Methodenartikel

Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen

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DOI:

10.3791/58228

7. Januar 2019

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mechanosensitive Ionenkanäle sind oft in Bezug auf Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit mit Patch-Clamp-Aufnahme untersucht. Allerdings kann je nach experimentellen Protokoll, das Ergebnis auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen fehlerhaft sein. Hier bieten wir Methoden zur Vermeidung und Korrektur solcher Fehler mit einer theoretischen Grundlage.

Zusammenfassung

Strömung ist ein wichtiger ökologischer Impuls, der viele physiologische und pathologische Prozesse, wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation steuert. Obwohl die molekularen Mechanismen der biologischen Reaktionen auf Fluid Flow/Querkraft nicht vollständig verstanden sind, kann kritisch Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating beitragen. Daher wurde Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit Ionenkanäle mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Jedoch können abhängig von den experimentellen Protokoll die Ergebnisse und Interpretation der Daten fehlerhaft sein. Hier präsentieren wir experimentelle und theoretische Belege für Fluid Flow-bezogene Fehler und Methoden für die Schätzung, Vorbeugung und Korrektur dieser Fehler bereitzustellen. Veränderungen der Kreuzung Potenzial zwischen Ag/AgCl-Referenzelektrode und Baden Flüssigkeit wurden gemessen mit einer offenen Pipette gefüllt mit 3 M KCl. Strömung konnte dann die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial für ca. 7 mV zu verlagern. Im Gegensatz dazu durch die Messung der Spannung-Verschiebung durch Strömung induzierte, schätzten wir die Ionenkonzentration in der ungerührte Grenzschicht. Im statischen Zustand erreichen die echte Ionenkonzentrationen angrenzend an den Ag/AgCl Referenz Elektrode oder Ionen-Kanal Einlass an der Zellmembran Oberfläche so niedrig wie etwa 30 % davon in den Flow-Zustand. Platzieren einer Agarose 3 M kann KCl-Brücke zwischen der Baden-Flüssigkeit und Referenz-Elektrode dieses Problem der Kreuzung mögliche Verschiebung verhindert. Das ungerührte Ebeneneffekt angrenzend an der Oberfläche der Zellmembran konnten jedoch nicht auf diese Weise gelöst werden. Hier bieten wir eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette, betonend, wie wichtig es ist, mit einer Agarose Salz-Brücke während des Studiums Fluid strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Daher kann dieser neuartige Ansatz, unter Berücksichtigung der realen Konzentrationen von Ionen in der ungerührte Grenzschicht, nützlichen Einblick auf die experimentelle Gestaltung und Interpretation der Daten im Zusammenhang mit Fluid Schubspannung Regulierung von Ionenkanälen bereitstellen .

Einleitung

Strömung ist eine wichtige ökologische Cue, die vielen physiologische und pathologische Prozessen wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation und Flüssigkeit Scherkräfte Kraft-abhängige Gefäße Umgestaltung und Entwicklung1,2steuert, 3,4,5. Obwohl die molekularen Mechanismen für die biologischen Reaktionen auf Flüssigkeitsströmung Querkraft nicht vollständig verstanden sind, wird angenommen, dass Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating kritisch zur Fluid strömungsinduzierte Antworten

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Protokoll

Alle Versuche wurden nach den institutionellen Vorgaben der Konkuk Universität durchgeführt.

(1) Agarose Salz Brücken zwischen dem Bad-Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode

Hinweis: Agarose 3M KCl Salz Brücken wie zuvor entstehen beschrieben12 mit geringfügigen Änderungen.

  1. Bildung von Brücken
    1. Beugen Sie Feuer Glas-Kapillarröhrchen um eine U-Form entsprechend bilden. Der Innendurchmesser der Kapillaren sollte groß genug für die Verringerung der Serienwiderstand beim großen Ionen-Strömungen aufnehmen. Rohre mit einem Innendurchmesser von 2-5 mm sind in der Regel akzeptabel.<....

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Ergebnisse

Ganze Zelle spannungsabhängige L-Typ Ca2 + -Kanal (VDCCL) Strömungen verzeichneten die enzymatisch verteilten Ratten mesenterialen arteriellen Myozyten, wie oben beschrieben11. Die arteriellen Myozyten wurden mit einer Cs-reiche Pipette Lösung unter der Nystatin-perforierten Konfiguration mit zweiwertigen kationen frei Baden Lösung zur Erleichterung des Stromfluss durch VDCCL11,16.......

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Diskussion

In dieser Studie haben wir eine Methode, um echte Cl -Konzentration in der ungerührte Schicht angrenzend an die Ag/AgCl-Referenzelektrode messen durch die Bestimmung der potentiellen Flüssigmetall-Kreuzung mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette gefüllt mit einem hohen KCl gezeigt. Konzentration. Die Veränderung der Cl -Konzentration in der Grenzschicht führt zu einer Verschiebung der Kreuzung Potenzial beim Wechsel von statischen zu Flüssigkeit Strömungsverhältnisse. Einfach mit einer Agarose KCl B.......

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch den Pionier Research Center Program (2011-0027921), von Basic Science Research Programme (2015R1C1A1A02036887 und NRF-2016R1A2B4014795 durch die National Research Foundation of Korea gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT) unterstützt. & Zukunft planen, und durch einen Zuschuss der Korea Health Technology R & D Projekt durch Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziert durch das Ministerium für Gesundheit & Wohlbefinden, Republik Korea (HI15C1540).

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RC-11 offene BadkammerWarner instruments, USAW4 64-0307
Ag/AgCl ElektrodenpelletWorld Precision Instruments, USAEP1
AgaroseSigma-aldrich, USAA9793
Voltage-Clamp-VerstärkerHEKA, DeutschlandEPC8
Voltage-Clamp-VerstärkerMolecular Devices, USAAxopatch 200B
FlüssigkeitspumpeKNF Flodos, SchweizFEM08

Referenzen

  1. Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
  2. Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation ....

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Schlagwörter

Messung der IonenkonzentrationRegulierung des Fl ssigkeitsstromsGating von Ionenkan lenVerschiebung des KontaktpotenzialsAgarose Salzbr ckeFl ssigmetall KontaktpotenzialVDCC L Str meKerr 2 1 Str me

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