Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für dreidimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen innerhalb orthogonal abstimmbaren Biomaterialien entwickelt, um das Gehirn-Matrix zu imitieren. Dieser Ansatz bietet eine in Vitro, experimentelle Plattform, die viele Eigenschaften von in Vivo Glioblastom-Zellen in der Regel in Kultur verloren beibehält.
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Methodenartikel
Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Glioblastom (GBM) ist die häufigste, aber tödlichsten, Zentralnervensystem Krebs. In den letzten Jahren haben viele Studien fokussiert wie die extrazelluläre Matrix (ECM) der einzigartigen Gehirn Umwelt, wie Hyaluronsäure (HA), GBM fortschreiten und Invasion erleichtert. Jedoch enthalten die meisten in-vitro- Kultur Modelle GBM-Zellen außerhalb des Kontexts von ECM. Murine Xenotransplantate von GBM-Zellen werden häufig auch verwendet. In Vivo Modellen erschweren jedoch die Beiträge der einzelnen Merkmale des komplexen Tumor Mikroumgebung Tumor Verhalten zu isolieren. Hier beschreiben wir eine HA Hydrogel-basierte, dreidimensionale (3D) Kultur-Plattform, die Forscher zu HA-Konzentration und Steifigkeit unabhängig voneinander verändern können. Hohes Molekulargewicht HA und Polyethylenglykol (PEG) umfassen Hydrogele, die vernetzt über Michael-Type-Zusatz im Beisein von lebenden Zellen sind. 3D Hydrogel Kulturen des Patienten abgeleitet GBM Zellen Ausstellung Lebensfähigkeit und Verbreitung Preise so gut wie oder besser als, wenn kultiviert als standard Gliomaspheres. Die Hydrogel-System ermöglicht auch eine Einbindung von ECM-mimetischen Peptiden, Auswirkungen von bestimmten Zelle-ECM-Interaktionen zu isolieren. Hydrogele sind optisch transparent, so dass lebende Zellen in 3D Culture abgebildet werden können. Zu guter Letzt sind HA Hydrogel Kulturen kompatibel mit Standardtechniken für Molekulare und zelluläre Analysen, einschließlich PCR, Western blotting und Kryoschneiden gefolgt von Immunfluoreszenz-Färbung.
Einleitung
Dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme rekapitulieren Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) in nativen Gewebe besser als ihre zweidimensionale (2D) Pendants1,2. Fortschritte in der Gewebetechnik haben anspruchsvolle, 3D Kultur-Plattformen, die kontrollierte Untersuchungen (1) wie chemische und physikalische Komponenten der Matrix Mikroumgebung beeinflussen Zelle Verhaltensweisen und (2) die Wirksamkeit der neue ermöglichen ergab therapeutische Strategien für eine Reihe von Krankheiten, einschließlich Krebs2. Während in-vitro- Modelle k....
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Protokoll
Alle menschlichen Gewebe Sammlung Schritte wurden unter institutionell zugelassenen Protokolle durchgeführt.
1. Thiolation von Hyaluronsäure
Hinweis: Molare Verhältnis sind in Bezug auf die Gesamtzahl der carboxylat-Gruppen angegeben, sofern nicht anders angegeben.
- Lösen Sie 500 mg Natrium Hyaloronsäure (HA, 500-750 kDa auf) bei 10 mg/mL destilliertem, entionisiertem Wasser (DiH2O) im Autoklav sterilisiert, 250-mL-Erlenmeyerkolben. Rühren Sie die Lösung (~ 200 u/min) bei Raumtemperatur für 2 Stunden, um vollständig HA zu lösen. Verwenden Sie Stir Bar und magnetische rühren Platte weiterhin Re....
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Ergebnisse
Für jede Charge von Thiolated HA sollte der Grad der Thiolation mit1H -NMR oder eine Ellman Test überprüft werden. HA, Modifikation, die mit dem hier beschriebenen konsequent Verfahren erzeugt ~ 5 % Thiolation (definiert als das molare Verhältnis von Thiole, HA Disaccharide) (Abbildung 1).
Einrichtung dieser neuen Kultur-Plattform erfordert jedes Labor, strengen Tests um .......
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Diskussion
Generierung von reproduzierbaren Daten mit diesem 3D Culture-System erfordert: 1) einheitliche Charge zu Charge Thiolation ha, (2) Praxis zu erreichen, effiziente Vermischung von Hydrogel-Vorstufen und Handhabung von Hydrogel Kulturen um Schäden zu vermeiden und (3) optimiert Aussaat Dichte für jede Zelllinie verwendet.
Wenn eine bestimmte Gewichtsanteil von HA in das Hydrogel gewünscht wird, bestimmt den Grad der Thiolation der HA die Crosslink-Dichte. Wir empfehlen eine konsistente Datenmeng.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde mit Mitteln aus dem NIH (R21NS093199) und der UCLA ARC 3R Award unterstützt. Unsere herzlichsten Dank gehen an das Labor von Dr. Harley Kornblum zur Bestimmung der HK301 und HK157-Zell-Linien. Wir danken auch UCLA Gewebe Pathologie Kern Labor (TPCL) für Kryoschneiden, Advanced Light Microscopy/Spektroskopie zentrale Einrichtung (ALMS) in California Nanosystems Institute (CNSI) an der UCLA für den Einsatz in der konfokalen Mikroskopie, UCLA Crump Institut für Molekulare Bildgebung für die Verwendung von IVIS-imaging-System, UCLA Molekulare Instrumentierung Center (MIC) für die Magnet-Resonanz-Spektroskopie und Flow Cytometry Kern in Jonsson umfassend....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| pH-Messgerät | Thermo Fisher | N/A | Jedes pH-Messgerät mit einer Empfindlichkeit von pH 2-10 |
| Rührplatte | Thermo Fisher | N/A | Allgemeine Laborausrüstung |
| Erlenmeyerkolben (125 ml) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| Dialysekanülen | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L Polypropylen-Becherglas | Thermo Fisher | S01916 | |
| Natriumhyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa Bereich |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-Hydroxysuccinimid (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Salzsäure (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Natriumhydroxid (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cytamindihydrochlorid | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's Testreagenz (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoesäure | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuteriertes Wasser (Deuteriumoxid) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22&Mikro; m vakuumbetriebener Filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' ausgewogene Salzsalzlösung (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-armiges PEG-Maleimid | JenKem Technology | A7029-1 | Molekulargewicht ca. 20kDa |
| 4-armiges PEG-Thiol | JenKem Technology | A7039-1 | Molekulargewicht ca. 20kDa |
| L-Cystein | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetisches Peptid | Genscript Biotech | N/A | Kundenspezifisches Peptid mit der Sequenz "GCGYGRGDSPG", N-terminal sollte acetyliert |
| werden Silikonformen | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Verwenden Sie die Rasierklinge, um das komplette Kulturmedium in einzelne Stücke zu schneiden |
| Verschiedenes Verschiedenes | DMEM/F12 (Thermofisher) mit Nicht-Serum-Supplement (G21 von GeminiBio), epidermalem Wachstumsfaktor 50 ng/ml (Peprotech), Fibroblasten-Wachstumsfaktor 20 ng/ml (Pepro Tech) und Heprain 25µ g/mL (Sigma Aldrich), Kulturmedium variiert je nach Labor Patient | ||
| Derived GBM | cell N/A | N/A | |
| 20G Nadel | BD medical | 305175 | |
| 1mL Spritze | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL Spritze | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| Protease/ Phosphatase-Hemmer Mini-Tablette | Sigma Aldrich | 5892970001 | |
| Vortex-Schüttler | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo | Fisher 12604013 | |
| 70µ m Zellsieb | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyd | Thermo Fisher | AC416785000 | 4% (w/v) in PBS auflösen, pH 7,4 |
| halten D-Saccharose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (O.C.T.) | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Zellkultur-Inkubator | Thermo Fisher | N/A | Beliebig allgemein mit 5 % CO2 und 37 °C |
| Kühl-/Gefrierschrank | Thermo Fisher | N/A | Alle allgemeinen Laborgeräte mit einer Kapazität von -20 °C und -80 °C |
| Einweg-Einbettformen | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Alle -105 °C Gefriertrockner |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Braunes Fläschchen | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Pipettenspitzen mit breiter Öffnung | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-Methylbutan | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Trockeneis | N/A | N/A |
Referenzen
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103
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Nachdrucke und Genehmigungen
