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Methodenartikel

Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen

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DOI:

10.3791/58176

⸱

24. August 2018

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 2Department of Bioengineering, Jonsson Comprehensive Cancer Center, Broad Stem Cell Research Center, Brain Research Institute, University of California, Los Angeles

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für dreidimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen innerhalb orthogonal abstimmbaren Biomaterialien entwickelt, um das Gehirn-Matrix zu imitieren. Dieser Ansatz bietet eine in Vitro, experimentelle Plattform, die viele Eigenschaften von in Vivo Glioblastom-Zellen in der Regel in Kultur verloren beibehält.

Zusammenfassung

Glioblastom (GBM) ist die häufigste, aber tödlichsten, Zentralnervensystem Krebs. In den letzten Jahren haben viele Studien fokussiert wie die extrazelluläre Matrix (ECM) der einzigartigen Gehirn Umwelt, wie Hyaluronsäure (HA), GBM fortschreiten und Invasion erleichtert. Jedoch enthalten die meisten in-vitro- Kultur Modelle GBM-Zellen außerhalb des Kontexts von ECM. Murine Xenotransplantate von GBM-Zellen werden häufig auch verwendet. In Vivo Modellen erschweren jedoch die Beiträge der einzelnen Merkmale des komplexen Tumor Mikroumgebung Tumor Verhalten zu isolieren. Hier beschreiben wir eine HA Hydrogel-basierte, dreidimensionale (3D) Kultur-Plattform, die Forscher zu HA-Konzentration und Steifigkeit unabhängig voneinander verändern können. Hohes Molekulargewicht HA und Polyethylenglykol (PEG) umfassen Hydrogele, die vernetzt über Michael-Type-Zusatz im Beisein von lebenden Zellen sind. 3D Hydrogel Kulturen des Patienten abgeleitet GBM Zellen Ausstellung Lebensfähigkeit und Verbreitung Preise so gut wie oder besser als, wenn kultiviert als standard Gliomaspheres. Die Hydrogel-System ermöglicht auch eine Einbindung von ECM-mimetischen Peptiden, Auswirkungen von bestimmten Zelle-ECM-Interaktionen zu isolieren. Hydrogele sind optisch transparent, so dass lebende Zellen in 3D Culture abgebildet werden können. Zu guter Letzt sind HA Hydrogel Kulturen kompatibel mit Standardtechniken für Molekulare und zelluläre Analysen, einschließlich PCR, Western blotting und Kryoschneiden gefolgt von Immunfluoreszenz-Färbung.

Einleitung

Dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme rekapitulieren Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) in nativen Gewebe besser als ihre zweidimensionale (2D) Pendants1,2. Fortschritte in der Gewebetechnik haben anspruchsvolle, 3D Kultur-Plattformen, die kontrollierte Untersuchungen (1) wie chemische und physikalische Komponenten der Matrix Mikroumgebung beeinflussen Zelle Verhaltensweisen und (2) die Wirksamkeit der neue ermöglichen ergab therapeutische Strategien für eine Reihe von Krankheiten, einschließlich Krebs2. Während in-vitro- Modelle können nicht systemische Faktoren, wie z. B. Hormon- und Immunsystem Signale entfallen und können somit in Vivo Modellen nicht vollständig ersetzen, bieten sie einige Vorteile einschließlich der Reproduzierbarkeit, experimentelle Kontrolle, Erschwinglichkeit und Geschwindigkeit. Hier beschreiben wir die Verwendung von Gehirn-mimetischen Hydrogele in welchen, die 3D Kulturen des Patienten abgeleitet Gehirn Tumorzellen viele Aspekte der Tumor Physiologie, insbesondere die Dynamik des Erwerbs von Behandlung Resistance3erfassen. Im Vergleich zu anderen in-vitro- Methoden, repräsentieren diese Kulturen besser in Vivo Tumormodellen und klinischen Beobachtungen3.

Glioblastom (GBM) ist der häufigste und tödlichen Krebs mit Ursprung im Gehirn, mit eine mediane Überlebenszeit von nur 1-2 Jahre-4,-5. In den letzten Jahren haben viele Studien über den Einfluss der Tumor Matrix Umwelt im GBM6,7,8konzentriert. Das einmalige Gehirn ECM wurde berichtet, dass GBM Zellwanderung, Verbreitung und therapeutischen Widerstand6,7,8,9,10,11 beeinflussen , 12. Hyaluronsäure (HA) ist ein reichlich Glykosaminoglykan (GAG) im Gehirn, wo es interagiert mit anderen GAGs und Proteoglykane eine Hydrogel-wie zu bilden mesh-13. Viele Studien haben berichtet, HA-Überexpression in GBM Tumoren und seine Folgewirkungen auf Krebs Fortschreiten8,9,13,14,15,16 ,17. Anderen ECM-Komponenten wirken sich auch GBM Tumor Wachstum und Invasion6,7,15,18. Z. B. Fibronektin und Vitronectin, die in der Regel bei Glioblastom überexprimiert sind, Heterodimerization der Zell-Oberfläche Integrin-Rezeptoren durch Bindung an die "RGD" Sequenz zu induzieren und initiieren komplexe signaltechnische Kaskaden, die Förderung der Tumor überleben19 ,20,21. Neben biochemischen Einflüssen physikalische Eigenschaften der Gewebe Matrix wirken sich auch GBM Fortschreiten22,23.

Kontinuierliche Übernahme des Widerstands zu Therapien ist einer der Haupttreiber der GBM Letalität4. Medikamente mit vielversprechenden Ergebnissen in 2D- oder Gliomasphere Modelle haben versagt, in nachfolgenden tierexperimentellen Studien und klinische Fälle3, darauf hinweist, dass die Auswirkungen von microenvironmental Faktoren wesentlich zur GBM Tumor Antwort1beigetragen. Während Tiermodelle eine 3D bereitstellen können, physiologisch angemessen Sie Mikroumgebung, xenografted patientenzellen und generieren klinisch relevante Ergebnisse24,25, die Komplexität des Gehirns Mikroumgebung in Vivo zu macht es schwierig um zu bestimmen, welche Features, einschließlich der Zelle-Matrix Interaktionen, Schlüssel zu bestimmten biologischen Ergebnisse sind. Identifizierung von neuen therapeutischen Ziele profitieren von der Verwendung von vereinfachten Kultur Plattformen in der biochemische und biophysikalische Eigenschaften definiert sind.

Im Gegensatz zu bereits gemeldeten Biomaterial-Modellen der GBM Tumor Mikroumgebung26,27 die wahre orthogonal Kontrolle über individuellen biochemischen und physikalischen Eigenschaften der ECM, die Biomaterial-Plattform noch nicht erreicht haben berichtet hier ermöglicht die Entkopplung der Beiträge von mehreren unabhängigen Funktionen, GBM Zelle Phänotyp. Hier präsentieren wir Ihnen ein HA-basierten, Orthogonal abstimmbaren Hydrogel-System für 3D Culture von GBM-Zellen Patienten abgeleitet. Hydrogele sind aus zwei Polymerkomponenten gebildet: 1) biologisch aktive HA und 2) biologisch inert Polyethylenglykol (PEG). PEG ist ein weit verbreitetes biokompatibel und hydrophilen Material mit niedrigem Eiweißgehalt Adsorption und minimalen Immunogenität28. Hier sind etwa 5 % der glucuron-Säure Moieties auf HA-Ketten mit Thiol-Gruppen ermöglichen Vernetzung zu einer handelsüblichen 4-Arm-Koppelung mit Maleimides über Michael-Type-Zusatz beendet funktionalisiert. In seiner häufigsten Form im Körper existiert HA in hohem Molekulargewicht (HMW) Ketten. Hier hilft ein geringer Grad der Modifizierung der HMW HA (500-750 kDa), um native Interaktionen von HA und die Zell-Rezeptoren, einschließlich CD4429zu bewahren. Mit der Substitution von PEG-Thiol für HA-Thiol unter Beibehaltung einer Konstanten Molverhältnis von insgesamt Thiole, Maleimides, kann HA-Konzentration von mechanischen Eigenschaften des resultierenden Hydrogele entkoppelt werden. Darüber hinaus können stöchiometrischen Steuerelemente zu Cystein-terminierte Peptide auf eine definierte durchschnittliche Maleimide-terminierte Arme auf jeder 4-Arm-PEG-Konjugat verwendet werden. Einbeziehung der ECM-abgeleitet, selbstklebende Peptide kann Interaktionen mit Integrine auf kultivierten Zellen, durch die biochemische und chemische Signale ausgestrahlt1sind. Maleimide-Thiol-Zusatz erfolgt sehr schnell unter physiologischen Bedingungen, minimieren den Zeitaufwand für Zelle Kapselung und Maximierung Überleben der Patienten gewonnenen Zellen. Darüber hinaus Hydrogel Kulturen wie typische Gewebeprobe behandelt werden können und sind kompatibel mit standard Charakterisierung Techniken einschließlich Western blotting, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz-Färbung. Das folgende Protokoll beschreibt die Verfahren zur Herstellung von Hydrogele, 3D Kulturen von GBM-Zellen Patienten abgeleitet und Techniken für die biochemische Analyse zu etablieren.

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Protokoll

Alle menschlichen Gewebe Sammlung Schritte wurden unter institutionell zugelassenen Protokolle durchgeführt.

1. Thiolation von Hyaluronsäure

Hinweis: Molare Verhältnis sind in Bezug auf die Gesamtzahl der carboxylat-Gruppen angegeben, sofern nicht anders angegeben.

  1. Lösen Sie 500 mg Natrium Hyaloronsäure (HA, 500-750 kDa auf) bei 10 mg/mL destilliertem, entionisiertem Wasser (DiH2O) im Autoklav sterilisiert, 250-mL-Erlenmeyerkolben. Rühren Sie die Lösung (~ 200 u/min) bei Raumtemperatur für 2 Stunden, um vollständig HA zu lösen. Verwenden Sie Stir Bar und magnetische rühren Platte weiterhin Reaktion rühren während Thiolation Verfahren.
  2. Mit 0,1 M Salzsäure (HCl), stellen Sie den pH-Wert der Lösung bis 5,5 HA. 69,6 mg (0,25 x Molverhältnis) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC) abwiegen.
    Hinweis: Obwohl unaufgelöste EDC direkt an der HA-Lösung hinzugefügt werden kann, ist es in der Regel einfacher, EDC zunächst in 1 mL der DiH2O auflösen und dann schnell die EDC-Lösung zu den HA-Lösung hinzufügen. Pre-Auflösung in 1 mL DiH2O auch mit N-Hydroxysuccinimide (NHS) und Cystamine Dihydrocholoride erfolgt vor dem Hinzufügen der Reaktion in Schritten 1.3 und 1.4.
  3. Hinzu kommt die Reaktion 17,9 mg (0,125 x Molverhältnis) des NHS. Stellen Sie den pH-Wert der Reaktionslösung auf 5.5 mit 0,1 M HCl und inkubieren Sie die Reaktion für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
  4. Fügen Sie 70,0 mg (0,25 x Molverhältnis) Cystamine Dihydrochloride in der Reaktionslösung. Verwenden Sie 0, 1 M Natronlauge (NaOH) um pH bis 6,25 anzupassen. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren.
  5. Am nächsten Tag verwenden Sie 1 M NaOH zur Einstellung des pH-Wertes der Reaktionslösung auf rund 8. Hinzu kommt die Reaktion 192 mg (4 x Molverhältnis) Dithiothreitol (DTT). Passen Sie den pH-Wert wieder auf 8 nach Zugabe von DVB-t und verlassen Sie rühren für ca. 1-2 Stunden bei Raumtemperatur zu.
  6. Verwenden Sie 1 M HCl pH bis 4 einstellen. Das gesamte Reaktionsgemisch in eingeweichter Dialysemembran (Molekulargewicht Cut-off um 13 kDa) und Dialyse gegen DiH2O voreingestellt auf pH 4.
    Hinweis: Das Laufwerk DiH2O für Dialyse sollte mindestens 40-Mal das Volumen der reagierte HA-Lösung (z. B. 50 mL Probe in 2 L des DiH2O, pH 4).
  7. Ersetzen Sie die Dialyselösung (DiH2O, pH 4) zweimal täglich für 3 Tage bei Raumtemperatur.
  8. Filtern Sie die dialysierten Lösung durch eine Membran 0,22 µm, Vakuum-gesteuerte Filter. Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff Lösung von Thiolated HA. Verwenden Sie ein Gefriertrockner, um trockene Proben über 2 Tage einfrieren. Thiolated HA in trockenform können in einer vakuumdichten Exsikkator bei-20 ° C für mindestens 6 Monate gespeichert werden.
  9. Um den Grad der Thiolation zu ermitteln, verwenden Sie Ellman Test bzw. Proton NMR Spektroskopie30,31.

2. Vorbereitung der Vernetzungsgrad Materialien

  1. Lösen Sie Thiolated HA auf die gewünschte Konzentration (in diesem Beispiel 13,3 mg/mL) in HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (20 mM HEPES Hank es ausgewogene Salz Saline (HBSS) Puffer, so angepasst, dass in einem pH-Wert von 8 bis 9 fallen auf) in eine bernsteinfarbene Durchstechflasche zu minimieren Umgebungslicht. Halten Sie die Lösung unter ständigem Rühren.
    Hinweis: Bildung von Disulfid-Bindungen zwischen Thiole konjugiert, HA kann auftreten, wenn der pH-Wert über 8, Lösungskonzentration zu hoch ist oder die Lösung bleibt auch lange vorher Gelierung rühren. Um dieses Problem zu vermeiden, verwenden Sie unterhalb von 15 mg/mL von Thiolated HA und Auflösen von Thiolated HA innerhalb von 2 Stunden Hydrogele zu bilden.
  2. Lösen sich 4-Arm-PEG-Maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) und 4-Arm-PEG-Thiol (PEG-Thiol, 20 kDa) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, 50 mg/mL PEG-Mal und PEG-Thiol Stammlösungen vorzubereiten.
    Hinweis: Es dauert mindestens 1 Stunde, PEG Reagenzien vollständig aufzulösen.
  3. Wenn ECM-abgeleitete Peptide hinzufügen, lösen Sie Cystein-haltiger Peptide in PBS eine Stammlösung vorbereiten auf.
    Hinweis: Verwenden Sie eine Lager Konzentration von 2-4 mM.
  4. Silikon-Kautschuk-Einweichen formt in Ethanol für mindestens 20 min, reinigen Sie und dann Autoklav für die Sterilisation.

3. Hydrogel Vernetzung und Zelle Kapselung

Hinweis: als Beispiel hier ist die Kapselung der vier einzelnen, 80 µL Hydrogele mit 0,5 % (w/V) HA und Druckfestigkeit Elastizitätsmodul von 1 kPa beschrieben3. Siehe Tabelle 1 für Beispiel Rezepte, die Hydrogele mit unterschiedlichen Eigenschaften ergeben: zwei Hydrogele unter Einbeziehung der Integrin-Bindung-Peptid RGD und zwei Hydrogele mit Cystein Kappen als Negativkontrolle für Peptid-Aktivität. Seeding Konzentration des Patienten abgeleitet GBM-Zellen wird 500.000 Zellen/mL.

  1. Verdünnen Sie PEG-Mal-Stammlösung (50 mg/mL, ab Schritt 2.2) bis 12,5 mg/mL durch Zugabe von 40 µL der Stammlösung 120 µL PBS. Die verdünnte Lösung in zwei 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt, so dass jedes Rohr 80 µL hat.
  2. Fügen Sie 16 µL Lager RGD Lösung (2,8 mM, ab Schritt 2.3) für eine Röhre und 16 µL Lager Cystein-Lösung (ab Schritt 2,3 2,8 mM) mit dem zweiten Rohr. Vortex mischen. Legen Sie die PEG-Mal-RGD oder PEG-Mal-CYS Lösungen auf Eis bis zur Verwendung in Schritt 3,9.
    Hinweis: Das Verfahren wie hier beschrieben Erträge Hydrogele mit ca. 140 µM Peptid. Dies entspricht ungefähr 1 aus jeden 8 verfügbaren PEG Armen besetzt mit einem Peptid. Dies kann durch die Änderung des molaren Verhältnis von Cystein-terminierte Peptide zur Verfügung Maleimide Gruppen variiert werden. Im Allgemeinen kann eine maximale Konzentration von 280 µM Peptid erreicht werden, während immer noch ausreichende Zahl von Maleimide Gruppen für Hydrogel Vernetzung zur Verfügung.
  3. Verdünnen Sie die PEG-Thiol-Stammlösung (50 mg/mL, ab Schritt 2.2) bis 5 mg/mL durch Mischen von 50 mg/mL 4 µL Stammlösung mit 36 µL PBS. Die Mischung 120 µL des gelösten, Thiolated HA aus Schritt 2.1 hinzufügen.
    Hinweis: Lösungen von HMW HA sind sehr dickflüssig. Daher empfehlen wir, mit weiten Öffnung Mikropipette Tipp um Lösungen zu übertragen. Pipette langsam Lösung festhalten an den Wänden der Mikropipette Tipp zu vermeiden und Messgenauigkeit zu verbessern.
  4. Legen Sie die sauberen, trockenen Formen (vorbereitet in Schritt 2.4) in jede Vertiefung eine Gewebe-Kultur behandelte 12-Well-Platte. Mit sauberen, stumpfen Ende einer PIPETTENSPITZE drücken Sie die Gel-Form und überprüfen Abdichtung zwischen Formen und unten der well-Platte.
    Hinweis: Überprüfen Sie die Dichtung wieder vorm Kapselung auslaufen zu verhindern.
  5. Durchgang kultivierte GBM-Zellen, distanzieren, Einzelzellen und bestimmen Zellkonzentration3wie oben beschrieben.
    Hinweis: Einige GBM-Linien können nicht auf einzelne Zellen getrennt werden. In diesem Fall können ganze Gliomaspheres gekapselt werden. Jedoch bereiten Sie dissoziierte Einzelzellen nach präzisen Zellzählung zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit. Das Protokoll für Gliomasphere passagierung variiert zwischen den verschiedenen Labors und viele von Ihnen sind wahrscheinlich kompatibel mit Hydrogel Kapselung.
    1. (Empfohlen) Zentrifuge Gliomaspheres 500 X g für 5 min. entfernen den überstand und 1 mL der Zelle Dissoziation Enzym in der Zelle Pellet. Dann 5 min, leichtes Klopfen die Röhre zu agitieren inkubieren.
    2. Die Zellen 4 mL komplette Kulturmedium (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg/mL Heparin, G21 Ergänzung und 1 % Penicillin/Streptomycin in DMEM/F12) hinzufügen.
    3. Wieder bei 500 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand zu entfernen. Zu guter Letzt Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL des Mediums abgeschlossen und ein 70 µm Zelle Sieb suspendierte Zellen durchlaufen. (Empfohlene) waschen erholte sich das Sieb mit einer zusätzlichen 4 mL das komplette Medium, die Anzahl der Zellen zu maximieren.
  6. Die Konzentration der Zellen in der Suspension mit Hilfe eines Hemocytometer zu schätzen. Die Zellsuspension in 2 Zentrifuge Röhren, wo jedes Röhrchen ~ 80.000 Zellen enthält aufgeteilt. 500 X g für 5 min zentrifugieren; im Allgemeinen werden 80.000 Zellen 2 80 µL Hydrogele ausmachen.
  7. Den Überstand entfernen und erneut ein Pellet in 80 µL PEG-MAL-RGD-Lösung und eine zweite Pellet in 80 µL PEG-MAL-CYS-Lösung (vorbereitet in Schritt 3.1).
  8. Mit einem 200 µL, weite Öffnung Mikropipette Tipp, 40 µL HA-Lösung (aus Schritt 3.3 oben) verzichten Sie in jeder Kautschukform Silikon (wie in Schritt 3.4 vorbereitet).
  9. Mit einem 200 µL, weite Öffnung Mikropipette Tipp, mischen Sie die 40 µL PEG-MAL-CYS oder PEG-MAL-RGD Zelle Lösung mit der HA-Lösung in der Form. Pipette rauf und runter schnell nicht mehr als 10 mal. Wiederholen Sie für jede Gel-Kultur vorbereitet.
    Hinweis: Dieser Schritt braucht Übung, da die anfängliche Gelierung erfolgt schnell (innerhalb von 30 s). Pipette auf und ab während der Bewegung der Spitze an verschiedenen Orten in Formen zu gewährleisten, selbst das Mischen. Halten Sie die Spitze unter Flüssigkeitsspiegel, Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Tun Sie nicht Mischung der Lösung Tipp zu oft als Gel innerhalb der Mikropipette gebildet werden kann. PEG-MAL-CYS und PEG-MAL-RGD kombinierbar in unterschiedlichen Verhältnissen, die gewünschte RGD-Peptid-Konzentration zu erreichen.
  10. Legen Sie die Well-Platte mit Gel-gekapselte Zellen in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator für 5-10 Minuten zum Abschluss der Reaktion zu gewährleisten.
  11. 2-2,5 mL Kulturmedium in jede Vertiefung mit gebildeten Gele hinzugeben. Verwenden Sie eine sterile, 2 µL PIPETTENSPITZE oder Mikro-Spatel, Schimmel und Gel sanft zu trennen. Verwenden Sie vorsterilisierten Zange, um die Form von well-Platte entfernen. Legen Sie die well-Platte zurück zur Zelle Inkubator (37 ° C und 5 % CO2) für Kultur und zukünftige Experimente.
    Hinweis: Ziehen Sie das Werkzeug senkrecht nach oben um zu vermeiden, die Gel-Kulturen zu schädigen. Medium in Gel Kulturen sollten in der Regel alle 3-4 Tage ersetzt werden. Achten Sie darauf, nicht Hydrogele Aspirieren beim Medium zu entfernen. Wenn dies ein Thema ist, empfiehlt es sich, mit einer Pipette aus Kunststoff übertragen. Wenn Biolumineszenz imaging zu Zellennummer verfolgen geplant ist, müssen GBM-Zellen mit Lentivirus Codierung konstitutiv Luciferase Ausdruck vor Kapselung, wie zuvor beschrieben3ausgestrahlt. Fügen Sie für die Biolumineszenz Bildgebung 1 mM D-Luciferin Kulturmedium 1 h vor der Lumineszenz Bildgebung hinzu.

4. lysate Vorbereitung für das westliche Beflecken

  1. Chill-1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis (1 pro Gel Proben). Cool Zentrifuge bis 4 ° C.
  2. Well-Platten entfernen Sie Medium. Übertragen Sie Gele in prechilled Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. Fügen Sie 100 µL RIPA Puffer mit 1 X Protease/Phosphatase-Inhibitoren.
  4. Verwenden eine 1 mL Spritze mit einer Nadel 20 G, brechen Sie das Gel durch drücken die ganze Mischung durch Nadel mindestens 20 Mal.
  5. Flash-Drehung der Probe mittels Bank Top Microcentrifuge und Ort die Probe wieder auf Eis.
  6. Vortex Proben kurz alle 5 min für eine Gesamtmenge von 20 Minuten.
  7. Zentrifuge Proben bei 14000 X g für 15 min bei 4 ° C.
  8. Überstand auf neue, vorgekühlt Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und speichern bei-20 ° C (kurzfristig) oder und-80 ° C (langfristig). Durchführen Sie Gelelektrophorese mit Standardverfahren, wie zuvor beschrieben3.

5. Extrahieren einzelne Zellen aus Hydrogel Kulturen für Durchflusszytometrie

  1. Entfernen Sie Medium und Transfer Gel-Kultur (ab Schritt 3.11) zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  2. Inkubieren Sie Gel mit 500 µL Zelle Dissoziation Enzym (z. B. TrypLE Express) bei 37 ° C für 5 min, gelegentlich flicking die Röhre zu agitieren.
  3. Übertragen Sie die Mischung in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 5 mL der kompletten Medium. Platzieren Sie das Rohr auf dem Eis.
  4. Legen Sie eine 20G Nadel auf eine 10 mL Spritze. Ziehen Sie vorsichtig die Zellsuspension rauf und runter durch die Nadel 8 Mal.
  5. Fließen Sie die Mischung in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen durch 70 µm Zelle Sieb. Wenden Sie eine zusätzliche 5 mL des kompletten Medium durch das Sieb alle verbleibenden Zellen zu sammeln.
  6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 X g, für 5 min. Überstands entfernen und Aufschwemmen das Pellet in gewünschten Puffer für Durchflusszytometrie (mit standard-Protokollen3).

6. die Kryokonservierung von Hydrogele für Schneiden

  1. Entfernen Sie Mittel aus Gel Kulturen (aus Schritt 3.11).
  2. Inkubieren Sie Gel Kulturen mit 2 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 ° C über Nacht.
    Achtung: PFA ist giftig und muss sorgfältig behandelt werden.
  3. Am nächsten Tag entfernen Sie PFA. Fügen Sie 2 mL 5 % Saccharose in PBS, Gele und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. 5 % Saccharose-Lösung mit 2 mL 20 % Saccharose in PBS zu ersetzen und 30 min inkubieren.
  5. Saccharoselösung mit 2 mL frische 20 % Saccharose in PBS zu ersetzen und eine zusätzliche 30 min inkubieren.
  6. Ein drittes Mal ersetzen Sie die Saccharoselösung mit 2 mL frische 20 % Saccharose in PBS. Über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
  7. 20 % Saccharose in optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung vorzubereiten.
    Hinweis: Aufgrund der Viskosität des OCT, Auflösung von Saccharose kann dauern einige Zeit (bis über Nacht). Wir empfehlen die Mischung auf einem Boston-Shaker während der Auflösung weiterhin Unruhe.
  8. Am nächsten Tag entfernen Sie die 20 % Saccharose-Lösung und vorsichtig Gießen Sie die 20 % Saccharose in OCT Lösung über das Gel. Achten Sie darauf, das gesamte Gel abdecken. Bei 4 ° C für 3 h inkubieren.
  9. Übertragen Sie das Gel in der Mitte von einer Einbettung Schimmel mit einem großen, flachen Spatel; Dies muss sorgfältig durchgeführt werden, um Beschädigungen des Gels zu vermeiden.
  10. Coole 2-Methylbutane in eine Kammer mit einem Überschuss von Trockeneis herausnehmen.
  11. Füllen Sie den Einbettungs Schimmel mit reiner OCT (keine Saccharose). Knapp unterhalb der oberen Kante der Form zu füllen.
  12. Frieren Sie die Hydrogel-Probe durch Untertauchen in gekühlten 2-Methylbutane ein und dann gehen Sie zu schneiden.
  13. Abschnitt der Probe mit einem Kryostat; Schnittdicke von 10-18 µm und strukturierendes Temperatur von etwa-26 ° C werden empfohlen.
  14. Führen Sie standard Immunostaining Verfahren auf geschnittenen Gel Kultur, wie zuvor beschrieben3.
    Hinweis: PFA ist reizend und Karzinogen bekannt. Bitte behandeln und PFA gemäß den örtlich geltenden Normen und Vorschriften zu entsorgen.

7. total RNA-Extraktion aus Proben in Hydrogel

Hinweis: Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einem kommerziellen kit (siehe die Tabelle der Materialien), um Gesamt-RNS von Hydrogel kultivierten Zellen zu extrahieren. Die Puffer und alles Material stehen innerhalb des Kits verwendet.

  1. Kulturmedium zu entfernen. Verwenden Sie ein P1000 transferpipette mit Wide-Bohrung Tipp um die Hydrogel-Kultur in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen.
  2. Die Hydrogel-Kultur 350 µL Puffer RLT hinzufügen.
  3. Zerkleinern Sie mit Hilfe einer 20 G Nadel befestigt eine 1 mL Spritze, das Gel durch drücken die ganze Mischung durch Nadel mindestens 20 Mal.
  4. Übertragen Sie die ganze Mischung in einem Homogenisator Spalte platziert in einer 2 mL-Kollektion-Röhre. Bei 13.000 x g für 2 min zentrifugieren.
  5. Übertragen Sie den überstand in ein sauberes 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Achten Sie darauf, nicht zu stören den Gel-Niederschlag an der Unterseite.
  6. Mischen Sie die lysate Probe mit 350 µL 100 % Ethanol. Übertragen Sie die Probe auf einen Spin Spalte (aus dem Kit) Platz in einer 2 mL-Sammelrohr. Zentrifuge für 1 min bei 13.000 x g.
  7. Folgen Sie für die nachfolgenden Schritte für die RNA-Reinigung für PCR die allgemeinen Protokolls seitens der Hersteller.
    Hinweis: Sobald RNA gewonnen wird, können standard-Protokolle für die PCR verwendet werden.

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Ergebnisse

Für jede Charge von Thiolated HA sollte der Grad der Thiolation mit1H -NMR oder eine Ellman Test überprüft werden. HA, Modifikation, die mit dem hier beschriebenen konsequent Verfahren erzeugt ~ 5 % Thiolation (definiert als das molare Verhältnis von Thiole, HA Disaccharide) (Abbildung 1).

Einrichtung dieser neuen Kultur-Plattform erfordert jedes Labor, strengen Tests um ...

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Diskussion

Generierung von reproduzierbaren Daten mit diesem 3D Culture-System erfordert: 1) einheitliche Charge zu Charge Thiolation ha, (2) Praxis zu erreichen, effiziente Vermischung von Hydrogel-Vorstufen und Handhabung von Hydrogel Kulturen um Schäden zu vermeiden und (3) optimiert Aussaat Dichte für jede Zelllinie verwendet.

Wenn eine bestimmte Gewichtsanteil von HA in das Hydrogel gewünscht wird, bestimmt den Grad der Thiolation der HA die Crosslink-Dichte. Wir empfehlen eine konsistente Datenmeng...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde mit Mitteln aus dem NIH (R21NS093199) und der UCLA ARC 3R Award unterstützt. Unsere herzlichsten Dank gehen an das Labor von Dr. Harley Kornblum zur Bestimmung der HK301 und HK157-Zell-Linien. Wir danken auch UCLA Gewebe Pathologie Kern Labor (TPCL) für Kryoschneiden, Advanced Light Microscopy/Spektroskopie zentrale Einrichtung (ALMS) in California Nanosystems Institute (CNSI) an der UCLA für den Einsatz in der konfokalen Mikroskopie, UCLA Crump Institut für Molekulare Bildgebung für die Verwendung von IVIS-imaging-System, UCLA Molekulare Instrumentierung Center (MIC) für die Magnet-Resonanz-Spektroskopie und Flow Cytometry Kern in Jonsson umfassenden Cancer Center (Zusammenkunft) an der UCLA für die Bereitstellung von Messtechnik für Durchfluss zytometrie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pH-MessgerätThermo FisherN/AJedes pH-Messgerät mit einer Empfindlichkeit von pH 2-10
RührplatteThermo FisherN/AAllgemeine Laborausrüstung
Erlenmeyerkolben (125 ml)Thermo FisherFB-501-125
DialysekanülenThermo Fisher21-152-14
2L Polypropylen-BecherglasThermo FisherS01916
NatriumhyaluronanLifecoreHA700k-5500-750 kDa Bereich
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC)Thermo FisherPI-22980
N-Hydroxysuccinimid (NHS)sigma aldrich130672-5G
Salzsäure (HCl)Thermo FisherSA48-500
Natriumhydroxid (NaOH)Thermo FisherSS266-1
CytamindihydrochloridThermo FisherAC111770250
Dithiolthreitol (DTT)Thermo FisherBP172-25
Ellman's Testreagenz (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoesäureSigma AldrichD218200-1G
Deuteriertes Wasser (Deuteriumoxid)Thermo FisherAC166301000
0.22&Mikro; m vakuumbetriebener FilterCellTreat229706
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo FisherP32080-100T
Hanks' ausgewogene Salzsalzlösung (HBSS)Thermo FisherMT-21-022-CV
4-armiges PEG-MaleimidJenKem TechnologyA7029-1Molekulargewicht ca. 20kDa
4-armiges PEG-ThiolJenKem TechnologyA7039-1Molekulargewicht ca. 20kDa
L-Cystein sigma aldrichC7880-100G
RGD ECM mimetisches PeptidGenscript BiotechN/AKundenspezifisches Peptid mit der Sequenz "GCGYGRGDSPG", N-terminal sollte acetyliert
werden SilikonformenSigma AldrichGBL664201-25EAVerwenden Sie die Rasierklinge, um das komplette Kulturmedium in einzelne Stücke zu schneiden
Verschiedenes VerschiedenesDMEM/F12 (Thermofisher) mit Nicht-Serum-Supplement (G21 von GeminiBio), epidermalem Wachstumsfaktor 50 ng/ml (Peprotech), Fibroblasten-Wachstumsfaktor 20 ng/ml (Pepro Tech) und Heprain 25µ g/mL (Sigma Aldrich), Kulturmedium variiert je nach Labor Patient
Derived GBMcell N/AN/A
20G NadelBD medical305175
1mL SpritzeThermo Fisher14-823-434
10mL SpritzeBD medical302995
RIPA BufferThermo FisherPI-89901
Protease/ Phosphatase-Hemmer Mini-TabletteSigma Aldrich5892970001
Vortex-SchüttlerThermo Fisher12-814-5Q
TrypLE expressThermoFisher 12604013
70µ m ZellsiebThermo Fisher22-363-548
ParaformaldehydThermo FisherAC4167850004% (w/v) in PBS auflösen, pH 7,4
halten D-SaccharoseThermo FisherBP220-1
Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (O.C.T.)Thermo FisherNC9373881
Zellkultur-InkubatorThermo FisherN/ABeliebig allgemein mit 5 % CO2 und 37 °C
Kühl-/GefrierschrankThermo FisherN/AAlle allgemeinen Laborgeräte mit einer Kapazität von -20 °C und -80 °C
Einweg-EinbettformenThermo Fisher12-20
LyapholizerLabconcoN/AAlle -105 °C Gefriertrockner
HEPESThermo FisherBP310-500
Braunes FläschchenKimble Chase60912D-2
Pipettenspitzen mit breiter ÖffnungThermo Fisher9405120
2-MethylbutanThermo Fisher03551-4
TrockeneisN/AN/A

Referenzen

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