Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen

Zusammenfassung

Mechanosensitive Ionenkanäle sind oft in Bezug auf Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit mit Patch-Clamp-Aufnahme untersucht. Allerdings kann je nach experimentellen Protokoll, das Ergebnis auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen fehlerhaft sein. Hier bieten wir Methoden zur Vermeidung und Korrektur solcher Fehler mit einer theoretischen Grundlage.

Zusammenfassung

Strömung ist ein wichtiger ökologischer Impuls, der viele physiologische und pathologische Prozesse, wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation steuert. Obwohl die molekularen Mechanismen der biologischen Reaktionen auf Fluid Flow/Querkraft nicht vollständig verstanden sind, kann kritisch Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating beitragen. Daher wurde Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit Ionenkanäle mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Jedoch können abhängig von den experimentellen Protokoll die Ergebnisse und Interpretation der Daten fehlerhaft sein. Hier präsentieren wir experimentelle und theoretische Belege für Fluid Flow-bezogene Fehler und Methoden für die Schätzung, Vorbeugung und Korrektur dieser Fehler bereitzustellen. Veränderungen der Kreuzung Potenzial zwischen Ag/AgCl-Referenzelektrode und Baden Flüssigkeit wurden gemessen mit einer offenen Pipette gefüllt mit 3 M KCl. Strömung konnte dann die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial für ca. 7 mV zu verlagern. Im Gegensatz dazu durch die Messung der Spannung-Verschiebung durch Strömung induzierte, schätzten wir die Ionenkonzentration in der ungerührte Grenzschicht. Im statischen Zustand erreichen die echte Ionenkonzentrationen angrenzend an den Ag/AgCl Referenz Elektrode oder Ionen-Kanal Einlass an der Zellmembran Oberfläche so niedrig wie etwa 30 % davon in den Flow-Zustand. Platzieren einer Agarose 3 M kann KCl-Brücke zwischen der Baden-Flüssigkeit und Referenz-Elektrode dieses Problem der Kreuzung mögliche Verschiebung verhindert. Das ungerührte Ebeneneffekt angrenzend an der Oberfläche der Zellmembran konnten jedoch nicht auf diese Weise gelöst werden. Hier bieten wir eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette, betonend, wie wichtig es ist, mit einer Agarose Salz-Brücke während des Studiums Fluid strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Daher kann dieser neuartige Ansatz, unter Berücksichtigung der realen Konzentrationen von Ionen in der ungerührte Grenzschicht, nützlichen Einblick auf die experimentelle Gestaltung und Interpretation der Daten im Zusammenhang mit Fluid Schubspannung Regulierung von Ionenkanälen bereitstellen .

Einleitung

Strömung ist eine wichtige ökologische Cue, die vielen physiologische und pathologische Prozessen wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation und Flüssigkeit Scherkräfte Kraft-abhängige Gefäße Umgestaltung und Entwicklung^{1,2steuert, 3,4,5}. Obwohl die molekularen Mechanismen für die biologischen Reaktionen auf Flüssigkeitsströmung Querkraft nicht vollständig verstanden sind, wird angenommen, dass Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating kritisch zur Fluid strömungsinduzierte Antworten⁵ beitragen können ^{, 6 , 7 , 8}. Z. B. Aktivierung von Endothelzellen nach innen Gleichrichter Kir2.1 und Ca^{2 +}-aktivierte K⁺ (K_Ca2,3, KCNN3) Kanäle nach Ca^{2 +} Zustrom von Flüssigkeitsströmung vorgeschlagen worden ist, beizutragen zur Flüssigkeit strömungsinduzierte Vasodilatation^6,7,8. Daher viele Ionenkanäle, vor allem mechanisch aktiviert oder -gehemmte Kanäle wurden untersucht im Hinblick auf die Kraftempfindlichkeit Fluid Flow/Scherung mit der Patch-Clamp Technik^{6,9,10 , 11}. abhängig vom experimentellen Protokoll während Patch-Clamp-Aufnahme durchgeführt, Ergebnisse und Interpretation der Daten auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen können jedoch fehlerhafte^10,11.

Eine Quelle der Flüssigkeit strömungsinduzierte Artefakte in der Patch-Clamp-Aufnahme ist aus der Kreuzung zwischen der Badflüssigkeit und Ag/AgCl Referenz-Elektrode¹¹möglichen. Es wird allgemein angenommen, dass die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl Elektroden konstant ist wie die Cl^– -Konzentration der Flüssigkeit Baden konstant gehalten, ist unter Berücksichtigung der chemischen Reaktion zwischen der Baden-Lösung und Ag/AgCl-Elektrode zu werden:

AG + Cl^–↔ AgCl + Elektron (e^–) (Gleichung 1)

Jedoch in einem Fall, wo die insgesamt elektrochemische Reaktion zwischen dem Baden Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode (Gleichung 1) von links nach rechts verläuft, verweisen die Cl^– -Konzentration der Baden Flüssigkeit neben der Ag/AgCl Elektrode (ungerührte Grenzschicht^12,13,14,15) möglicherweise viel geringer als die in der Masse der Lösung, Baden, sofern genügend Konvektion Transport gewährleistet ist. Mit einer alten oder nicht-ideale Ag/AgCl-Elektrode mit unzureichenden Chlorierung der Ag kann dieses Risiko erhöhen. Dieses Fluid Flow-bezogene Artefakt an der Referenzelektrode, in der Tat kann ausgeschlossen werden, indem Sie einfach eine herkömmliche Agarose-Salz-Brücke zwischen Baden Fluid und Referenz Elektrode, da das Artefakt auf Veränderungen im realen Cl^– Angrenzend an die Ag/AgCl-Elektrode¹¹Konzentration. Das Protokoll in dieser Studie vorgestellt beschreibt die verhindern, dass die Junction Flow-im Zusammenhang mit möglichen Änderungen und echte Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht zu messen.

Nach dem Platzieren einer Agarose KCl-Brücke zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode, ist ein weiterer entscheidender Faktor, der berücksichtigt werden sollte: nur als Referenz Ag/AgCl-Elektrode wirkt wie ein Cl^– -Elektrode, die Ionenkanäle auch funktionieren können wie eine ionenselektive Elektrode. Die Situation der eine ungerührte Grenzschicht zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode entsteht während der Bewegung der Ionen zwischen den extrazellulären und intrazellulären Lösungen durch die Membran-Ionenkanäle. Dies impliziert, dass Vorsicht bei Auslegung der Verordnung von Ionen durch Flüssigkeitsströmung Kanäle verwendet werden soll. Wie in unserer vorherigen Studie¹¹besprochen, die Bewegung von Ionen durch eine Lösung, in denen eine elektrochemische Steigung vorliegt, kann auftreten, über drei verschiedene Mechanismen: Diffusion, Migration und Konvektion, wo Diffusion die Bewegung ist induziert durch Konzentrationsgradienten, Migration ist die Bewegung von elektrischen Gradienten angetrieben und Konvektion ist die Bewegung durch Fluid-Flow. Unter diesen drei Transportmechanismen trägt Konvektion-Modus die meisten um die Bewegung von Ionen¹¹ (> 1.000 Mal größer als Diffusion oder Migration unter üblichen Patch-Clamp-Einstellungen). Dies bildet die theoretische Basis warum Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl-Referenzelektrode sehr unter verschiedenen statischen und Fluid-Flow Bedingungen¹¹kann.

Gemäß der Hypothese oben vorgeschlagen, einige facilitatory Effekte der Strömung auf die aktuellen Ionenkanal können entnommen werden die konvektive Wiederherstellung der realen Ionenkonzentrationen angrenzend an die Kanal-Einlass an der Membranoberfläche (ungerührte Grenzschicht) ¹⁰. In diesem Fall die strömungsinduzierte Effekte von Flüssigkeiten auf Ionen-Kanal Strömungen entstanden einfach aus elektrochemischen Ereignisse nicht von der Regelung der Ionen-Kanal gating. Eine ähnliche Idee wurde zuvor von Barry und Kollegen^12,13,14,15 basierend auf strengen theoretischen Überlegungen und experimentelle Beweise, auch bekannt als die ungerührte Schicht vorgeschlagen oder Transport-Nummer-Effekt. Wenn einige Ionenkanäle genügend auftreten Einkanal-Leitfähigkeit und lange genug offene Zeit, ausreichend Transport Preise durch die Kanäle (Transport schneller in der Membran als in der ungerührte Membranoberfläche), einen Grenzschicht-Effekt zur Verfügung zu . So kann die Konvektion-abhängige Transport zum eventuellen Flüssigkeit-strömungsinduzierte Erleichterungen von Ionen-aktuelle^{10,12,13,14,15}beitragen.

In dieser Studie betonen wir, wie wichtig es ist, mit einem Agar oder Agarose Salz-Brücke während des Studiums Flüssigkeit-strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Wir bieten auch eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht angrenzend an die Ag/AgCl Referenz-Elektrode und Membran Ionenkanäle. Darüber hinaus bieten die theoretische Interpretation der Flüssigkeit strömungsinduzierte Modulation der Ionen-Kanal Ströme (z. B. Konvektion Hypothese oder ungerührte Transport Nummer Ebeneneffekt) wertvolle Erkenntnisse für die Gestaltung und Interpretation von Studien auf die Scherung Kraftregelung von Ionenkanälen. Nach dem ungerührte Grenzschicht Transport Nummer Effekt sagen wir voraus, dass Ionen-Kanal Ströme durch alle Arten von Ionenkanälen Membran durch Flüssigkeitsströmung, unabhängig von ihrer biologischen Empfindlichkeit gegenüber Flüssigkeitsströmung Querkraft, aber nur wenn gefördert werden kann die Ionenkanäle haben ausreichende Einkanal-Leitfähigkeit und lange offene Zeit. Höheren Stromdichten der Ionen-Kanal kann die ungerührte Grenzschicht Wirkung an der Oberfläche der Zellmembran erhöhen.

Protokoll

Alle Versuche wurden nach den institutionellen Vorgaben der Konkuk Universität durchgeführt.

(1) Agarose Salz Brücken zwischen dem Bad-Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode

Hinweis: Agarose 3M KCl Salz Brücken wie zuvor entstehen beschrieben¹² mit geringfügigen Änderungen.

1. Bildung von Brücken
   1. Beugen Sie Feuer Glas-Kapillarröhrchen um eine U-Form entsprechend bilden. Der Innendurchmesser der Kapillaren sollte groß genug für die Verringerung der Serienwiderstand beim großen Ionen-Strömungen aufnehmen. Rohre mit einem Innendurchmesser von 2-5 mm sind in der Regel akzeptabel.
2. Vorbereitung der Agarose 3 M KCl-Lösung
   1. Bereiten Sie 100 mL 3 M KCl-Lösung (1 M oder 2 M ist auch akzeptabel).
   2. Wiegen Sie 3 g Agarose.
   3. Lösen der Agarose in 100 mL KCl (d. h. 3 % Agarose) auf einer heißen Platte zwischen 90 und 100 ° C.
3. Laden die Brücken mit 3 M KCl agarose
   1. Zum einfachen beladen, Tauchen Sie die u-förmige Glasbrücken in der Agarose-KCl-Lösung.
      Hinweis: Es ist leicht zu graben, die gläserne Brücken, wenn die Agarose-KCl-Lösung in einem flachen und breiten Container enthalten ist.
   2. Halten Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur (RT) für die Agarose zu setzen und zu härten.
   3. Sorgfältig die Agarose-KCl-geladen Glasbrücken aus dem Satz/gehärtet Agarose-Salz auszugraben.
4. Speicherung der Brücken
   1. Bereiten Sie genügend Volumen (z.B. 500 mL) der 3 M KCl-Lösung in einer weiten-necked Flasche.
   2. Die vorbereiteten Agarose-Salz-Brücken in der Flasche im Kühlschrank aufbewahren.

2. Anwendung der Flüssigkeitsströmung Querkraft auf Zellen in einer Patch-Klemmung Kammer

Hinweis: Ein schematisches Diagramm der Patch-Clamp-Versuchsanordnung ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Ort ein Container beladen Bade-Lösung (Volumen und Höhe sollte bereits gemessen werden) über die Patch-Clamp-Kammer.
2. Füllen Sie die Patch-Clamp-Kammer mit der Baden-Lösung durch Absaugen der Röhre.
3. Um die Strömung zu stoppen, clip das Rohr seitlich des Containers, die Strömung zu blockieren, dann clip den Schlauch auf der Saugseite, das Saugen zur gleichen Zeit zu stoppen. Dies ist der "stationären" Kontrollbedingung.
4. Um Flüssigkeitsströmung Querkraft anzuwenden, öffnen Sie beide Rohre an den Container und Absaugung Seiten zur gleichen Zeit.
5. Vor oder nach der Anwendung die Flüssigkeitsströmung Scherkraft auf die Zelle, die Durchflussmenge in mL/min messen.
6. Den Durchfluss durch die Messung des Rückgang Flüssigkeitsvolumen über einen bestimmten Zeitraum zu berechnen.
7. Aus dem gemessenen Volumenstrom und Geometrie (Struktur) der Kammer Baden sollte die Scherkraft, die von der Strömung auf die Zelle angewendet (siehe Diskussion) geschätzt werden.
8. Alternativ zur Steuerung der Durchflussmenge (für Schritte 2,3-2,6) verwenden Sie eine Perfusion Pumpe. In diesem Fall achten Sie, eine konstante, anstatt eine pulsierende Strömung.

3. Messung der Veränderungen der Flüssigmetall-Junction-Potenzial durch Strömung zwischen Bad-Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode (Abbildung 3A)

1. Verwenden Sie die Ag/AgCl-Elektrode oder Pellets, die von der Fertigprodukte, ohne die Agarose Salzbrücke erhältlich ist.
2. Bereiten Sie eine normale physiologische Salz Kochsalzlösung für die Baden-Kammer (z.B., 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH₂PO₄, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 11 mM D-Glucose, pH 7.4 mit NaOH angepasst).
3. Legen Sie eine Patch-Pipette mit einer 3 M KCl-Lösung in der Kammer, die Kreuzung Potenzialverschiebung zwischen der Pipette und Baden Lösungen zu minimieren.
4. Beheben den Voltage-Clamp-Verstärker in den aktuellen Klemme-Modus ("ich = 0" oder "CC").
5. Messen Sie nach zunichte macht das erste Offset Potenzial Änderungen in der Spannung induziert durch verschiedene Durchflussmengen.
6. Erneut prüfen Sie, um sicherzustellen, dass die Änderungen in der Spannung Flüssigmetall/Kreuzung Potentiale sind, die Wirkung der Strömung auf die Kreuzung Potenzial über die Agarose-Salz-Brücke zwischen dem Bad-Lösung und Ag/AgCl-Elektrode.

4. experimentelle Abschätzung der Real Cl^– -Konzentration in der ungerührte Schicht neben Ag/AgCl-Elektrode unter statischen Zustand (Abb. 3 b)

1. Zeichnen Sie aus den Ergebnissen von Schritt 3 die Kreuzung Potenzial-Durchfluss-Beziehungen und schätzen Sie den Wert der maximalen (Sättigung) der Kreuzung Potenzialverschiebung durch die supra-Fluid Flow Rate.
2. Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen von Cl (d.h., 50, 99, 147, 195 und 288 mM NaCl).
3. Zeichnen Sie durch eine Änderung der Cl^– -Konzentration in der Flüssigkeit Baden die Kreuzung Potential-[Cl^–] Beziehung. Beachten Sie, dass die flüssige Rate konstant und hoch genug sein sollte (> 30 mL / min), die Abnahme der Konzentration der Cl^– mit derjenigen der angrenzenden Ag/AgCl-Referenzelektrode zu verhindern.
4. Schätzen Sie aus den beiden Beziehung Kurven die Konzentrationsänderungen Cl^– aus der gemessenen Kreuzung Potenzialverschiebung.

Ergebnisse

Ganze Zelle spannungsabhängige L-Typ Ca^{2 +} -Kanal (VDCC_L) Strömungen verzeichneten die enzymatisch verteilten Ratten mesenterialen arteriellen Myozyten, wie oben beschrieben¹¹. Die arteriellen Myozyten wurden mit einer Cs-reiche Pipette Lösung unter der Nystatin-perforierten Konfiguration mit zweiwertigen kationen frei Baden Lösung zur Erleichterung des Stromfluss durch VDCC_L^11,16...

Diskussion

In dieser Studie haben wir eine Methode, um echte Cl^– -Konzentration in der ungerührte Schicht angrenzend an die Ag/AgCl-Referenzelektrode messen durch die Bestimmung der potentiellen Flüssigmetall-Kreuzung mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette gefüllt mit einem hohen KCl gezeigt. Konzentration. Die Veränderung der Cl^– -Konzentration in der Grenzschicht führt zu einer Verschiebung der Kreuzung Potenzial beim Wechsel von statischen zu Flüssigkeit Strömungsverhältnisse. Einfach mit einer Agarose KCl B...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RC-11 offene Badkammer	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl Elektrodenpellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Voltage-Clamp-Verstärker	HEKA, Deutschland	EPC8
Voltage-Clamp-Verstärker	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
Flüssigkeitspumpe	KNF Flodos, Schweiz	FEM08