das Lösungsmittel verdampft ist.

8. Basis Ionenaustausch-Harz-Behandlung zur Entfernung der Chlorophylle

Hinweis: Die Mengen, die in den folgenden Schritten zitiert übernehmen eine ursprüngliche arbeiten Skala von 100 \u2012 150 Pflanzen. Schritt 8 ist nicht geeignet für Produkte mit Carbonsäure-Gruppen oder funktionelle Gruppen, die unter Rahmenbedingungen wie Ester hydrolysiert werden würde.

  1. Auflösen der Rohöl-Extraktes in Schritt 7 in einem minimalen Volumen Ethanol erzeugt.
  2. Zugeben Sie 50 mL Basis Ionenaustausch harzkügelchen (siehe Tabelle der Materialien) an den Ausgang des Schritt 7.1.1 und schütteln bei Raumtemperatur für 30 min.
    Hinweis: Ersetzen Sie nicht für den Einsatz von rühren Gerät schütteln. Magnetische oder mechanischen Aufwand rühren kann die Integrität der Harz Perlen beeinträchtigen. Geeignete Erregung kann auch bequem mit dem Vakuum bei atmosphärischem Druck gesetzt oder getrennt durch langsame Rotation der Reaktionskolben auf einen drehverdampfer erreicht.
  3. Fügen Sie eine zusätzliche 50 mL Basis Ionenaustausch harzkügelchen alle 30 Minuten, bis die Reaktion vollständig erloschen ist; ändert sich die grundlegende Ionenaustausch-Harz-Perlen von Rosa in Grün in der Farbe und die flüssige Phase wechselt von Grün zu Orange oder eine trübe Farbe je nach Umfang.
    1. Probieren Sie im Zweifelsfall, die die Reaktion bis zur Fertigstellung gegangen, 0,5 mL der Flüssigkeit. Filtern Sie die Probe durch eine kleine Spalte mit Kieselgur und beobachten Sie die Farbe des Filtrats; die Reaktion ist in der Regel vollständig innerhalb von 1,5 Stunden.
  4. Filtern Sie das Reaktionsgemisch durch eine kurze Säule von Kieselgur.
    1. Führen Sie die Vakuumfiltration oder über eine Glassäule, Flash-Chromatographie mit Hand-Balg, Druck auszuüben. Wenn Filtrationsrate verlangsamt, stören Sie die Spitze des Kieselgur-Pads mit einem Rührstäbchen. Das Filtrat zu sammeln.
  5. Spülen Sie die gesammelten Harze Perlen mit Ethanol, gefolgt von 1:1 Ethanol: Hexan, und schließlich Hexan. Verwenden Sie eine Spülung Volumen ausreicht, um die Perlen auf der Oberseite der Spalte Kieselgur Aufschwemmen.
  6. Kombinieren Sie das Filtrat aus Schritt 8,4 und Spülungen aus Schritt 8,5 und konzentrieren Sie, Trockenheit von rotary Verdampfung unter Vakuum.

9. erste grobe Fraktionierung

Hinweis: Die folgende Methode eignet sich in der Regel für typische oxidierte Triterpene Aglycones und automatisierte Flash-Chromatographie Instrument beschäftigt. Des Herstellers Literatur für weitere Details zur Bedienung finden Sie unter.

  1. Das Rohprodukt in Schritt 8 auf Flash-Grade Kieselgel generierten adsorbieren (Porengröße: 60 Å, Partikelgröße: 35 \u2012 75 μm) für die Anwendung auf eine Flash-Chromatographie-Patrone über trockene laden Methodik.
    1. Lösen Sie das Rohprodukt generiert in Schritt 8 in einem minimalen Volumen der organischen Lösungsmittel auf. Komplette Auflösung zu gewährleisten.
      Hinweis: Dichlormethan unter Zugabe von ein paar Tropfen von Methanol ist in der Regel eine geeignete Wahl des Lösungsmittels.
    2. Top 100 g vorgefüllten Flash-Chromatographie Kartusche abschrauben (siehe Tabelle der Materialien) und entfernen Sie das Einfügen, um den trockenen Kopf Laderaum zu offenbaren. Verwenden Sie den Kopfraum, um das entsprechende Volumen der Silica-Gel für trockene laden zu messen.
    3. Übertragen Sie das gemessene Volumen des Silica-Gel für trockene laden zur Lösung der Rohprodukt, dann entfernen Sie das Lösungsmittel durch rotary Verdampfung unter Vakuum.
      Hinweis: Das Silica-Gel sollte ein rieselfähiges Pulver wiederhergestellt. Gegen Ende der Verdunstung Prozess sanfte Kratzen muss gegebenenfalls die Silica-Gel von der Seite der verdampfungskolben frei.
    4. 100 g Flash-Chromatographie Patrone mit 100 mL/min mit mindestens 5 Spalte Volumen von 100 % Hexan, sondern im Idealfall Equilibrate, bis die Patrone Inhalt vollständig und gleichmäßig benetzt ist.
    5. Übertragen Sie die vorbereiteten trockenen laden Silica-Gel erzeugt im Schritt 9.1.3 zu den trockenen Kopf Laderaum der äquilibriert 100 g Flash-Chromatographie Patrone, Gießen. Federung in Hexan und einem breiten Mund Pipette kann verwendet werden, um Übertragung der alle verbleibenden trocken laden Silica-Gel zu unterstützen.
    6. Nassen übertragenen trocken laden Silica-Gel-Bett mit 100 % Hexan, Luft aus der trockenen laden Headspace entfernen.
    7. Führen Sie die folgende Methode der Chromatographie: Lösungsmittel [A]: Hexan, Lösungsmittel [B]: Ethylacetat, Durchfluss: 100 mL/min, Steigung: 0 % [B] bis 100 % [B] mehr als 3000 mL, Sammlung: sammeln Sie alle, Bruchteil Größe: 250 mL.
    8. Analysieren Sie die Brüche von Dünnschicht-Chromatographie (TLC)8 oder Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)8und Konzentration zu Trockenheit der Fraktion(en) mit der Verbindung von Interesse über rotary Verdampfung unter Vakuum.
  2. Durchführen Sie nachgeschalteten feine Reinigung, bis das gewünschte Maß an Reinheit erreicht ist.
    Hinweis: Nachgeschalteten feine Reinigung ist völlig zusammengesetzte spezifisch und es ist nicht möglich, standardisierte Schritte bieten (siehe Diskussion).

Ergebnisse

Typische isoliert Erträge sind abhängig von der Enzym/Enzym-Kombination unter Untersuchung, die chemische Stabilität der Ziel-Verbindung und wie anspruchsvoll der Reinigungsprozess war. Wir haben bereits berichtet, isolierten Ausbeute an β-Amyrin Derivate aus unserer kombinatorische Biosynthese-Experimente von 0,12 bis hin zu 3,87 mg pro Gramm trocken N. Benthamiana Blattpulver. Diese Verbindungen reichten weit in die Ebene der Oxidation und unnatürliche Kombinationen von Enzymen (Abbildung 3)8enthalten. Dieses Protokoll ist in unserem Labor routinemäßig, um Dutzende oder Hunderte von Milligramm gereinigten Produktes für strukturelle Charakterisierung zu produzieren durch NMR-Spektroskopie und nachgelagerten funktionelle Assays. Wir haben auch den präparativen nutzen diese Plattform gezeigt, durch die Herstellung von 0,8 g Triterpene Gerüst β-Amyrin in einer Reinheit von mehr als 98 %. Dieses Experiment 459 Pflanzen verwendet, und stellt eine isolierte Rendite von 3,3 mg pro Gramm des trocken N. Benthamiana Blatt Pulver8.

figure-results-1
Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung. Schematische Darstellung des Prozesses nutzen transiente Expression von biosynthetischen Enzymen in N. Benthamiana Blatt, endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene in Richtung der präparativen Herstellung von hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-2
Abbildung 2: Vakuum Infiltrator Konstruktion und Prozess. ein) Maßgeschneiderte Anlage Inhaber eines Flügels abgetrennt. b) Bespoke Pflanze Halter Flügel befestigt. ( c) Inversion und Eintauchen der Pflanzen. d) Einfügung des Bades Infiltration. e) Infiltration Bad im Ort innerhalb der Kammer eindringen. f) Complete Vakuum Infiltrator: (1) Vakuumpumpe (2) Verbindung von Vakuumpumpe Vakuum-Speicher (3) Vakuum-Behälter-Absperrventil (4) Verbindung zwischen Vakuum-Speicher und die Infiltration Kammer (5) Manometer (6) Luft Einlassventil (7) Infiltration (8) Kammer Vakuum Reservoir. g) Vertreter verlässt nach fünf Tagen Post-Infiltration Wachstum von einer Pflanze mit einem Ausdruck Konstrukt für grün fluoreszierendes Protein (GFP) infiltriert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-3
Abbildung 3: bereits berichtet repräsentative Ergebnisse für die präparative Herstellung von β-Amyrin-Derivaten, die mit diesem Protokoll8. Diese Tabelle ist durch isolierte Erträge bestellt. Spalten werden mit Ampelfarben relativen Wert bedingt formatiert. Rot = hoch, grün = niedrig (obwohl mittlere gelb). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Hoher Durchsatz Vakuum Infiltration kann dieses Protokoll regelmäßig in unserem Labor für die präparative Herstellung von Triterpene Verbindungen des Interesses für verschiedene downstream-Anwendungen verwendet werden. Die hier beschriebenen Vakuum Infiltration Apparat ist leicht repliziert. Zugabe von Vakuum-Speicher ist ratsam, verringern den Zeitaufwand für das notwendige Vakuum ziehen, aber es ist möglich, eine unveränderte Vakuumofen als die Infiltration Kammer einfach wiederverwenden. Zum Schutz der Vakuumpumpe durch Zusatz eines geeigneten Kondensators ist theoretisch sinnvoll, aber in unserem Labor haben wir gefunden, dass dies für unnötig.

Infiltration-Abdeckung ist gefährdet, wenn die Blätter nicht vollständig in der Infiltration Suspension eingetaucht sind. Dieses Problem wird minimiert, indem sichergestellt wird, dass die obere Fläche der pflanzenhalter erreicht das Niveau der Suspension, und dass der pflanzenhalter einen festen Sitz für die Infiltration Bad. Beachten Sie aus Abbildung 2 , dass die obere Fläche der pflanzenhalter in dem Infiltration Bad im Ort eingelassen ist. Dies wird Panels auf die mittleren Kanten des Inhabers bilden den Ankerpunkt am oberen Rand der Infiltration Bad. Die Infiltration Aussetzung erfordert regelmäßige Ergänzungen um die Suspendierung aufrechtzuerhalten. Dies geschieht am besten durch Zugabe von überschüssigen Infiltration Aussetzung, schrittweise Verringerung des OD600 im Laufe einer großen diskontinuierlichen eindringen zu verhindern. Jedoch in unseren Händen scheint Ersatz für Wasser nicht haben eine spürbare Wirkung auf die zu erwartenden Erträge im präparativen Maßstab, obwohl dies nicht quantitativ untersucht wurde. Wie viele Pflanzen aus einer Charge von Infiltration Aussetzung infiltriert werden können, ist noch offen. Wir routinemäßig zwischen 100 und 200 Pflanzen mit einem Batch von Infiltration Aussetzung zu infiltrieren. Darüber hinaus ist es normal, dass etwas Erde in die Infiltration Suspension im Laufe der infiltrationsprozess Leach. Dies wurde nicht gefunden, um eine spürbare Wirkung auf Infiltration Wirksamkeit zu haben.

Während der Ernte ist es ratsam (aber nicht kritisch), nur die Blätter zu ernten, die infiltriert wurden (einige Blätter wachsen nach dem Eindringen). Selektiver Lese verhindert Verdünnung mit unproduktiven Gewebe, die sonst das Verhältnis von endogenen Verunreinigungen im Verhältnis zu der Verbindung von Interesse erhöhen würde. Dies hat einen nominalen Einfluss auf die Leichtigkeit der nachgeschalteten Reinigung und erhöht das Ausmaß dieser Prozesse. Wenn Sie tHMGR verwenden, um Vorläufer Versorgung zu steigern, wird ein necrosed Phänotyp häufig beobachtet, über die Post-Infiltration Wachstumsphase zu entwickeln. Dies ist normal und eigentlich unterstützt selektive Lese und den nachgeschalteten Trocknungsprozess. Das getrocknete Blattpulver kann in der Regel in einem verschlossenen Behälter an einem kühlen, trockenen und dunklen Ort, sondern im Idealfall in einem Exsikkator unter Vakuum gespeichert werden. Dies hängt von der Stabilität der Verbindung von Interesse. Seien Sie vorsichtig, wenn die Wahl in einem-80 ° C Gefrierschrank zu speichern. Sicherstellen, dass die getrockneten Blätter werden in einem wasserdichten Behälter und auf Entfernung aus dem Speicher, ermöglichen diese Container auf Raumtemperatur vor Eröffnung. Nichtbeachtung führt Wiedervernässung der Blätter, Down-Stream-Verarbeitung zu behindern.

Die Schritte nach der Ernte in diesem Protokoll sind für illustrative Zwecke zur Verfügung gestellt und zur Unterstützung jener Forscher, die praktische Chemie begrenzt haben können erleben. Sie können für viele andere Naturprodukt Extraktion/Reinigung Techniken ersetzt werden. Wie in der Einleitung PSE hat viele Vorteile, aber die Kapitalkosten der im Handel erhältlichen PSE-Gerät möglicherweise unerschwinglich und es ist nicht wichtig. Grundlegende Ionenaustausch-Harz-Behandlung ist eine sehr bequeme Methode, traditionelle Verseifung gefolgt von flüssig/flüssig Partitionierung zu ersetzen. Es ist jedoch nicht geeignet für Produkte mit Carbonsäure oder funktionelle Gruppen, die unter Rahmenbedingungen, wie z. B. Ester hydrolysiert werden würde. Diese Produkte dürften auf die grundlegenden Ionenaustauschharz beibehalten werden. Allerdings gibt es potenziellen nutzen dies für eine Aufnahme und Verfahren (hier nicht dokumentiert). Wo traditionelle Verseifung angemessen wäre, dient grundlegende Ionenaustausch-Harz-Behandlung als eine bequeme Alternative. Die beschriebene in Schritt 9, Chromatographie-Methode worden für die Verbindungen, die in Abbildung 3beschriebenen verallgemeinerbare sein gefunden. Verbindungen der erhöhte Polarität können jedoch 100 % Ethylacetat Elution längere erforderlich. Mit Bezug auf Schritt 9.2 nachgeschaltete feine Reinigung ist völlig zusammengesetzte spezifisch und ist auch abhängig von Skala. Wiederholte Runden der kleineren Flash-Chromatographie mit optimierten Steigungen, ist in der Regel ausreichend, um eine Reinheit für NMR-Analyse zu erreichen. In größeren Maßstäben ist Kristallisation oft eine günstige Alternative. In schwierigen Fällen kann abhängig von der gewünschten Menge des isolierten Verbindung präparative oder semi-präparative Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt werden. An anderer Stelle finden Sie einige Beispiele für nachgeschaltete Reinigungsverfahren für eine Reihe von repräsentativen Verbindungen8.

Das aktuelle Protokoll wie hier vorgestellt, wird in unserem Labor routinemäßig verwendet, und Dienstprogramm bewährt hat. Allerdings gibt es noch genügend Spielraum für eine weitere Optimierung der Ausdruck Plattform. In unserem Labor zu untersuchen, wie weitere Weg-Technik wird derzeit gearbeitet und differenzierte Steuerung der Ausdruck proteingehalte könnten Triterpene Produktion weiter, während der Vermittlung Toxizität für Wirtszellen verbessern. Es gibt auch Potenzial zu untersuchen, die Manipulation der intrazellulären Transport Systeme20,21und die Richtung von Enzymen zu verschiedenen zellulären Kompartimenten22,23, Alleen, die verbessert werden könnte die Effizienz der mehrere Oxidation Ereignisse. Nutzenpotenziale für das Ändern der zugrunde liegenden Morphologie der wichtigsten Organellen könnte auch geprüft werden. Zum Beispiel wurde Überexpression des Geschäftsfeldes Membran von Arabidopsis Thaliana HMGR beobachtet, Hypertrophie der dem endoplasmatischen Retikulum in Pflanzen24induzieren; eine wichtige Seite für CYP450-Aktivität. Dieses Protokoll eignet sich ideal für die Herstellung von Milligramm, Gramm-Mengen Triterpene Produkte und kann inmitten der Forschung eingesetzt werden, um Verbindungen für nachgeschaltete Studie (z. B. der systematischen Erforschung von Struktur-Aktivitäts zugreifen Beziehungen und Voruntersuchungen in die pharmakodynamische und Pharmakokinetische Eigenschaften von Bleiverbindungen von klinischen Interesse). Aber die Plattform ist linear zuverlässig skalierbar einfach durch eine Erhöhung der Anzahl der verwendeten Pflanzen und die Praktikabilität der transienten Expression über Agroinfiltration nachgewiesen und im industriellen Maßstab für die Herstellung von Pharmaproteinen 14, so besteht für diese Plattform für kommerzielle Produktion von qualitativ hochwertigen TRITERPENE erweitert werden. Alternativ ist es auch möglich, die Herstellung von stabilen transformanten tragen die abgeschlossene Wunsch multigene biosynthetische Bahn, so dass die Masse Anbau vorstellen und weitere "farming" von transgenen N. Benthamiana Stämme Herstellung von verschiedenen Verbindungen von kommerziellen Wert.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit von einem Norwich Research Park Zugehörigkeit (JR) unterstützt wurde, gewähren die gemeinsame Entwicklung und Physical Sciences Research Council/biotechnologisch und biologische Wissenschaften Research Council BBSRC finanziert OpenPlant synthetische Biologie Forschungszentrum (BB / L014130/1) (M.J.S., U.A.); ein John Innes Centre Wissensaustausch und Vermarktung gewähren (BB/KEC1740/1) (b.b.); und die BBSRC Institut Strategieprogramm Grant "Moleküle aus der Natur" (BB/P012523/1) und John Innes Foundation (U.A.). Wir möchten danken George Lomonossoff für die Bereitstellung der pEAQ-Vektoren und Andrew Davis für die Fotografie.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GC-MS-Gerätbeliebign/a
Thermocycler geeignet für PCR-Reaktionenbeliebign/a
Gelelektrophoresegerätbeliebign/a
Mikropipetten mit einstellbarer Luftverdrängung (Größen : 1000 & Mikro; L, 200 & Mikro; L, 100 &Mikro; L, 20 & Mikro; L, 10 & Mikro; L und 2 µ L )beliebign/a
Flüssigstickstoffträger mit breitem Oberteil (Größe: 2 l)beliebign/a
Tisch-Mikrozentrifuge (Kapazität: 24 x 1,5/2 ml, max. Drehzahl: =/> 15000 U/min)beliebign/a
Tischzentrifuge (Kapazität: 20 x 50 ml, max. Drehzahl: =/> 4000 U/min)beliebign/a
Große bodenstehende Zentrifuge (Kapazität: 4 x 1 l, max. Drehzahl: =/> 4000 U/min)beliebig/a
Stehender Inkubatorbeliebign/a
Schüttelbrutschrank (Flaschenklemmengrößen: 10 mL, 50 mL, 2 L)beliebign/a
Zentrifugenflaschen (1 L)beliebign/a
Vakuuminfiltrationsapparatnach Maßn/a
9 x 9 cm Pflanztöpfebeliebign/a
Gefriertrocknungsgerät (=/> 8 Liter Kondensatorkapazität)beliebign/a
Büchi SpeedExtractor 914 mit 120 mL Extraktionszellen (PSE-Instrument)BüchiSpeedExtractor E-914
Rotationsverdampferapparatbeliebign/a
Verdampferkolben (Größen: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)beliebign/a
Duran Flaschen (Größen: 1 L, 10 L)beliebign/ a
Konuskolben (Größen 100 mL, 2 L)beliebign/a
Spatel (verschiedene Größen)beliebign/a
Analysenwaage (5 Ziffern)beliebign/a
Waage (2 Ziffern)beliebign/a
Messzylinder (10 mL, 100 mL, 1 L)beliebign/a
A -80 Gefrierschrankbeliebign/a
Biotage Isolera Gerät mit 250 mL Entnahmegestell und Flaschen (automatisiertes Flash-Chromatographie-GerätBiotageISO-1EW
Schutzbrillebeliebign/a
Laborkittelbeliebign/a
Autoklavbeliebign/a
Verbrauchsmaterialien
Mikropipettenspitzen (Größen : 1000 & micro; L, 200 & Mikro; L, 100 &Mikro; L, 20 & Mikro; L, 10 & Mikro; L und 2 µ L )beliebign/a
Mikrozentrifugenröhrchen (Größe: 2 mL)beliebign/a
Zentrifugenröhrchen (Größen: 15 mL, 50 mL)beliebign/a
Einweg-Transferpipetten (Größe 2 mL)beliebign/a
Petrischalen (Größe: 100 mL)beliebign/a
Biotage® SNAP KP-SIL 100 g Flash KartuschenBiotageFSK0-1107-0100
HPLC Fläschchen (1 mL), Fläschcheneinsätze und Verschlüssebeliebign/a
Einweg lila Nitril Handschuhebeliebign/a
Oberfilter für E-914, ZelluloseBüchi51249
Bodenfilter für E-916 / 914, GlasfaserBüchi11055932
Reagenzien
Quarzsand, 0,3 - 0,9 mmBüchi37689
Celite 545 (Kieselgur)Simga-Alrich22140-1KG-F
Kieselgel 60 (0,040 -0,0063 mm)Merck1,09385,5000
2-(N-Morpholino)-EthansulfonsäureMelfordB2002
MgCl2 Simga-Alrich208337-100G
KOHSimga-Alrich60377-1KG
3' 5'-Dimethoxy-4'-acetophenon (Acetosyringon)Simga-AlrichD134406-1G
RifampicinAlfa AesarJ60836
KanamycinsulfatGibco11815-032
StreptomycinSimga-AlrichS6501-100G
GentamycinMP biomedizinisch190057
Agarose LE GelMelfordMB1203
LB Bouillon MillarSimga-AlrichL3522-250G
AgarSimga-AlrichA5306-250G
NaClSimga-AlrichS5886-500G
KClSimga-AlrichP9541-500G
MgSO4.7H2O Sigma-AlrichM2773-500G
GlukoseSigma-AlrichG7021-100G
Ambersep®   900 hydroxid (basisches Ionenaustauscherharz)Sigma-Alrich06476-1KG
HexanFisherH/0406/PB17
EthylacetatFisherE/0900/PB17
DichlormethanFisherD/1852/PB17
MethanolFisherM/4056/PB17
EthidiumbromidSigma-AlrichE7637-1G
EthanolVWR20821-330
Milli-Q Wasserbeliebign/a
Levington F1 Kompostbeliebign/a
Levington F2 Compostbeliebign/a
QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid-Reinigungskit).Qiagen27104
NEB 5-alpha Kompetenter E. coliLieferant New England Biolabs LtdC2987I
pEAQ-HT-DEST1 VektorLomonossoff Labor John Innes Centern/a
pDONR207Thermo-FisherpDONR207
A. tumefaciens LBA4404Thermo-Fisher18313015
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (ortsspezifisches Rekombinationsklonierungsprotokoll)Thermo-Fisher11791020
GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (ortsspezifisches Rekombinationsklonierungsprotokoll)Thermo-Fisher11789020
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIXPromega UK LtdM7822
PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASENew England Biolabs LtdM0530S
dNTP SET 100mmThermo-Fisher10297018
RNEASY PLANT MINI KITQiagen Ltd74904
RQ1 RNASE-FREE DNASEPromega UK LtdM6101
Invitrogen SuperScript III Erststrang-SynthesesystemFisher10308632
TrytoneSigma-AlrichT7293-250G
Nicotiana Benthamiana SeedsJeder seriöse LieferantN/A
n

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