Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode um eine netzhautgewebe bestehend aus retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gezüchtet auf menschliche amniotic Membranen und deren Vorbereitung für die Verpflanzung in Tiermodellen zu konstruieren.

Zusammenfassung

Mehreren pathologische Zuständen des Auges beeinträchtigen die Funktionalität bzw. das Überleben des retinalen Pigmentepithels (RPE). Dazu gehören einige Formen der Retinitis Pigmentosa (RP) und Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD). Zelltherapie ist eines der vielversprechendsten therapeutischen Strategien vorgeschlagen, diese Krankheiten bereits ermutigende Zwischenstand beim Menschen zu heilen. Die Methode der Zubereitung des Transplantats hat jedoch erhebliche Auswirkungen auf die funktionellen Ergebnisse in Vivo. RPE-Zellen als eine Zellsuspension gepfropft sind nämlich weniger funktional als die gleichen Zellen als eine netzhautgewebe transplantiert. Hier beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Methode, Ingenieur RPE Gewebe und deren Vorbereitung für eine Implantation in Vivo . RPE Zellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen sind auf eine biologische Unterstützung, die menschlichen amniotic Membrane (Schinken) ausgesät. Im Vergleich zu künstlichen Gerüste, hat diese Unterstützung den Vorteil, dass eine Basalmembran, die in der Nähe der Bruch-Membran ist wo endogene RPE-Zellen verbunden sind. Jedoch seine Manipulation ist nicht einfach, und wir mehrere Strategien für seine ordnungsgemäße Kultivierung und Vorbereitung für die Verpflanzung in Vivoentwickelt.

Einleitung

RPE ist entscheidend für das Überleben und die Homöostase der Photorezeptoren mit denen sie eng verbunden¹ist. Verschiedene pathologische Zustände verändern seine Funktionalität und/oder überleben, darunter RP und AMD.

RP ist eine Gruppe von geerbten monogenen Mutationen, die die Funktionen der Photorezeptoren oder RPE-Zellen oder beide^2,3betreffen. Es wird geschätzt, dass Mutationen, die betreffen speziell die RPE Zellen machen 5 % der RP². AMD ist eine weitere Bedingung wo die RPE-Schicht verändert ist, führende letztlich zu zentralen Sehverlust. AMD wird durch das komplexe Zusammenspiel von genetischen und umweltbedingten Faktoren verursacht und wirkt sich auf die ältere^4,5,6. Prognosen zufolge wird AMD eine Sorge um 196 Millionen Patienten weltweit durch 2020⁷sein. Bei diesen Erkrankungen keine wirksame Heilung gibt, und eine der vorgeschlagenen Strategien ist die Transplantation von neuen RPE-Zellen um Toten/nicht funktionsfähige vorbestehenden RPE Zellen⁸zu kompensieren.

Die Formulierung des Endproduktes, veredelt werden ist wichtig, um die besten funktionellen Ergebnisse sicherzustellen. RPE-Zellen als eine Zellsuspension, trotz des Seins eine einfach Art der Lieferung, injiziert Bedenken bezüglich deren Überleben, Integration und Funktionalität^{9,10,11,12 , 13}. Wissenschaftler entwickeln jetzt mehr komplexe Rezepturen liefern entwickelt netzhautgewebe^{9,13,14,15,16}. In diesem Zusammenhang entwickelten wir eine originelle Methode zur in-vitro- RPE Gewebe zu generieren, die für die Transplantation⁹verwendet werden könnten.

RPE zellbanken abgeleitet von menschlichen embryonalen Stammzellen (ES) sind in diesem Protokoll verwendet. Jedoch Alternative RPE Zellen Banken aus verschiedenen Zelle Quellen (Human-induzierte pluripotente Stammzellen, primäre RPE-Zellen usw.)und differenziert mit einer anderen Methode eignen sich auch für dieses Protokoll. Freuen Sie sich auf gezielte Differenzierung Protokolle mit Zytokinen und/oder kleine Moleküle^{17,18,19,20,21,22}.

Um transplantiert werden, sollte das technische Gewebe auf einem Gerüst vorbereitet werden. In den letzten Jahren wurden verschiedene Gerüste basierend auf ein Polymer oder eine Matrix von biologischen Ursprungs^13,23,24entwickelt. Hier, die biologische Substrat verwendet ist der Schinken, aber andere Substrate wie entblößt Bruch Membranen umgesetzt werden könnte. Die hier beschriebene Methode hat den Vorteil der Verwendung einer biologischen Gerüst, das für die RPE nativen Umgebung relevant ist.

Menschlichen ES Zellen gewonnenen RPE-Zellen sind für mindestens 4 Wochen kultiviert, um voll und ganz als ein Kopfsteinpflaster Monolage organisiert werden. In diesem Stadium das Epithel erhalten ist funktional und⁹polarisiert. Da dieses Gewebe leicht Falten, wird sie schließlich in einer dünnen Schicht aus einem Hydrogel-Träger, mehr Steifigkeit und Elastizität zu geben und zu schützen während der Injektion eingebettet. Dieses Produkt wird dann bei 4 ° C bis Pfropfung gespeichert.

Protokoll

Alle Menschen in diesem Protokoll verwendete Materialien wurden nach Verordnungen der Europäischen Union verwendet. Die menschliche ES-Zell-Linie, die in dieser Studie verwendeten stammt aus einem einzigartigen Embryo. Das Paar, das den Embryo gespendet hatte wurde umfassend informiert und gaben ihre Zustimmung für eine anonyme Spende. Eine klinische Grade menschliche ES Zelllinie wurde abgeleitet von diesem Embryo, überhöht, qualifiziert und ordnungsgemäß dokumentiert von Roslin Zellen (UK). Schinken wurden unter sterilen Bedingungen bei einem Kaiserschnitt bei Müttern beschafft, die eine informierte Einwilligung für Plazenta Spende nach krankenhausrichtlinien (APHP, Hôpital Saint Louis) unterzeichnet.

1. Vorbereitung der Kultur, Medien und Reagenzien

1. Vorbereitung der RPE Zellkulturmedium
   1. Um die RPE Zellkulturmedium vorzubereiten, fügen Sie 4 % Serum Ersatz (20 mL für ein Finales Volumen von 500 mL), 1.000 x verdünnt 2-Mercaptoethanol (500 µL für ein Finales Volumen von 500 mL) und 1 % Eagle′s minimale wesentliche Medium (MEM) nicht-essentiellen Aminosäuren Lösung (5 mL für eine endgültige Volumen von 500 mL) in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) hohe Glukose (475 mL für ein Finales Volumen von 500 mL).
2. Vorbereitung des Mediums Transport/Erhaltung
   1. Zur Vorbereitung der Transport/Erhaltung Medium hinzufügen 1 % von Penicillin-Streptomycin (5 mL für ein Finales Volumen von 500 mL), CO₂-unabhängiges Medium (495 mL für ein Finales Volumen von 500 mL) und halten Sie es bei 4 ° C.
3. Wiederfreisetzung des Enzyms thermolysin
   1. Vorbereitung der Stammlösung von thermolysin
      1. Um eine Stammlösung von Thermolysin vorzubereiten, tauen Sie die Thermolysin Pulver, das bei-20 ° C, bei Raumtemperatur gelagert wurde.
      2. Die enzymatische Aktivität von Charge zu Charge Variable sein mag, berechnen Sie diese Aktivität basierend auf die Bescheinigung über die Analyse zur Verfügung gestellt mit dem Thermolysin Pulver des Batches verwendet werden. Teilen der "neutrale Protease Aktivität berechnet = ANPC" (dargestellt durch das Certificate of Analysis) von 181 (das Molekulargewicht von Tyrosin). Das erzielte Ergebnis entspricht die enzymatische Gesamtaktivität des mitgelieferten Thermolysin Pulvers (U/Vial).
      3. Bereiten Sie eine Stammlösung bei 200 U/mL, indem man das Volumen des Wassers, die enzymatische Aktivität (U/Vial) geteilt durch 200 (U/mL) entspricht.
      4. Lösen Sie das Enzym durch pipettieren das Wasser, das oben und unten hinzugefügt wurde. Wirbel die Lösung für 30 s und überprüfen ob das Pulver komplett gesperrt wurde. Mehr pipettieren kann für eine volle Auflösung erforderlich.
      5. Aliquoten Vorratslösung und bei-20 ° c Lagern
   2. Vorbereitung der eine funktionierende Lösung von thermolysin
      Hinweis: Die Thermolysin-Lösung muss am Tag der Schinken Behandlung vorbereitet werden.
      1. Tauen Sie das Lager Aliquote von Thermolysin bei 200 U/mL bei-20 ° c gelagert Verdünnen Sie Stammlösung 200 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), um eine endgültige enzymatische Aktivität von 1 U/mL zu erhalten. Bereiten Sie 40 mL, 1 – 4 Schinken Flecken zu behandeln.
      2. Die Thermolysin-Lösung durch einen 0,2 µm-Filter vor der Verwendung gefiltert werden.
4. Wiederfreisetzung Gelatine
   1. Vorbereitung von 20 % Gelatine-Lösung und block
      Hinweis: 20 % Gelatine-Lösung und Block können bis 1 Woche vor dem Gebrauch vorbereitet werden.
      1. Wärmen Sie die CO₂-unabhängiges Medium auf 42 ° C in einem Wasserbad für 30 min (bis zu 1 h). In einem 50 mL-Tube, fügen Sie 10 g Gelatine, 40 mL erwärmt CO₂-unabhängiges Medium und Wirbel die Lösung.
      2. Lösen Sie die Gelatine für 30 – 60 min bei 42 ° C. Vortex jede 10 min um die Lösung zu homogenisieren.
      3. Sobald die Lösung homogen ist, fügen Sie 4 mL der Gelatinelösung 20 % vier 6 cm-Kultur-Gerichte hinzu. Vermeiden Sie Luftblasen. Fügen Sie einen Kunststoff Paraffin-Film um die Gerichte zu schützen, und lassen Sie die Lösung bei 4 ° c zu festigen
   2. Vorbereitung von 8 % Gelatine-Lösung
      Hinweis: Die 8 % Gelatine-Lösung kann der Tag vor Gebrauch zubereitet und bei 4 ° c gelagert
      1. Wärmen Sie die CO₂-unabhängiges Medium auf 42 ° C für 30 min (bis zu 1 h). In einem 50 mL-Tube hinzufügen 4 g Gelatine, 46 mL erwärmt CO₂-unabhängiges Medium und Wirbel die Lösung.
      2. Lösen Sie die Gelatine für 30 – 60 min bei 42 ° C. Fügen Sie einen Kunststoff Paraffin-Film zum Schutz der Röhre und halten es in einem Wasserbad bei 37 ° C, wenn es am selben Tag verwendet werden, oder bei 4 ° C lagern Sie, wenn sie später verwendet werden soll.

2. Thermolysin Behandlung von menschlichen Amniotic Membranen

1. Menschlichen amniotischen Membran-Waschanlagen
   1. Schinken in kleine Stücke (ca. 30 mm x 30 mm) fixiert in einem Nylon-Gerüst, entweder bereits bei 4 ° C mit PBS-Puffer oder gefroren im Lieferumfang enthalten sind. Sofern die Membranen bei 37 ° C in einem Inkubator für 30 min Auftauen gefroren,.
   2. Waschen Sie die Membranen:
      1. Platz 1 – 4 Membranen in eine 250 mL Flasche mit 80 mL PBS. Verwenden Sie so viele Flaschen wie erforderlich.
      2. Jede Flasche in einem Teller-Shaker mit hoher Geschwindigkeit für 5 min schütteln und dann die PBS zu verwerfen. 80 mL PBS und Wiederholung hinzugeben.
2. Thermolysin Behandlung
   1. Fügen Sie 40 mL der Arbeitslösung von Thermolysin (1 U/mL) pro Flasche mit Membranen (1 – 4 Membranen pro Flaschen; bis zu 3 Flaschen zu einem Zeitpunkt).
   2. Schütteln Sie die Flasche für 5 min bei 450 u/min und dann Wirbel für 30 s. 1 X wiederholen.
   3. Verwerfen Sie Thermolysin Lösung zu und 80 mL PBS.
   4. Schütteln Sie die Flaschen für 5 min bei 450 Umdrehungen pro Minute. Verwerfen der PBS und 80 mL PBS. Wiederholen Sie 3 X.

(3) Fixierung der menschlichen Amniotic Membranen auf einem Kultur-Einsatz

1. Verwenden Sie lange sterile Pinzette (das den Boden der Flasche erreichen kann), die Schinken eins nach dem anderen zu entfernen, und übertragen Sie jeder Schinken auf einem 10 cm Kulturschale mit 10 mL PBS.
2. In der neuen 10 cm-Kulturschale mit 10 mL PBS Platz eins der Membranen mit Nylon nach unten. Lösen Sie zwei der vier Clips, die verwendet werden, um die Membran zu Nylon zu beheben.
3. Setzen Sie den kleineren Ring der Kultur Einlage zwischen den Nylon und die Membran.
4. Stellen Sie sicher, dass die Membran der kleineren Ring vollständig abdeckt. Den zweiten Teil des Kultur-Einsatzes auf die Membran-Clip. Die Basalmembran des Schinkens ist innerhalb der Kultur-Einsatz nach oben. Lösen Sie die letzten beiden Klipps.
5. Mit steriler Schere, der Überschuss der Membran außerhalb der Kultur einfügen bei Bedarf geschnitten. Mit Pinzette, die Membran fest in der Kultur einfügen, um ein 12-Well-Platte übertragen PBS fügen Sie hinzu und speichern Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂.
6. Wiederholen Sie diese Vorgänge (aus Schritt 3.2 bis 3.5) mit den anderen Membranen.

(4) Auftauen und Aussaat von retinalen Pigment Epithelzellen auf menschliche Amniotic Membranen

1. Auftauen von retinalen Pigment Epithelzellen
   1. Die RPE Zellbank ist bei 1 Million Zellen pro kryogenen Vial in flüssigem Stickstoff eingefroren. So viele kryogene Fläschchen nach Bedarf Auftauen (350.000 Zellen sind pro Membran ausgesät).
   2. Bereiten Sie eine 15 mL Röhrchen mit 3 mL RPE Medium pro kryogenen Fläschchen. Einmal das Fläschchen aufgetaut ist, übertragen Sie die Zellen auf jedes Rohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die anderen Fläschchen.
   3. Homogenisieren (pipette nach oben und unten ein paar Mal zu Aufschwemmen der Zellen in der RPE-Medium) und 10 µL der Zelle Lösung nehmen und übertragen Sie es auf einem 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 10 µL Trypan blau. Platz 15 µL dieser Lösung in einer Zählkammer, dann zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen (nicht blau gefärbt) unter dem Mikroskop mit einer 4 X Objektiv. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die anderen Fläschchen.
   4. In der Zwischenzeit Zentrifugieren den 15 mL Röhrchen bei 110 X g für 5 min. verwerfen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen bei 700.000 Zellen/mL.
2. Aussaat von retinalen Pigment Epithelzellen in menschlichen amniotic Membranen
   1. Entfernen Sie die 12-Well-Platte mit den Membranen aus dem Inkubator.
   2. Aspirieren Sie die PBS. Fügen Sie 500 µL Zellsuspension in Schritt 4.1.4 in der Mitte des Kultur-Einsatzes vorbereitet. Fügen Sie 1 mL der RPE Medium außerhalb der Kultur einfügen (innerhalb des Brunnens). Wiederholen Sie für die anderen Membranen.
   3. Legen Sie die 12-Well-Platte mit den Membranen im Inkubator.

5. Wartung der retinalen Pigment Epithel Zellkulturen auf menschliche Amniotic Membranen

1. Erneuern des Mediums 2 X pro Woche, in der Regel am Montag und Freitag, mindestens bis zum 30. Tag der Kultur.
2. Das Medium innerhalb und außerhalb der Kultur-Einsatz für jedes gut abzusaugen und mit frischem Medium (1 mL außerhalb der Kultur einfügen und 500 µL innen) erneuern. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂.

6. Vorbereitung des retinalen Pigment Epithel Patches für die Transplantation

Hinweis: Ab 30. Tag der Kultur, ist das Gewebe für eine Transplantation bereit.

1. Warmen 8 % Gelatine-Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. füllen die innere Kammer der Vibratome mit kalten CO₂-unabhängiges Medium (bei 4 ° C).
2. Platzieren Sie den 20 % Gelatine-Block in der Vibratome.
   1. Nehmen Sie der 6 cm Kulturschale mit dem Block 20 % Gelatine aus dem Kühlschrank. Mit einem Skalpell, schneiden Sie einen Block von 5 x 5 cm. Die Oberseite des Blocks an den Support mit Cyanacrylat-Klebstoff oder eines gleichwertigen Dokuments einfügen.
   2. Legen Sie ein neues Blatt in der Vibratome.
   3. Der Pegel des Blocks, bis es auf dem gleichen Niveau der Rasierklinge ist.
   4. Füllen Sie das Bad um die Unterstützung mit frischen CO₂-unabhängiges Medium bei 4 ° C. Schneiden Sie den Block mit der Vibratome mit mittlerer Geschwindigkeit, bis der Block gleichmäßig geschnitten wird, führt zu einer glatten Oberfläche. Legen Sie die Position 0.
   5. Aspirieren Sie das Medium um den Block von Gelatine, bis es vollständig trocken ist, und nehmen Sie dann die 12-Well Kultur-Platte mit den Geweben aus dem Inkubator bei 37 ° C.
   6. Mit Pinzette, öffnen Sie vorsichtig die Kultur einfügen auf die Gelatine-Block. Schneiden Sie mit der Schere aus, alle Teile der Membranen, die Zellen (außerhalb des Ringes, wo Zellen nicht gezüchtet wurden) nicht enthalten sind. Aspirieren Sie das gesamte restliche Medium.
   7. Fügen Sie 1 mL liquid 8 % Gelatine-Lösung bei 37 ° C, um die Membranen zu decken. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige. Warten Sie 5 – 8 min um die Gelatine zu erstarren lassen.
   8. Fügen Sie frisches CO₂-unabhängiges Medium (bei 4 ° C) in die Badewanne bis die Membran bedeckt ist.
   9. Mit der Vibratome an einer Position von-100 µm, mit einer mittleren Geschwindigkeit, Bewusstsein wie verhält sich der Block geschnitten. Am Ende des Abschnitts achten Sie darauf, die Orientierung des Gewebes zu erhalten.
   10. Schneiden Sie mit einem Skalpell eine Ecke um die Ausrichtung des Abschnitts zu identifizieren.
   11. Sammeln Sie die Membran mit einem Spatel in Gelatine eingebettet und legen Sie sie in eine 6-Well-Platte, gefüllt mit dem Naturschutz-Medium bei 4 ° C, bis es in den Augen der Empfänger Pfropfen.
   12. Zum Zeitpunkt der Transplantation passen Sie die Größe des Implantats auf die Größe des Empfängers Auges unter einem Operationsmikroskop (1 – 3 für Ratten, 10 – 15 mm² für nicht-menschliche Primaten).

Ergebnisse

Schinken enthalten eine Epithelschicht, die entfernt werden sollten, bevor die Aussaat von RPE-Zellen. Eine enzymatische Behandlung der Membran erfolgt mit dem Thermolysin unter schütteln. In der Reihenfolge nicht, nicht verlieren die Polarität der Membran (das Epithel ist auf einer Seite), es ist fixiert auf einem Träger, welche Zusammensetzung je nach Anbieter (Abbildung 1A) unterscheiden könnte. Überprüfen Sie die Adhäsion der Membran um seine Unterstützun...

Diskussion

Wir beschrieb eine Methode für die Kultur der RPE-Zellen auf eine biologische Gerüst und deren Vorbereitung für die Implantation in Tiermodellen. Einer der kritischen Schritte des Protokolls ist die Wartung der Orientierung des Schinkens entlang des Verfahrens bis zu seiner Aufnahme in Gelatine. In der Tat, das native Epithel der Membran entfernt, und die Basalmembran wird ausgesetzt⁹. Die RPE-Zellen müssen auf diese Basalmembran ausgesät werden. Bei der Vorbereitung für die Einbettung von Gelatin...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sterile Biosicherheitswerkbank	TechGen International	Nicht zutreffend
Entsorgungssystem für flüssige Abfälle für die Aspiration	Vacuubrand	BVC 21
CO2gesteuert +37  ° C-Zell-Inkubator	Thermo Electron Corporation	BVC 21 NT
200  &Mikro; L-Pipette: P200	Gilson	F144565
1  ml Pipette: P1000	Gilson	F144566
Pipettenhilfe	Drummond	75001
+4  ° C Kühlschrank	Liebherr	Nicht zutreffend
Vibratome	Leica	VT1000S
Feine Schere	WPI	501758
Pinzette (x2)	WPI	555227F
Wasserbad	Grant subaqua pro	SUB6
Präzisionswaage	Sartorius	CP225D
Zentrifuge	Eppendorff	5804
Mikroskop	Olympus	SC30
Horizontaler Schaukelschüttler	IKA-WERKE	IKA MTS 214D
Vortex	VWR	LAB DANCER S40
Einweg-Skalpell	WPI	500351
Kunststoff-Paraffinfolie	VWR	PM992
µ m Einmal-Spritzenvorsatzfilter	SARTORIUS	16532
Spritze ohne Nadel 50 mL	Dutscher	50012
Flaschen 250 mL	Dutscher	28024
15 mL steril Falcon Röhrchen	Dutscher	352097
50 mL steril Falcon Röhrchen	Dutscher	352098
Kultureinsatz	Scaffdex	C00001N
60  mm Zellkulturdaten: B6	Dutscher	353004
12-Well-Zellkulturplatte	Corning	3512
6-Well-Kulturplatten	Corning	3506
Rasierklingen	Ted Pella, Inc	121-9
Cyanacrylat-Kleber	Castorama	3178040670105
PBS 1x (500  mL)	Sigma	D8537
Thermolysin	Roche	5339880001
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX	Invitrogen	61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)	Invitrogen	12618-013
MEM-NEAA (100x)	Invitrogen	11140-035
b-Mercaptoethanol (50  mM)	Invitrogen	31350-010
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140122
CO2unabhängiges Medium	GIBCO	18045-054
Gelatine	MERCK	104078
menschliche Amnionmembran	Gewebebank St. Louis Krankenhaus (Paris, Frankreich)	Nicht zutreffend