Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen

Zusammenfassung

Mechanosensitive Ionenkanäle sind oft in Bezug auf Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit mit Patch-Clamp-Aufnahme untersucht. Allerdings kann je nach experimentellen Protokoll, das Ergebnis auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen fehlerhaft sein. Hier bieten wir Methoden zur Vermeidung und Korrektur solcher Fehler mit einer theoretischen Grundlage.

Zusammenfassung

Strömung ist ein wichtiger ökologischer Impuls, der viele physiologische und pathologische Prozesse, wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation steuert. Obwohl die molekularen Mechanismen der biologischen Reaktionen auf Fluid Flow/Querkraft nicht vollständig verstanden sind, kann kritisch Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating beitragen. Daher wurde Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit Ionenkanäle mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Jedoch können abhängig von den experimentellen Protokoll die Ergebnisse und Interpretation der Daten fehlerhaft sein. Hier präsentieren wir experimentelle und theoretische Belege für Fluid Flow-bezogene Fehler und Methoden für die Schätzung, Vorbeugung und Korrektur dieser Fehler bereitzustellen. Veränderungen der Kreuzung Potenzial zwischen Ag/AgCl-Referenzelektrode und Baden Flüssigkeit wurden gemessen mit einer offenen Pipette gefüllt mit 3 M KCl. Strömung konnte dann die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial für ca. 7 mV zu verlagern. Im Gegensatz dazu durch die Messung der Spannung-Verschiebung durch Strömung induzierte, schätzten wir die Ionenkonzentration in der ungerührte Grenzschicht. Im statischen Zustand erreichen die echte Ionenkonzentrationen angrenzend an den Ag/AgCl Referenz Elektrode oder Ionen-Kanal Einlass an der Zellmembran Oberfläche so niedrig wie etwa 30 % davon in den Flow-Zustand. Platzieren einer Agarose 3 M kann KCl-Brücke zwischen der Baden-Flüssigkeit und Referenz-Elektrode dieses Problem der Kreuzung mögliche Verschiebung verhindert. Das ungerührte Ebeneneffekt angrenzend an der Oberfläche der Zellmembran konnten jedoch nicht auf diese Weise gelöst werden. Hier bieten wir eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette, betonend, wie wichtig es ist, mit einer Agarose Salz-Brücke während des Studiums Fluid strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Daher kann dieser neuartige Ansatz, unter Berücksichtigung der realen Konzentrationen von Ionen in der ungerührte Grenzschicht, nützlichen Einblick auf die experimentelle Gestaltung und Interpretation der Daten im Zusammenhang mit Fluid Schubspannung Regulierung von Ionenkanälen bereitstellen .

Einleitung

Strömung ist eine wichtige ökologische Cue, die vielen physiologische und pathologische Prozessen wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation und Flüssigkeit Scherkräfte Kraft-abhängige Gefäße Umgestaltung und Entwicklung^{1,2steuert, 3,4,5}. Obwohl die molekularen Mechanismen für die biologischen Reaktionen auf Flüssigkeitsströmung Querkraft nicht vollständig verstanden sind, wird angenommen, dass Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating kritisch zur Fluid strömungsinduzierte Antworten

Protokoll

Alle Versuche wurden nach den institutionellen Vorgaben der Konkuk Universität durchgeführt.

(1) Agarose Salz Brücken zwischen dem Bad-Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode

Hinweis: Agarose 3M KCl Salz Brücken wie zuvor entstehen beschrieben¹² mit geringfügigen Änderungen.

1. Bildung von Brücken
   1. Beugen Sie Feuer Glas-Kapillarröhrchen um eine U-Form entsprechend bilden. Der Innendurchmesser der Kapillaren sollte groß genug für die Verringerung der Serienwiderstand beim großen Ionen-Strömungen aufnehmen. Rohre mit einem Innendurchmesser von 2-5 mm sind in der Regel akzeptabel.<....

Ergebnisse

Ganze Zelle spannungsabhängige L-Typ Ca^{2 +} -Kanal (VDCC_L) Strömungen verzeichneten die enzymatisch verteilten Ratten mesenterialen arteriellen Myozyten, wie oben beschrieben¹¹. Die arteriellen Myozyten wurden mit einer Cs-reiche Pipette Lösung unter der Nystatin-perforierten Konfiguration mit zweiwertigen kationen frei Baden Lösung zur Erleichterung des Stromfluss durch VDCC_L^11,16.......

Diskussion

In dieser Studie haben wir eine Methode, um echte Cl^– -Konzentration in der ungerührte Schicht angrenzend an die Ag/AgCl-Referenzelektrode messen durch die Bestimmung der potentiellen Flüssigmetall-Kreuzung mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette gefüllt mit einem hohen KCl gezeigt. Konzentration. Die Veränderung der Cl^– -Konzentration in der Grenzschicht führt zu einer Verschiebung der Kreuzung Potenzial beim Wechsel von statischen zu Flüssigkeit Strömungsverhältnisse. Einfach mit einer Agarose KCl B.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RC-11 offene Badkammer	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl Elektrodenpellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Voltage-Clamp-Verstärker	HEKA, Deutschland	EPC8
Voltage-Clamp-Verstärker	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
Flüssigkeitspumpe	KNF Flodos, Schweiz	FEM08